目的: 构建与优化细胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)的高产平台,验证此平台是否适用于功能蛋白的装载与递送。方法: 通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、流式细胞术或Western blot(WB)检测细胞目的基因表达,采用差速超速离心法浓缩EVs,分别利用WB与纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis, NTA)检测EVs标记蛋白表达、粒径分布与产量。利用脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)诱导的A549细胞损伤模型验证EVs递送功能蛋白的能力。通过CCK8检测细胞活力,通过Annexin V检测细胞凋亡,利用qRT-PCR检测Wnt/β-catenin下游基因AXIN2、TCF4、NKD1的表达。结果: 流式细胞术结果表明CD9、CD81均能在HEK293T和HEK293F上过表达,NTA检测显示CD9更有助于EVs产量的提高。实现在贴壁细胞体系中EVs产量提升4倍,在悬浮细胞体系中EVs产量提升6倍。之后验证高产平台是否适用于功能蛋白Wnt3a的装载与递送。WB结果证实此高产平台能装载Wnt3a蛋白,NTA检测表明此高产平台在装载Wnt3a的同时将EVs产量提升3倍左右。CCK8、Annexin V结果显示CD9 Wnt3a EVs能明显提高A549细胞在LPS诱导损伤后的细胞活力,抑制细胞凋亡。机制上,qRT-PCR表明CD9 Wnt3a EVs激活了Wnt/β-catenin下游基因AXIN2、TCF4、NKD1的表达。结论: 构建了一种基于CD9过表达的EVs高产平台,该平台对EVs产量的提升在贴壁细胞与悬浮细胞中均得到了验证,该平台对功能蛋白Wnt3a的递送能力在LPS诱导的A549细胞损伤模型中得到了验证。该平台为实现EVs量产提供了新策略,有望成为一种新的功能蛋白递送平台,在生物学研究和无细胞治疗领域开拓更多应用。
熊胆粉是从黑熊胆囊中提取的一种传统中药,牛磺熊去氧胆酸(TUDCA)被认为是熊胆粉中发挥活性的主要成分及重要药物质量标准。但TUDCA在熊胆粉中的含量只占20%~30%,这引起了对熊胆粉其他成分功能活性以及其与TUDCA在生物活性上是否存在差异的疑问。探讨熊胆粉和TUDCA对神经炎症的改善作用,分别用不同浓度的TUDCA和熊胆粉对小胶质细胞BV-2进行预处理,再通过脂多糖(LPS)诱导BV-2的炎症反应,通过qRT-PCR和蛋白质印迹法检测BV-2细胞中炎症因子和相关炎症通路中关键蛋白质表达的变化。在动物实验中,分别用TUDCA和熊胆粉连续灌胃处理C57BL/6J小鼠21天,用LPS连续腹腔注射7天,通过对小鼠脑组织病理切片和炎症因子表达水平的检测评价TUDCA和熊胆粉对小鼠神经炎症的抑制作用。实验结果显示,TUDCA和熊胆粉都能有效抑制神经炎症。在相同剂量作用下,TUDCA和熊胆粉在抑制神经炎症的效力没有显著差异,这表明熊胆粉的其他活性成分可能与TUDCA共同在抑制神经炎症过程中发挥了不可替代的作用。因此,熊胆粉中不同成分的具体功效以及它们之间的协同作用关系值得进一步深入研究。研究不仅拓展了对熊胆粉作用机制的认识,也为开发新型抗神经炎症药物提供了有价值的参考。
野大豆(Glycine soja Siebold & Zucc.)是一种重要的粮油兼用作物,富含多种黄酮和黄酮糖苷,具有多种药理活性。糖基化可以将黄酮苷元转化为更稳定、生物活性更强、结构更多样的糖苷。通过基因组分析和酶挖掘,报道了一种来自野大豆的黄酮UDP-糖基转移酶GsUGT1,该酶主要作用于甘草素7-OH位置,对6种黄酮受体具有催化活性。此外,在大肠杆菌中成功异源表达GsUGT1并对其纯化,酶学性质表征发现在pH为7.0、温度为35℃时,酶的催化活性达到最大,米氏动力学研究表明GsUGT1的催化效率kcat/Km为6.70×10-5 μmol/(L·s)。最后通过分子对接对GsUGT1的催化机制进行了初步探究。首次报道了野大豆来源的UDP-糖基转移酶GsUGT1,该酶有望成为酶法合成黄酮糖苷衍生物的有效工具。
首次报道了固定化 CAL-B 突变体通过直接酰化的方式催化生成氯乙酰胺。氯乙酰胺在医药工业上主要用于合成长效磺胺 B (SMPZ)和酚妥拉明(phentolamine),利用南极假丝酵母脂肪酶 B 合成氯乙酰胺具有较好的应用前景。针对南极假丝酵母脂肪酶 B,采用半理性设计的策略并进行迭代突变,获得酶活提高的突变体 Lv-01(A281L/W104A/T159A/I189A/V190A)。与野生型相比,比活性(U/mg)提高了 1.76 倍,进一步通过固定化提升氯乙酰胺生成效率 63.95%。通过 Discovery Studio 进行分子对接分析了突变体 Lv-01 相比于野生型催化效率提高的原因,S105、H224 与底物氯乙酸的氢氧根脱氢的氧离子相连,由原本的范德瓦耳斯力变成氢键和静电相互作用,促使氯乙酸与铵根离子结合脱去一分子水形成氯乙酰胺。
目的: 利用猿猴病毒40(Simian virus 40, SV40)Large T(LT)抗原慢病毒转染含有LoxP-Stop-LoxP(LSL)元件的Cas9转基因小鼠(LSL-Cas9)胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblast, MEF),建立永生化LSL-Cas9小鼠MEF系并用于sgRNA剪切效率的高效验证。克服由于Cas9序列过大而引起的转染效率低的问题,构建一种用于sgRNA剪切效率验证的经济、便捷、高效工具。方法: 以LSL-Cas9胎鼠为实验动物,分离其MEF并感染SV40 LT慢病毒;利用潮霉素筛选成功转化的细胞;通过免疫荧光检测成纤维细胞标志物表达和细胞衰老情况,通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)鉴定SV40 LT抗原基因在MEF中的整合情况,建立永生化无限增殖细胞系;以IL10Rα基因为例验证该系统的可行性:设计4种sgRNA,利用含有PU6-sgRNA串联PCSP-Cre基因表达盒的质粒转化永生化LSL-Cas9小鼠MEF系;通过T7内切核酸酶I(T7 endonuclease I, T7EI)法评估sgRNA的剪切效率,挑选靶向性最优的sgRNA。结果: 经潮霉素筛选的阳性细胞扩大培养并稳定传代至60代,具备永生化无限增殖细胞系的特点;经PCR鉴定,SV40 LT抗原基因已稳定整合至MEF基因组中;T7EI酶切法证实sgRNA有效引导Cas9内切核酸酶实现了靶基因的切割,4种sgRNA的基因编辑效率分别为28.17%、45.87%、33.61%、38.62%。结论: SV40 LT抗原基因介导的永生化无限增殖LSL-Cas9 MEF系构建成功,可实现sgRNA引导Cas9剪切效率的高效快速验证。
大肠杆菌是重要的生物工程宿主系统,约1/3上市蛋白质类生物技术药物由大肠杆菌重组生产。但是,密码子偏性所致目的蛋白表达水平较低、不具备真核生物部分翻译后修饰等多种因素,限制了大肠杆菌系统的广泛应用。广谱抗病毒蛋白,对类似新冠的新突发再发传染性疾病的高效防控具有重要意义。为了实现广谱抗病毒蛋白PA在大肠杆菌中的高效表达、拓展其应用潜能,通过密码子优化、结合mRNA翻译起始区(translation initiation region,TIR)二级结构最小自由能(minimum free energy,MFE)预测等,对PA在大肠杆菌中的表达水平进行了研究。结果发现:密码子的优化,可以实现PA在大肠杆菌中的表达,但是总体表达水平并不是十分理想。TIR二级结构MFE的大小与表达水平高低密切相关,通过密码子的同义突变进而改变TIR局部二级结构、MFE大小,可以进一步提高或降低PA的表达水平,从而从正反两个方面证实全局密码子的优化结合TIR局部二级结构驱动的MFE调整,是实现PA在大肠杆菌中高效表达的一种现实、有效策略,对蛋白质类生物技术药物在原核系统中的高效表达与规模化生产,具有重要应用价值。
单克隆抗体在生物医学领域中具有广泛应用,其特异性识别抗原的能力对于疾病治疗和疫苗设计至关重要。精确定位单克隆抗体识别表位有助于深入了解抗体与抗原的相互作用机制,可以为抗体药物的设计和优化以及疫苗设计提供重要依据。单克隆抗体表位分析技术的不断发展为抗体应用提供了有力支持。现有的单克隆抗体表位分析技术有丙氨酸扫描、多肽微阵列、结构域互换、X射线晶体衍射技术、冷冻电镜技术等。不同技术各具特色,在选择适合的分析方法时,需要综合考虑实验需求、样本特性及技术可行性等因素。综述了现有的单克隆抗体表位分析技术,比较了不同技术的优缺点,旨在为单克隆抗体表位分析的方法选择提供参考,推动单克隆抗体在生物医学领域的进一步发展。
作为当前最先进的检测方法,基于特定核苷酸序列的核酸检测法被广泛地应用于基因分型、病原体和遗传疾病诊断及环境监控等领域。CRISPR/Cas系统可在指导RNA的导引下精准高效地识别和切割目标DNA/RNA,被用于研发新一代高灵敏、高特异性的体外核酸检测技术。重点综述了CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13、CRISPR/Cas14系统应用于体外核酸检测的作用机制及高通量多通道检测、目标核酸的富集与扩增和信号输出方式等信号传感方向的技术进展,介绍了CRISPR/Cas核酸检测在监控内源性疾病、病毒、细菌和寄生虫中的新应用,讨论了其优缺点与面临的挑战,并展望了其未来的研究方向,为CRISPR/Cas核酸检测的转化提供参考和依据。
酪氨酸酶(TYR)是一种生物催化剂,具有催化效率高、环境友好的特点,广泛应用于食品、医疗、能源和环境治理等众多领域。然而,游离酶的稳定性差一直是制约其在工业层面应用的瓶颈。酶的固定化技术不仅增强了酶的稳定性和可重复使用性,也进一步方便了其从反应体系中的分离方法,简化了工艺流程,提高了生产效率。固定化酪氨酸酶技术的发展不仅对提高酪氨酸酶的性能和生产效率具有重大意义,而且能为企业带来巨大经济效益。因此,固定化酪氨酸酶的研究一直是一个热点。综述了酪氨酸酶固定化的技术、固定化载体及该技术在实际应用中的研究进展。
产甲烷古菌通常指主要以CO2、乙酸、甲基类化合物(甲基歧化型)作为底物的广古菌门Euryarchaeota中的一类厌氧代谢产甲烷的古核生物。随着全世界学者对产甲烷古菌进一步研究,陆续发现了氢依赖甲基型产甲烷古菌以及专性甲硫醇型、甲氧基型、烷基型和利用甲烷发酵生长同时又能产生甲烷的产甲烷古菌等;除广古菌门Euryarchaeota外,科学家也陆续在热原体门Ca.Thermoplasmatota和TACK超门中发现了产甲烷古菌。因此产甲烷古菌应定义为以二氧化碳、乙酸、甲基类化合物、甲氧基化合物、烷基类化合物为底物,广泛分布于广古菌门Euryarchaeota、热原体门Ca.Thermoplasmatota和TACK超门中的一类厌氧代谢产甲烷的古核生物。
阿魏酸是一种来源于植物的酚酸,具有抗氧化、降血脂、抗癌等药理作用,被广泛应用于医药、化妆品和食品行业。从植物中提取和化学合成阿魏酸存在提取效率低、催化成本高、产量低及环境污染严重等问题。微生物合成法具有高效、经济和环保等优势,将成为未来制备阿魏酸的一种趋势。综述了阿魏酸的微生物合成研究进展,讨论了改造底盘菌株、构建异源路径、筛选和优化关键酶、供应和循环辅因子、提高菌株稳定性、细胞共培养、优化发酵条件等提高产量的策略,并就未来的发展趋势提出展望。
二氢槲皮素(dihydroquercetin,DHQ),又名花旗松素,是一种天然二氢黄酮类化合物,因其具有高效抗氧化活性而受到密切关注,被广泛应用于医药、食品和保健品等领域。DHQ的传统生产方式是从植物组织中提取,但受制于原材料来源、生产工艺等因素,传统方法在制备DHQ上面临挑战。而以生物合成法为代表的新生产方式将是解决这一问题的关键。有鉴于此,全面总结了DHQ的主要生物合成途径,综述了近年来有关DHQ生物合成研究进展,以期为DHQ的应用开发以及其他类似天然产物的生物合成提供参考。
