目的: MDCK-STAT1-KO工程细胞已被证实可高效生产H1N1流感病毒,但受限于培养规模和血清依赖性等贴壁培养固有的性质,该细胞株难以应用到实际的疫苗生产中。单细胞悬浮培养易于放大,操作简便,备受疫苗生产青睐。但MDCK-STAT1-KO工程细胞在悬浮培养条件下的病毒生产情况及其病毒感染应激特征尚不清楚,限制了其进一步应用。方法: 采用生产上的常规培养方式(传代培养和批式培养)和接毒条件[感染复数(MOI)=0.001],考察悬浮MDCK-STAT1-KO工程细胞(susMDCK-STAT1-)的生长和病毒生产情况;改变关键接毒参数,考察MOI、营养条件和毒株类型对susMDCK-STAT1-细胞产毒的影响。设置同步感染实验,考察该细胞在病毒感染后的细胞凋亡水平和细胞免疫应激水平。结果: susMDCK-STAT1-细胞生产H1N1病毒的最大HA滴度和最大Svy分别为(12.40 ± 0.11)log2HAU/100 μL和(15.86 ± 1.34)×103 virions/cell,均为H1N1病毒生产较高水平,同时改变关键工艺参数均不会影响该细胞株高效生产流感病毒的特性。此外,susMDCK-STAT1-细胞具有一定抗凋亡特性,以及其胞内全局性的低免疫防御水平,有利于病毒快速扩增。结论: susMDCK-STAT1-细胞可高效生产流感病毒,同时其抗凋亡特性及胞内低免疫水平是该细胞株高效生产的关键因素。该细胞有望未来应用于流感病毒疫苗的实际生产中,提高流感病毒生产水平。
目的: 分化群44(cluster of differentiation 44,CD44)是目前肿瘤靶向治疗的热门靶点,尤其是其变异亚型(CD44 variant forms,CD44v)在促进肿瘤增殖、侵袭转移、耐药性及增强肿瘤干性等方面具有关键的介导功能,以CD44v为靶点,筛选出能够高亲和力结合肝细胞癌细胞表面高表达CD44v的纳米抗体,为CD44v阳性肿瘤的靶向治疗抗体药物研发开辟新途径。方法: 使用CD44v-Fc蛋白免疫骆驼,构建高质量的CD44v纳米抗体噬菌体展示文库;采用噬菌体展示技术固相亲和淘选富集CD44v特异性纳米抗体噬菌体,通过胞间质可溶性酶联免疫吸附测定(PE-ELISA)筛选高亲和的纳米抗体,原核表达纯化高纯度具有不同互补决定区3(complementarity determining region 3,CDR3)的CD44v纳米抗体;利用酶联免疫吸附测定(ELISA)检测纳米抗体与抗原CD44v的结合能力,流式细胞术检测纳米抗体与肝细胞癌细胞的亲和活性。结果: 构建了库容为2.8×109 CFU的高质量CD44v纳米抗体噬菌体文库;PE-ELISA初步筛选并测序后获得3株差异序列的靶向CD44v的纳米抗体,在WK6大肠杆菌中进行原核表达纯化并获得3株高纯度特异性纳米抗体。ELISA及流式结果显示其中1株纳米抗体与抗原CD44v及肝细胞癌细胞具有较好的结合活性,可用于后续药物开发。结论: 研究为CD44v阳性肿瘤的靶向治疗提供了具有潜力的候选纳米抗体,不仅拓宽了基于CD44v的抗体药物研发途径,也为后续筛选与优化更多靶向CD44v的纳米抗体提供了重要技术支持和实验依据。
目的: 从饲养牛的粪便中分离鉴定大肠杆菌及相应的噬菌体。方法: 利用麦康凯培养基分离大肠杆菌,微量肉汤稀释法分析细菌的耐药性,双层平板法分离鉴定噬菌体,点板(spotting)法分析噬菌体的宿主范围,分析不同环境中噬菌体的稳定性,通过分析基因组序列进行功能注释及噬菌体分类,通过构建转座子突变株文库鉴定噬菌体受体。结果: 从牛粪中分离了大肠杆菌EX3-6及其相应的噬菌体phiP4。药物敏感性分析显示,菌株EX3-6对4种抗生素耐受。宿主范围分析发现,分离菌株EX3-6和室验室菌株DH5α均对噬菌体phiP4敏感。稳定性分析结果表明,在温度为50℃时,phiP4存活率为90.12%;在pH为4.0和12.0时,phiP4存活率分别为73.45%和69.07%;当胆酸钠浓度为400 μg/mL时,phiP4存活率为59.35%。基因组测序及末端分析结果显示,噬菌体phiP4基因组为环状dsDNA分子,长度为106 340 bp,共编码153个蛋白质编码区,其中65个蛋白质具有已知功能。另外,该噬菌体还编码了26个tRNA。比较基因组学分析显示,噬菌体phiP4为Markadamsvirinae亚科Tequintavirus属的未确定成员。受体分析结果显示,噬菌体phiP4通过识别细胞外膜蛋白BtuB进行感染。结论: 从牛粪样品中分离了大肠杆菌噬菌体phiP4,能够耐受多种环境胁迫因子,可以提高噬菌体phiP4在制备、运输、储存及应用环节中的存活率,预计噬菌体phiP4可以作为候选的杀菌因子,用于预防与控制大肠杆菌在畜牧养殖过程中的感染。
白喉毒素突变体蛋白(cross-reacting material 197, CRM197)是一种常用的多糖结合疫苗载体,其在大肠杆菌体系中往往以包涵体形式表达。为了改善通过包涵体复性来制备CRM197而导致的收率低、操作烦琐等不足,研究设计了一种基于SUMO标签串联的策略,改善重组CRM197的可溶性,同时使用Origami B (DE3)大肠杆菌宿主,成功使重组CRM197蛋白上清液可溶比例提高至95%以上。同时简化了CRM197蛋白的获取途径,经两步Ni亲和层析和一步酶切除去融合标签等手段建立了从破菌上清液中纯化CRM197的方法,获得纯度高于98%的CRM197且收率大于80%。通过圆二色光谱及荧光发射光谱分析等证实纯化所得CRM197空间结构折叠正确。抗原性ELISA实验结果表明所制得的CRM197蛋白与CRM197标准品蛋白抗原性相当。研究结果表明串联双SUMO标签对重组CRM197在大肠杆菌中高效、可溶表达具有促进作用,并建立了快速纯化体系,获得了具有较好免疫原性的CRM197蛋白,为改善重组蛋白在原核表达体系的可溶表达设计提供了新思路。
S-腺苷蛋氨酸(S-adenosyl- L-methionine,SAM)具有重要的生理功能和广泛的应用价值。基于S-腺苷甲硫氨酸合成酶(methionine adenosyltransferase,MAT)的全细胞催化法生产SAM具有诸多优势,但MAT酶活低限制了SAM的生物催化生产实施。研究选择酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)来源的ScMAT在大肠杆菌(Escherichia coli)中异源表达,并进行表达载体筛选和诱导条件优化。在此基础上,利用AlaphFold 2和SWISS-MODEL对ScMAT分别建模并进行评估,选择最适模型对ScMAT进行L-甲硫氨酸(L-Met)的分子对接。为探究活性口袋残基的影响,通过丙氨酸扫描进行突变位点筛选。经定点突变和饱和突变,获得了催化活性提高和稳定性增强的突变体N371R。研究发现突变体比酶活为1.21 U/mg,较WT提高了384%,在65℃下的半衰期约为15.07 h,较WT提高了40%。最后,对突变体全细胞催化工艺进行优化,选择最佳培养基组分,且控制反应温度为60℃,pH为9.0,添加20 mmol/L ATP、40 mmol/L L-Met、60 mmol/L K+、60 mmol/L Mg2+时,全细胞催化2 h,SAM浓度可达2 340.87 mg/L。研究为SAM的理论和应用研究均奠定了良好基础。
烟碱是烟草中的主要精神活性成分,作为乙酰胆碱能激动剂,其通过与烟碱型乙酰胆碱受体(nAChRs)结合,激活胆碱能系统对中枢神经系统产生重要影响。尽管传统研究多聚焦于神经元nAChRs在烟碱神经生物学效应中的作用,近年来的研究表明,胶质细胞中的nAChRs在神经保护和功能调节中也发挥着不可忽视的作用。系统总结了烟碱通过激活胶质细胞nAChRs抑制Aβ沉积、调节炎症反应与细胞凋亡的神经保护机制,并探讨其在阿尔茨海默病和帕金森病治疗中的潜在应用价值。同时,还分析了烟碱通过胶质细胞nAChRs调控突触可塑性和多巴胺释放,参与成瘾行为形成与维持的机制。这些研究深化了对胶质细胞nAChRs功能的理解,为神经退行性疾病和烟碱成瘾干预提供了新的研究思路和潜在治疗靶点。
发酵工业作为生物技术产业的重要组成部分,在我国工业结构中占据了重要地位。在工业发酵条件中,恶劣环境和有毒底物或代谢产物使微生物受到极大的渗透、氧化等胁迫,严重影响了细胞生长及目标产物合成,致使发酵产量与生产效率低下。通过添加外源调节物能够提高微生物对胁迫条件的适应性,且操作简单、成本低、见效快。总结了常见的发酵过程外源添加物,包括海藻糖、脂肪酸、短肽、氨基酸、抗氧化物质及表面活性剂,深入探讨了以上外源添加物提高细胞抗逆性的作用原理及其适用场景,以期为提高发酵过程抗逆性提供新的思路和技术支持。
全球癌症负担日益加重,现有的手术及放化疗等治疗方式在处理肿瘤多发性转移病灶及肿瘤多药耐药方面存在重大挑战。仿生矿化是通过模拟生物体内的矿化过程,利用生物矿化机制来合成矿物或有机无机复合材料的方法,已在抵御外界胁迫、疫苗改进、骨再生、能源生产和生物传感等方面展示出巨大潜力。基于仿生矿化的纳米材料具备药物靶向递送、物理阻隔、优异的生物相容性和固有治疗特性,因而在肿瘤诊疗领域也得到了广泛应用。综述了常见仿生矿化纳米材料在生物医学中的应用及肿瘤矿化与肿瘤生长、预后之间的潜在关联,重点总结了仿生矿化纳米材料介导的肿瘤诊断和治疗的最新进展,讨论了其在肿瘤治疗中面临的挑战和未来研发方向,以期进一步拓展仿生矿化在肿瘤诊疗中的应用。
抗菌肽是一类在自然界中普遍存在的小分子多肽,它们在生物体的先天免疫防御机制中扮演着关键角色。抗菌肽不仅能有效杀灭细菌、真菌、原生动物,部分还对肿瘤细胞具有显著的杀伤作用。鉴于其广泛的抗菌谱和潜在的医疗应用,抗菌肽在新型抗菌药物研发领域展现出巨大的发展前景。由于缺乏特异性免疫机制,海洋无脊椎动物为适应复杂多变的海洋环境而进化出多样的免疫防御体系。以抗菌肽为代表的先天性免疫防御因子是该类生物非特异性免疫防御机制的重要组成部分,也是筛选和创制新型抗菌药物的重要来源之一。综述了抗菌肽的生理功能和作用机制,对目前已报道的具有代表性的海洋无脊椎动物来源抗菌肽及其功能和制备方法进行了汇总,介绍了海洋无脊椎动物抗菌肽的构效关系和进化机制,为该类物质的筛选、研究和应用奠定了基础。
铁载体是由微生物产生的对铁具有高亲和力的小分子物质,帮助微生物在铁限制条件下生长。不同微生物生存的环境不同,为适应一些特殊的环境条件,微生物产生结构性质各异的铁载体。近年来,人们对来自不同微生物的多种铁载体进行了深入研究,从生物合成机制角度解析铁载体的形成,并对一些来自特定微生物或具有独特结构的铁载体加以改造应用。在链霉菌中,去铁胺是主要产生的铁载体,目前主要通过发酵法生产。去铁胺因性能优良而被广泛研究,并且在医学、环境等领域中已经展现出巨大的应用潜力。由于铁载体种类众多,故以链霉菌生产的去铁胺为主线,对铁载体的生物合成途径、分类与鉴定以及在不同领域应用的研究进展进行综述,并对未来发展进行展望,希望为铁载体研究提供帮助。
采用科学技术史视角,详细回顾了自1987年中国首个生物安全三级实验室建立以来,高等级生物安全实验室如何逐步发展,以及如何响应国家安全需求和全球生物安全挑战。2004年后,国家高等级生物安全实验室建设规划推动了法规与标准的整合与提升,极大增强了我国高等级生物安全实验室应对重大传染病威胁的能力。系统梳理了中国高等级生物安全实验室在不同历史阶段的发展历程,同时探讨高等级生物安全实验室在法律、法规、制度及标准建设方面的演变过程。通过对中国高等级生物安全实验室发展的回顾,明确其发展脉络,展现高等级生物安全实验室在国家安全、有效防控重大传染病及推动科学研究方面的关键意义,为进一步推进中国高等级生物安全实验室建设提供了重要的科学依据和支持。
