2013年, 第33卷, 第12期　
刊出日期：2013-12-25

  

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研究报告
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  靶向miRNA干扰Bmi-1诱导胆囊癌细胞凋亡及上调Caspase-3表达的研究

  魏东, 邹浩, 王琳, 王文举, 骆志玲, 张小文

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 1-8.

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  目的：通过靶向抑制原癌基因Bmi-1表达，观察其诱导胆囊癌细胞凋亡及上调Caspase-3蛋白表达的效应，探讨其在胆囊癌形成中的机制。方法： 通过前期成功构建miRNA-Bmi-1重组质粒转染GBC-SD细胞，然后将其分为miRNABmi-1、miRNAScramble、Lipofectamine、GBC-SD 4组，转染48h后采用RT-PCR和Western blot法检测各组Bmi-1mRNA和蛋白的表达,倒置显微镜观察细胞生长情况;流式细胞技术检测细胞的凋亡率、细胞周期分布及Caspase-3蛋白表达水平。结果： RT-PCR和Western blot结果显示miRNABmi-1组细胞Bmi-1mRNA和蛋白的表达水平明显低于对照组（P<0.05）。倒置显微镜观察显示miRNABmi-1组细胞死亡较对照组明显；细胞周期检测显示：miRNABmi-1组细胞阻滞于G0 /G1（72.20±1.71），G2 /M和S期细胞减少（18.30±7.21，9.50±6.01），凋亡指数增高（49.83±5.19），Caspase-3蛋白表达量明显增加（30.37±8.10），与对照组比较，具有显著性差异（P<0.05）。结论： 靶向沉默Bmi-1能有效抑制胆囊癌细胞Bmi-1mRNA及蛋白表达，诱导胆囊癌细胞凋亡，其机制可能是早期使胆囊癌细胞周期阻滞于G0/G1期，并上调了Caspase-3蛋白表达，Bmi-1可能参与调控线粒体依赖的凋亡途径。
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  经典Wnt信号途径在肺脏上皮细胞抗结核分枝杆菌感染中的作用

  石娟, 杨佳丽, 马凌洁, 包少文, 马彦, 程龙, 马春燕, 李勇, 刘晓明

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 9-14.

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  目的：肺脏上皮细胞在抵抗外源微生物入侵中发挥着重要保护作用，最近研究揭示，在器官组织发育中发挥调控作用的经典Wnt信号具有免疫调节功能。因此，有必要研究肺脏上皮细胞A549中Wnt 信号经典途径在抗结核分枝杆菌（Mtb）感染中的免疫调节作用。方法：用牛结核分枝杆菌卡介苗（BCG）刺激转入Wnt信号报告基因质粒BATflash的 A549细胞，利用双荧光素酶报告系统、Western blot和ELISA方法分析细胞中Wnt信号经典途径主要相关信号因子和免疫反应炎症因子的表达变化。结果：BCG感染A549细胞后抑制了Wnt信号报告荧光素酶的活性，Western blot结果表明，随着细胞浆内磷酸化β-catenin含量增加，Wnt信号的抑制基因GSK3β和Axin2表达上调，而细胞核中的效应子β-catenin基因活性组分和下游转录因子TCF4与Lef-1的表达下调；BCG感染过表达β-catenin的细胞时导致IL-6、NF-κB、MyD88和TRAF6蛋白表达下调，但不影响TNF-α的表达。结论：肺脏上皮细胞在抗结核分枝杆菌感染过程中通过下调Wnt信号活性而抑制细胞中的MyD88/TRAF6/NF-κB信号通路来降低免疫反应以保护宿主细胞免受感染造成的免疫损伤。
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  5型和35型腺病毒纤毛蛋白的原核表达及活性验证

  张文峰, 张琼宇, 薄华本, 邵红伟, 李晓程, 王腾, 黄树林

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 15-20.

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  目的：原核表达5型腺病毒纤毛蛋白（Ad5 fiber）和35型腺病毒纤毛蛋白（Ad35 fiber），并对蛋白活性进行初步分析。方法：将重组质粒pET28a-Ad5 fiber和pET28a-Ad35 fiber转化入E.coli BL21（DE3），IPTG诱导表达后，经Ni-NTA凝胶珠亲和纯化，用SDS-PAGE鉴定纯化蛋白，并用蛋白竞争性实验验证纯化蛋白的活性。结果：转化溶原菌后能够表达目的蛋白，Ad35 fiber蛋白对Ad5（5型腺病毒）感染无影响，只能阻断Ad5F35（5型腺病毒纤毛被替换为35型腺病毒纤毛的嵌合腺病毒）对细胞的感染；Ad5 fiber蛋白对嵌合腺病毒Ad5F35感染无影响，只能抑制Ad5对细胞的感染。结论：成功表达具有生物活性的5型和35型腺病毒纤毛蛋白，为进一步研究嵌合腺病毒Ad5F35感染细胞的机制奠定基础。
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  GshF在大肠杆菌中的表达及酶学性质研究

  陈永露, 吴绵斌, 林建平, 杨立荣, 岑沛霖

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 21-28.

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  谷胱甘肽是参与细胞活动的最普遍的非蛋白巯基化合物，是机体内重要的活性三肽，因其抗氧化作用而在医药、食品、化妆品等行业有着广泛的应用，生物合成是制备谷胱甘肽的主要方法，一直引起广泛关注。近年来发现的双功能酶GshF可同时催化谷胱甘肽生物合成的两步反应，有望提高酶法催化产谷胱甘肽的效率，但该酶的酶学性质尚未得到充分研究。克隆了来自Streptococcus thermophilus的双功能酶基因gshF，并用大肠杆菌表达，研究表明，重组菌于37℃培养4 h后经0.1 mmol/L IPTG诱导，然后在30℃下表达，胞内酶活可达44 U/L。表达产物经破胞、离心、亲和层析等步骤分离纯化后，进一步考察了其相关酶学性质，结果表明，该酶最适pH为8.0，最适温度为37℃，还研究了其最适pH和温度下的稳定性。最终通过重组菌酶法催化合成谷胱甘肽得到的最高产量为2.11g/L。这些对该酶在谷胱甘肽生物合成上的应用有重要的借鉴作用。
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  Bacillus subtilis RecQ酶精氨酸突变体表达纯化及活性检测

  吴海丽, 张三军, 杜冰, 钱旻, 任华

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 29-34.

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  RecQ解旋酶是生物分子代谢过程中重要的大分子物质，对保持遗传物质的稳定性具有重要作用。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）RecQ 解旋酶中精氨酸可能在其对ATP水解和结合中起到重要的作用。通过PCR以 Bacillus subtilis 168中抽提的基因组DNA为模板扩增得到大小为1.5kb的RecQ基因片段，并用重叠PCR定点突变法将该RecQ基因中的精氨酸残基（arg319和arg322）分别进行单突变和双突变，并将野生型和突变型基因克隆入原核表达载体pET24a（+）中，转化大肠杆菌E.coli BL21（DE3），IPTG诱导表达，所有目的蛋白主要以可溶形式存在于菌体中。优化表达条件后，经镍柱螯合亲和层析纯化获得纯度大于90%的目标蛋白质，检测野生型和突变型蛋白的ATP水解活性。结果表明，Bacillus subtilis RecQ解旋酶具有DNA依赖性和蛋白浓度依赖性的ATP水解活性。其arg319和arg322突变后，RecQ酶的ATP水解活性明显减弱，表明这两个精氨酸残基参与RecQ酶与ATP的相互作用。实验为RecQ解旋酶家族其他重要成员的活性功能研究提供了理论依据和重要参考。
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  植物乳杆菌的比较基因组学研究

  陈臣, 任婧, 周方方, 刘振民, 郭本恒

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 35-44.

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  植物乳杆菌是一类与人类的生活关系密切，具有多种益生功能的乳酸菌。随着高通量测序技术的广泛应用，越来越多的植物乳杆菌基因组全序列测定得以实现。以植物乳杆菌ST-Ⅲ基因组为主要研究对象，采用比较基因组学分析和比较了几株测序的植物乳杆菌的基因组特点，重点分析了与植物乳杆菌素、蛋白水解系统，糖代谢和胞外多糖合成相关基因，为植物乳杆菌研究和应用提供参考。
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  发酵罐中蔗糖流加控制和pH调控对乳酸链球菌素产量的影响

  汪蕊, 杜超, 左芳雷, 陈尚武

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 45-50.

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  主要研究了乳酸乳球菌发酵过程中调控pH和补加蔗糖对乳酸乳球菌发酵生产及其发酵产物乳酸链球菌素效价的影响，通过将pH恒定为乳酸链球菌素产生的最佳值6.8，与不经过pH调控的乳酸乳球菌发酵生产的乳酸链球菌素效价对比，效价提高了1.2倍。分别选用2g/L·h和4g/L·h的蔗糖流加速度，当按4g/L·h恒速流加蔗糖溶液时，乳酸链球菌素效价提高约50.5%。
技术与方法
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  以MERS-CoV主蛋白酶为靶点的药物筛选体系的建立及应用

  张宁, 潘丽, 牛国君, 王文明, 周红刚, 杨诚

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 51-56.

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  目的：以新型冠状病毒（MERS-CoV）主蛋白酶NSP5为靶点，应用荧光共振能量转移法（FRET）建立药物筛选体系，并进行抑制剂的筛选。方法：采用原核表达系统、利用基因重组以及蛋白表达纯化技术得到目的蛋白，FRET法检测蛋白酶活性，优化反应条件以及确定酶、底物的浓度，建立药物筛选体系，对700种化合物进行了检测。结果：应用建立的药物筛选体系，筛选到抑制率较高的化合物共6种，并测得IC₅₀值，其中MDCCCL002330的IC₅₀值最低，为（0.43±0.03）μmol/L。结论：建立的药物筛选体系较为理想，适用于NSP5抑制剂的筛选，促进先导化合物的研发。
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  脑胶质瘤IDH2基因突变HRM检测方法的初步建立

  王银辉, 张海燕, 杨传红, 张伟, 赖晃文, 陈晓东, 王捷

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 57-63.

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  异柠檬酸脱氢酶2（IDH2）基因突变常常发生于WHOⅡ-Ⅲ级的星形细胞瘤，少突胶质细胞瘤，和大部分继发性胶质母细胞瘤中。在临床上，IDH2 突变已经显示对胶质瘤患者有诊断和预后意义。拟通过提取胶质瘤石蜡包埋组织DNA，优化PCR反应条件，初步建立IDH2 基因突变高分辨率熔解曲线（high resolution melting，HRM）检测方法。并与直接测序法对比，观察反应体系的检测灵敏度和稳定性。响应面分析结果证明20μl HRM 反应体系中，引物浓度0.6μmol/L，模板量45ng，Mg²⁺浓度2.75mmol/L，退火温度52.5℃为最佳。HRM检测 IDH2 基因突变的结果和直接测序法一致，但灵敏度更高。表明所建立HRM 方法简单，特异性强，准确可靠，可为IDH2 突变检测的临床应用提供借鉴和依据。
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  均相时间分辨荧光(HTRF)法测定重组单抗含量

  邓春平, 秦玉敏, 邓巧春, 王博, 彭育才

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 64-68.

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  建立了一种HTRF检测方法，可以快速、简便、稳定地测定重组单克隆抗体的含量。将检测试剂、标准品及待测样品加入96孔板，孵育后即可在酶标仪上读取荧光信号值，用软件对信号值进行四参数曲线拟合，绘制标准曲线，根据标准品四参数方程计算待测样品中抗体的含量；同时对方法进行了验证。结果表明：该方法专属性强，抗体含量测定范围为25～1000 ng/ml，线性相关系数在0.99以上，回收率范围为92.8%～103.6%，平均为98.9%；该法精密度较好，精密度的变异系数范围为0.2%～11.6%，平均为4.3%。适用于生物制药工艺开发过程中细胞培养上清、纯化产物及制剂中抗体含量的测定。

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  在叶绿体中过量表达AOD1和HPS-PHI创建光合甲醇同化途径增加烟草同化甲醇能力

  刘蕾, 孙振, 宋中邦, 肖素勤, 陈丽梅

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 69-78.

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  最近的研究证明在叶绿体内过量表达甲基营养细菌RuMP中固定HCHO的关键酶6-磷酸己酮糖合成酶（HPS）和6-磷酸果糖异构酶（PHI）的融合蛋白HPS-PHI可以在转基因天竺葵中构建一条甲醛光合同化途径从而提高植物对甲醛的同化和脱毒能力。甲醇氧化酶（AOD1）是甲基营养型酵母甲醇代谢途径的第一个关键酶，可催化甲醇氧化为甲醛。在烟草叶绿体中过量表达AOD1或/和HPS-PHI产生过量表达AOD1（AO）、HPS-PHI（AB）、同时过量表达AOD1和HPS-PHI（AA）的转基因烟草。用2和6mmol/L ¹³CH₃OH处理3种转基因烟草和野生型烟草（WT），¹³C-NMR分析表明AO植株中积累的H¹³COOH最多，[U-¹³C] Gluc和[U-¹³C] Fruc的生成量在AO和WT间无显著差异，在AA和AB中的产生量显著高于AO和WT，且在AA中的生成量又高于AB，这种差异在6mmol/L ¹³CH₃OH处理植株中比2 mmol/L更为明显。这些结果证实在叶绿体中过表达AOD1增加烟草氧化甲醇为甲酸的能力，同时过量表达AOD1和HPS-PHI在烟草中成功地构建一个甲醇光合同化途径，提高烟草同化甲醇为糖类物质的能力。
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  利用N-糖基化修饰对β-甘露聚糖酶Man47的稳定性改造

  谢春芳, 黎玉凤, 刘大岭, 姚冬生

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 79-85.

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  N-糖基化是真核生物蛋白质最重要的翻译后修饰之一。以Armillariella tabescens β-甘露聚糖酶Man47为研究对象，利用计算化学对A. tabescens β-甘露聚糖酶Man47进行理性设计，经过分子对接、二级结构分析和糖基化的可行性分析后，构建具有EAS（enhanced aromatic sequence）序列的突变体g-123作为N-糖基化的突变位点。将其整合到毕赤酵母表达载体SMD1168上，通过电转化得到重组转化子。最后对突变体g-123的温度稳定性、酸碱稳定性、胃蛋白酶和胰蛋白酶抗性进行分析。结果表明：糖基化A. tabescens β-甘露聚糖酶Man47突变体g-123与野生型相比，其热稳定性、酸碱稳定性、蛋白酶抗性均得到不同程度的改善。
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  5’非翻译区序列改建提高抗菌肽PR39表达

  明飞平, 杨军, 朱进美, 邝哲师, 李华周, 夏枫耿, 叶明强, 王候光, 赵祥杰, 黄志丰, 蔡海明, 施巨清, 马苗鹏, 张玲华

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 86-91.

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  目的：在毕赤酵母SMD1168中高效表达抗菌肽PR39，并检测其抗菌活性。方法：根据毕赤酵母密码子偏爱性，人工合成4条寡核苷酸片段，通过重叠PCR获得PR39核苷酸序列，将其插入酵母表达载体pPIC9K，重组表达质粒pPIC9K-PR39经PCR敲除PR39 5’端多余的长度为24bp的核苷酸序列得到pPIC9K-PR39-D，再经PCR、酶切连接构建5’UTR已删除8个核苷酸GGATCCAA的新型毕赤酵母表达载体pPIC9K-PR39-D-E；pPIC9K-PR39-D-E转化到毕赤酵母SMD1168，经PCR鉴定及G418筛选，用0.5%的甲醇诱导表达，Tricine-SDS-PAGE分析，再利用琼脂糖扩散法测定发酵上清的抗菌活性，表达产物经反相层析及SP-Sepharose层析柱纯化测定其表达量。结果：经Tricine-SDS-PAGE检测，在4.7kDa左右处可见目的蛋白表达条带，纯化后测定蛋白浓度表达量约为175.6mg/L。获得的抗菌肽PR39对E.coli DH5α，有明显抑菌活性。结论：经改建后新型毕赤酵母表达载体pPIC9K-PR39-D-E在毕赤酵母中可高效表达抗菌肽PR39，为以后深入研究毕赤酵母高效表达抗菌肽奠定了基础。
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  温和破壁制备酵母源生物蛋白的研究

  王斌, 黄丽娜, 邱丽娟

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 92-96.

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  针对酵母壁阻碍酵母内营养物质被机体高效消化吸收的问题，采用三段变温自溶加酶破壁技术，从破壁工艺、蛋白质释放率、活性物质保全、产品风味及动物养殖效果等方面开展研究，建立了一种温和破壁方法，提高了酵母蛋白质可利用程度，营养物质保全及风味良好，易产业化，可为人类健康及动物养殖提供大量的优质生物蛋白。
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  响应面法优化棘孢木霉产厚垣孢子发酵工艺

  武为平, 陈捷, 李雅乾, 陈立杰, 段玉玺

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 97-104.

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  采用响应面法（Box-Benhnken Design）对影响棘孢木霉（Trichoderma asperellum）ZJSX5003菌株产厚垣孢子的4个主要因素（黄豆饼粉-玉米粉用量，甘油添加量，装液量，初始pH）进行了研究。通过对试验数据进行方差分析考察了各因素及其交互作用对厚垣孢子产量的影响；进行回归分析并建立基于统计学的回归方程，计算获得最佳发酵条件：大豆饼粉-玉米粉用量33.25g/L、甘油添加量8.86ml/L、装液量99.35ml/500ml、初始pH值3.26，此时预测的厚垣孢子产量为9.56×10⁷个/ml。在此条件下，实际测得厚垣孢子产量为9.84×10⁷个/ml，达到理论预测值的97.07%，且比优化前提高了69.07%，进一步采用10L发酵罐进行适用性验证，厚垣孢子产量达到1.75×10⁸个/ml，比摇瓶发酵的产量高，为木霉菌厚垣孢子菌剂开发提供了理论依据。

综述
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  溶瘤腺病毒靶向癌症治疗的临床研究进展

  周立, 何婉婉, 朱桢楠, 杨远勤, 赵红芳, 马步云, 王毅刚

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 105-113.

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  自上世纪 50 年代，腺病毒的发现并成功分离后，生物学家对溶瘤腺病毒进行了广泛的研究。与其他病毒相比，溶瘤腺病毒能够特异性地感染肿瘤细胞并在肿瘤细胞中完成感染-复制周期，从而特异性地杀伤和裂解肿瘤细胞但不损伤其他正常细胞和组织，因此成为目前最具研究前景的抗肿瘤药物之一。然而，在临床基因治疗过程中，腺病毒载体存在缺乏组织或细胞特异性，靶向细胞的基因转染效率较低以及缺乏一定的安全性等问题。因此，提高重组腺病毒的靶向性对于癌症基因治疗成功与否极为关键。据相关研究表明，目前溶瘤腺病毒作为癌症基因治疗载体已经进入相关临床试验阶段，并涉及多种癌症，而且也显示了很好的临床应用前景。对溶瘤腺病毒的种类、癌症靶向策略及临床研究等进行了综述。
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  生物质能源发酵中染菌及防控的研究进展

  刘华擎, 李灏

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 114-120.

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  生物质能源具有环境友好、成本低廉、可再生可持续等众多优势。然而，生物质能源发酵生产依然面临非粮原料利用技术不成熟以及高渗、高温、产物胁迫、杂菌污染等诸多问题。其中杂菌污染是生物质能源发酵工业中长期以来不能彻底解决的问题。杂菌通常通过影响发酵环境、竞争底物及生存环境等方面抑制发酵，若不能得到有效控制，会严重影响产量，进而导致巨大的经济损失。传统的杂菌防控主要通过添加抗生素来实现，而其抗药性等问题日益突出，因而近年来涌现出的一些新的杂菌防控方法受到越来越多的关注。介绍了近年来关于生物乙醇及其它生物质能源发酵中杂菌污染产生的原因、杂菌污染抑制生物质能源发酵机制的研究进展，并对如何防控杂菌污染的研究进展进行了综述。
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  乳酸克鲁维酵母的发酵优势及在食品酶制剂领域中的应用

  王玉海, 张慧斌, 杨慧敏, 孟青青, 王凤寰

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 121-126.

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  乳酸克鲁维酵母是一种能够以乳酸作为其唯一的碳源和能源的酵母，具有营养要求极其简单、生长旺盛、生物量大、生长温度适应范围广、分泌蛋白能力强，不产生内毒素和对人类安全等优点。其作为宿主系统表达食品用酶也已显示出巨大的潜力。从生物学特性、菌种选择、发酵工艺优化、表达效果分析、外源蛋白修饰加工诸多方面阐述了乳酸克鲁维酵母发酵特点，并指出其具有的独特发酵优势。简述了乳酸克鲁维酵母在食品酶制剂领域中的应用。
专利
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  从审查角度分析生物技术专利申请中的常见问题和应对策略

  武雪梅, 曲凯

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 127-132.

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  生物技术领域的专利申请在技术运用、法律法规和社会伦理等方面具有一定的特殊性，从专利审查角度通过实际案例分析了该领域专利申请文件中的常见问题及解决方法，包括不授予专利权的客体、说明书公开不充分、权利要求概括不合理等，为专利申请文件的撰写提供参考。
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  中日蛋白质产品发明新颖性与创造性审查比较研究

  孙谦, 徐莉, 周茂新, 钟辉

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 133-136.

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  我国与日本在生物工程领域的发展与专利审查标准方面具有一定的相似性。针对具体的蛋白质产品而言，两国创造性的判断标准基本相同，而新颖性的判断中除中国规定的一种情形外，日本进一步规定与已知蛋白质氨基酸序列相同、但糖链等不同的蛋白质具有新颖性。我国第15463号无效审查案例以及日本平成14年第505号判例中体现了中日对于蛋白质产品新颖性和创造性的审查标准，对未来该方面问题的认定具有一定指导意义。
论坛
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  推动我国转基因作物发展的思考

  张俊祥, 陈群, 张宏翔

  中国生物工程杂志. 2013, 33(12): 137-140.

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  从转基因商业化种植以来，对转基因安全的争论就一直没有停息过，但转基因作物的种植从1995年到2012年，连续保持两位数的增长。受困于争论，中国转基因的发展也陷入困境。分析了世界转基因作物研发态势、反对转基因人群类型，及造成我国转基因困境的几个原因，提出从法律、市场监管、舆论宣传、技术研发等方面，重新思考和布局我国转基因作物发展战略。