目的:构建近红外荧光探针修饰的铁蛋白纳米颗粒,研究其作为体内成像系统的安全性以及在小鼠体内的生物分布情况和对肿瘤组织的靶向性。方法:通过在铁蛋白(ferritin)表面人工设计半胱氨酸点突变,通过半胱氨酸巯基和含有马来酰亚胺(maleimide)的Dy731近红外荧光探针分子进行巯基偶联,对铁蛋白纳米颗粒表面进行功能化修饰,使荧光探针以共价的形式结合在蛋白纳米颗粒的表面;将近红外荧光探针修饰过的铁蛋白纳米颗粒(Dy731-Ft)与5% w/v琼脂糖溶液混合冷却后制成凝胶,置于小鼠皮下和腹腔肌肉壁下,检测蛋白纳米颗粒穿透皮肤和肌肉组织的能力;将Dy731-Ft蛋白纳米颗粒通过尾静脉对小鼠进行活体注射,观察小鼠是否产生急性不良反应,检测近红外荧光强度以观察Dy731-Ft作为体内成像系统在小鼠体内的分布情况;构建U87-MG肿瘤异种移植动物模型,进行尾静脉注射验证Dy731-Ft在荷瘤小鼠组织器官内的分布和对于肿瘤组织的靶向性。结果:通过动物实验表明,小鼠体内注射铁蛋白纳米颗粒和显像期间及之后均未见急性不良反应,说明铁蛋白纳米颗粒具有良好的生物相容性,进入体内主要在肝脏积累。结论:近红外Dy731-Ft蛋白纳米颗粒能够靶向U87-MG肿瘤组织,推测其在肿瘤组织内的积累可能与转铁蛋白受体1(transferrin receptor 1,TfR-1)介导的细胞内吞作用和肿瘤组织增强渗透性以及滞留效应(enhanced permeability and retention effect,EPR)的协同作用相关。
目的:鉴定解脂耶氏酵母中Anillin家族蛋白,探究其对Septin细胞骨架组织的调控功能。方法:将模式生物酿酒酵母Anillin家族蛋白Bud4序列在解脂耶氏酵母数据库中比对,找到潜在的Anillin家族蛋白;从解脂耶氏酵母基因组中扩增其序列,将其与绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合表达,通过荧光显微镜观察其胞内定位;对酿酒酵母细胞中潜在的Anillin家族蛋白进行过量表达,观察其对细胞形态和Septin组织的影响,从而确定其调控Septin组织的功能。结果:通过解脂耶氏酵母数据库中序列比对,找到两个潜在的Anillin家族蛋白,分别将其命名为YlBud4A(数据库中蛋白编号YALI0D11880)和YlBud4B(数据库中蛋白编号YALI0B07623),其C端与该家族蛋白成员同源性高,含有保守的DUF1709和PH结构域;与酿酒酵母Bud4类似,YlBud4B可以定位在芽颈,在芽体较大细胞中呈明显的双环结构,而YlBud4A没有芽颈定位;在酿酒酵母细胞中过量表达YlBud4B导致细胞产生显著的芽体变长细胞形态,Septin的正常组织被破坏,在变长的芽体中呈圆形结构。结论:解脂耶氏酵母YlBud4B与Anillin家族蛋白在序列和功能上都具有同源性,其可以与Septin细胞骨架相互作用,在调控Septin组织过程中发挥功能。
目的:通过NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库筛选可以应用于洗涤工业的蛋白酶,使用地衣芽孢杆菌进行高效表达。方法:利用同源重组的方式将蛋白酶基因整合到地衣芽孢杆菌基因组中,研究重组蛋白酶的酶学特性和洗涤效果。结果:该重组酶的最适作用温度为60℃,最适pH为11.0;AH-101具有良好的耐热性,可以在20~55℃范围内保持稳定,在60℃保温1 h,剩余活性仍高于30%;此外,该酶与表面活性剂和液体洗涤剂具有良好的兼容性,在终浓度为0.1%和0.5%的表面活性剂和液体洗涤剂中孵育2 h,重组酶的酶活力损失小于30%。结论:成功构建了一株含有外源蛋白酶的地衣芽孢杆菌重组菌株,对重组蛋白酶的特性和洗涤效果进行研究,该重组蛋白酶可以作为环保型酶制剂应用到洗涤工业中。
目的:对肾脏损伤指标蛋白人α1-微球蛋白(alpha 1-microglobulin,A1M)的巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)发酵与纯化工艺进行优化,实现高纯度、高亲和性重组A1M的克级制备。方法:利用1 L摇瓶培养体系单因素实验优化A1M发酵最适pH,随后进行5 L规模化高密度发酵,优化关键补料点及发酵时间;根据A1M抗原特性建立蛋白纯化工艺并进行N-糖基化鉴定和纯度鉴定;制备A1M免疫亲和柱并进行载量评估。结果:重组人A1M毕赤酵母摇瓶发酵最适初始pH 6.0,1 L摇瓶培养体系中表达水平达888 mg/L,且糖基化程度相对最低;5 L规模发酵的48~120 h采用溶氧(dissolved oxygen,DO)≥30%反向关联甲醇补料4~6 mL/(h·L),可有效控制DO核心区>20%;发酵48、72和96 h为关键补料点,表达水平为12.5 g/L,发酵58~78 h时空收率可达160~210 mg/(h·L),5 L罐发酵120 h批量达49 g;选用超滤浓缩、阳离子交换层析和脱盐层析柱建立A1M纯化工艺,总收率为18%;A1M抗原亲和柱偶联率达96%,偶联密度为2.46 mg/mL,对A1M绵羊多抗的载量为37 mg/mL。结论:成功建立重组人A1M抗原5 L规模的酵母发酵及纯化工艺,实现高纯度并具有免疫亲和力的A1M抗原的克级制备。
目的:建立一种可以在基层医疗机构使用的超快速恙虫病东方体(Orientia tsutsugamushi,Ot)核酸检测方法。方法:利用实时荧光定量PCR技术(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR),通过比对分析数据库中恙虫病东方体全基因组序列确定靶基因,设计qPCR特异性引物和探针,优化反应体系和反应程序,建立超快速多重qPCR检测方法;利用经过数字PCR(droplet digital PCR,ddPCR)定量后的样本核酸作为标准物质,评价该方法的灵敏度、重复性以及最低检出限;通过比较基因组学分析,验证恙虫病东方体与同科属的易引起类似症状的病原体的特异性,通过检测24种(共45例)易引起类似症状的其他病原体核酸评价特异性;利用116例来源于云南省红河州金平县人民医院和复旦大学附属华山医院的临床全血样本,通过四格表卡方检验对多重qPCR超快速检测方法和传统qPCR检测方法的检测结果进行比较,采用Kappa一致性检验分析方法间的一致性。结果:恙虫病东方体与同科属的易引起类似症状的病原体的同源性较低,与常见的易引起类似症状的24种病原体无交叉反应,具有很好的特异性;最低检出限为156 copies/mL;具有很好的重复性,检测Ct值的变异系数≤3.13%;多重qPCR超快速检测方法和传统qPCR检测方法同时检测116例临床全血样本,检测结果的差异无统计学意义(P>0.05),两种方法具有很高的一致性(Kappa=0.939 2,P<0.001),总符合率97.42%(CI:92.67%~99.12%),检测时间可缩短至30 min。结论:建立的多重qPCR超快速检测方法具有良好的灵敏度、重复性和特异性,可以快速诊断临床全血样本中的恙虫病东方体核酸,在基层医疗机构实现及时快速诊疗。
小细胞外囊泡(small extracellular vesicles,sEVs)是一类具有脂质双层膜结构的细胞外囊泡,能够参与细胞间通讯,是一种良好的药物递送载体。小细胞外囊泡中的微小RNA(miRNA)、长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、环状RNA(circRNA)和蛋白质等多种成分参与调控肿瘤发生发展的重要机制,能够反映细胞的生理状态与功能状态,且大量存在于患者的血浆、尿液、唾液中,对小细胞外囊泡进行分析和检测可能成为肿瘤诊断的新型手段。除了作为肿瘤诊断的生物标志物,小细胞外囊泡还通过其内容物或作为特异性药物递送载体来调控肿瘤细胞的侵袭转移、机体耐药、细胞因子分泌表达与免疫应答,发挥其抗肿瘤作用。总结近五年来小细胞外囊泡中RNA(miRNA、lncRNA、circRNA)与蛋白质作为乳腺癌诊断的生物标志物以及在乳腺癌治疗中的潜力的相关研究,阐述小细胞外囊泡作为新型诊断与治疗方法的优势与不足,为小细胞外囊泡在乳腺癌诊疗领域的临床应用提供参考。
肺纤维化是一种由肺泡外基质蛋白过度沉积导致的肺部不可逆的结构和功能改变的肺部疾病,表现为纤维化重构和肺泡破坏。外泌体作为一种细胞外囊泡,可通过递送特定细胞类型产生的功能性核酸和蛋白质来介导细胞间通讯。近年来的研究发现,外泌体在肺纤维化的诊断和治疗中具有重要作用,被认为是一种潜在的生物治疗方法和药物递送载体。研究外泌体在肺纤维化发生发展中的作用,以期为肺纤维化的外泌体治疗研究提供新的思路。
水凝胶因其能够保持湿润的伤口环境、模仿细胞外基质、封装和输送药物及纳米颗粒并减轻伤口疼痛的特性,被广泛应用于皮肤创面的治疗。然而,传统水凝胶的抗菌和抗炎能力有限,对于高度炎症或微生物污染的伤口(如糖尿病性创伤和严重感染)的治疗效果欠佳。近年来,研究人员开始探索将MXene纳米材料与水凝胶结合应用于创面治疗。MXene是一种二维层状纳米材料,因其卓越的抗菌、抗炎、抗氧化、药物输送和导电性能而广泛被应用于皮肤创面治疗。MXene与水凝胶结合可以有效控制创面感染、清除活性氧并加速创面组织的再生。综述MXene水凝胶在创面愈合方面的最新研究进展,探讨所面临的挑战和未来发展前景。
维生素B6(vitamin B6,VB6)属于水溶性维生素,由六种可相互转换的吡啶类化合物组成:吡哆醇(pyridoxine,PN)、吡哆醛(pyridoxal,PL)、吡哆胺(pyridoxamine,PM)、磷酸吡哆醛(pyridoxal 5'-phosphate,PLP)、磷酸吡哆醇(pyridoxine 5'-phosphate,PNP)和磷酸吡哆胺(pyridoxamine 5'-phosphate,PMP)。其中,PLP是VB6的生物活性形式,为180多种酶的辅因子。VB6具有抗炎、抗氧化、神经调节和抗肿瘤等多种生理功能,是重要的营养化学品。吡哆醇盐酸盐(PN·HCl)利用昂贵且有毒的化学物质通过噁唑法完全合成,是VB6目前最常见的商业形式。与化学合成相比,VB6的生物合成在无毒性、高纯度和可持续性等方面具有显著优势。目前利用微生物细胞工厂高水平生产VB6的尝试还处于起步阶段,随着对VB6生物合成的代谢途径、关键酶和稳态调控的深入研究,生物合成的VB6产量将会逐步提高,有望从根本上取代化学合成。对VB6的生理功能、化学合成和生物合成进行总结,重点介绍生物合成中涉及的代谢途径与稳态调控,提出开发VB6高产菌株的相关策略,以期为VB6的高效生物合成提供参考。
盐藻因具备低成本、易培养、便于转基因操作、可调控的转录和翻译等优点,已成为基因工程领域备受关注的新型表达系统。但盐藻表达系统存在低表达和不稳定遗传等技术瓶颈,严重限制了其应用。CRISPR/Cas系统凭借高稳定性、高靶点特异性、可编程性等优点,可作为助推盐藻表达系统改进和应用的重要工具,从而大幅提高盐藻表达系统重组蛋白、脂质积累和胡萝卜素等高附加值产物的产量。由于盐藻兼具原核细胞和真核细胞的双重特点,基因编辑存在较大的难度和限制性,因而必须不断提高基因编辑技术在盐藻中的精确性和编辑效率,以确保目标基因得到准确修饰。探讨盐藻表达系统的基因工程研究现状,包括盐藻转化方法、外源基因的表达和基因编辑的研究现状等,分析CRISPR/Cas编辑技术在盐藻中面临的主要挑战,提出未来的发展方向和增效策略,以期加速盐藻表达系统的成熟和应用。
植物甾醇是一类以环戊烷多氢菲为骨架的天然化合物,广泛存在于玉米油等植物性食品中。作为一种新型的食品添加剂,植物甾醇已被广泛应用于各种食品中,如低脂饮料、奶制品、面包等。植物甾醇还具有降低人体血清胆固醇、消炎、抗氧化等作用。植物甾醇自身的理化性质,如油溶性低、熔点高、生物利用度低等,极大地降低了其应用效果。利用各类生物催化剂对甾醇骨架或侧链进行修饰改性,可显著提高其应用效果;利用各种微生物全细胞转化植物甾醇,将显著增加其附加值。重点介绍了当前酶法改善甾醇的油溶性、水溶性和抗氧化性等性能,综述利用微生物全细胞转化植物甾醇、合成甾醇侧链被氧化或母核羟基化的各种甾醇衍生物(甾醇药物中间体)的研究进展及其存在的问题,展望植物甾醇(酯)未来的发展趋势,为植物甾醇的深入研究提供参考。
在全球气候变化问题日益严重、新冠肺炎疫情后倡导“绿色复苏”的形势下,为应对粮食安全等社会挑战,生物科技驱动的农业研究逐渐成为全球农业的发展重点。生物育种、农用生物制剂以及未来食品作为全球生物农业的主要研究领域,在粮食安全、环境保护、营养健康等方面扮演着重要角色。通过文献调研和计量学研究方法,分析了2013-2022年全球生物农业的政策规划、研发态势以及资本市场的现状和发展趋势。结果表明,全球生物农业发展势头良好,世界各国纷纷加快布局。目前,生物育种是全球生物农业发展的重点领域,未来食品是发展的重要增长点。从总体来看,中美两国在生物农业发展中处于全球领先地位。牢牢把握农业生产变革的机遇,对提升我国农业发展竞争力,保障粮食安全,实现我国双碳目标等都具有重要意义。
