目的:探究干细胞中表达丰度最高的微核糖核酸簇miR-290-295对体细胞重编程的影响。方法:使用逆转录病毒载体将miR-290-295簇在小鼠体细胞中过表达,研究其促进体细胞重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)以及此过程对细胞功能的影响。结果:miR-290-295簇的过表达在三因子(Sox2、Klf4、Oct4)诱导体系中能够显著提高小鼠体细胞重编程的效率;过表达miR-290-295簇能够促进重编程中多能性标记基因的上调与体细胞标记基因的下调,同时也会促进间质-上皮细胞转化(mesenchymal-epithelial transition,MET)标记基因的表达。结论:miR-290-295簇对小鼠体细胞重编程具有促进作用,这有助于深入理解干细胞多能性和重编程的RNA调节机制,为开发新型诱导体系提供了新视角。
目的:表达和纯化重组人糖原合成激酶-3β(glycogen synthetic kinase-3β,GSK-3β),优化反应条件,分析GSK-3β对tau蛋白磷酸化修饰产物p-tau的生物活性。方法:构建GSK-3β原核和杆状病毒表达载体,镍亲和层析纯化,BCA法测定蛋白浓度,考马斯亮蓝染色分析纯度;免疫印迹(Western blot)鉴定GSK-3β免疫反应性;液相色谱-质谱联用(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)和斑点印迹检测GSK-3β的tau磷酸化情况;优化GSK-3β磷酸化体系中GSK-3β和三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)的浓度;负染透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)和硫磺素T(thioflavine-T,ThT)结合实验分析磷酸化产物形成纤维的情况;CCK8实验分析磷酸化产物的细胞毒性。结果:考马斯亮蓝染色显示,原核和杆状病毒表达的重组人GSK-3β蛋白表观分子量位于50 kDa左右,蛋白纯度分别为86%和81%;Western blot在相应位置有特异条带;LC-MS提示,经GSK-3β处理的tau蛋白有23个磷酸化位点;斑点印迹显示,兔抗pT181血清、兔抗pT217和pS404识别磷酸化的tau蛋白;优化反应条件,tau、GSK-3β和ATP的最适反应浓度分别为1 μmol/L、5 μmol/L和3.2 mmol/L;制备的GSK-3β对tau蛋白pT217位点磷酸化信号强于国外商品(P<0.05);TEM显示p-tau 5 d出现纤维结构,而tau未见明显的纤维结构;ThT结合实验检测到磷酸化产物的荧光值增强(P<0.05);磷酸化产物的细胞毒性增强(P<0.05)。结论: 成功制备并鉴定了重组人GSK-3β,可催化tau蛋白在第181、217和404位氨基酸磷酸化,为阿尔茨海默病的基础研究提供了技术支撑。
目的:探讨miR-296-3p对多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)大鼠颗粒细胞凋亡的影响。方法:全自动化学发光免疫分析法检测PCOS大鼠血清雌二醇(estradiol,E2)、孕酮(progesterone,P)、睾酮(testosterone,T)水平;利用苏木素-伊红染色(hematoxylin-eosin staining,HE)检测卵巢病理学改变;TUNEL法检测卵巢细胞凋亡;qPCR检测卵巢miR-296-3p表达水平;将各质粒分别转染卵巢颗粒细胞(ovarian granulosa cells,GCs)后分为miR-NC、miR-296-3p mimic、miR-296-3p inhibitor、miR-296-3p mimic+Vector、miR-296-3p mimic+PRKCA和miR-296-3p mimic+PRKCA+NF-κB组,以未处理的GCs为对照组;Western blot法检测p38、p-p38及NF-κB的表达水平,利用StarBase在线预测和双荧光素酶报告实验验证miR-296-3p与PRKCA的靶向关系,流式细胞术检测细胞凋亡率。结果:与对照组相比,PCOS大鼠卵巢中E2、P、T水平升高,细胞凋亡比例增加,miR-296-3p表达升高;miR-296-3p与PRKCA具有靶向关系,在3'UTR区存在结合位点;与miR-NC组相比,miR-296-3p mimic组PRKCA mRNA表达水平显著下调,p-p38/p38和NF-κB表达上调,miR-296-3p inhibitor组PRKCA mRNA表达水平显著上调,p-p38/p38和NF-κB表达下调;与miR-NC组相比,miR-296-3p mimic组和miR-296-3p mimic+Vector组细胞凋亡比例显著上调;与miR-296-3p mimic组和miR-296-3p mimic+Vector组相比,miR-296-3p mimic+PRKCA组卵巢颗粒细胞凋亡比例显著下调;与miR-296-3p mimic+PRKCA组相比,miR-296-3p mimic+PRKCA+NF-κB组卵巢颗粒细胞凋亡比例显著上调。结论:miR-296-3p通过靶向PRKCA激活p38 MAPK/NF-κB信号通路介导多囊卵巢综合征大鼠颗粒细胞凋亡。
目的:烟草酰基糖酰基转移酶(Nicotiana tabacum acylsugar acyltransferase, NtASAT1)可催化短支链脂肪酸与蔗糖形成蔗糖单酯。利用大肠杆菌原核表达系统分析NtASAT1的表达,并对其进行纯化及功能验证。方法:首先利用生物信息学软件对烟草NtASAT1的理化性质、二级结构及同源性进行分析;之后从烟草腺毛的cDNA中克隆NtASAT1基因,并构建表达载体,研究其在BL21(DE3)中的表达情况;最后利用镍柱对NtASAT1进行纯化,将纯化后得到的目标蛋白进行酶反应,通过液相色谱-质谱法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)检测产物并验证其功能活性。结果:C端截短93个氨基酸之后的NtASAT1能够在BL21(DE3)中表达。表达后的蛋白质大部分以不可溶状态存在于细胞中,不同的诱导剂浓度、诱导时间及诱导温度对于蛋白质可溶性表达影响不明显。利用镍柱对其纯化得到目标蛋白,加入底物进行酶反应,通过LC-MS检测到产物蔗糖单酯的存在。结论:通过克隆及纯化得到重组蛋白trNtASAT1,加入底物进行酶反应后可检测到产物,证明纯化后的NtASAT1具有一定功能,为ASAT类酶的纯化及应用奠定基础。
目的:以节杆菌Arthrobacter sp. CCTCC 2013431为研究对象,探究低聚磷酸盐作为能量供体促进环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)发酵合成的作用机理。方法:在7 L发酵罐中添加低聚磷酸盐,对发酵性能、转录组学、关键酶活性以及重要代谢物水平进行分析,揭示低聚磷酸盐促进cAMP发酵合成的机理。结果:发酵24 h添加2 g/L六偏磷酸钠,cAMP产量显著提高,达到3.64 g/L,与对照组相比提高了33.82%。转录组数据分析表明,由于六偏磷酸钠的添加,227个基因表达量显著上调,265个基因表达量显著下调;磷酸戊糖途径和cAMP合成途径中多数酶编码基因的转录水平,电子传递链中复合体III、复合体IV和F0F1-ATP酶以及聚磷酸盐激酶编码基因的转录水平,硫氧还蛋白、过氧化氢酶及CLP蛋白酶等编码基因的转录水平均显著提高。此外,对丙酮酸激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、腺苷琥珀酸合成酶、腺苷酸环化酶、过氧化氢酶、聚磷酸盐激酶活性以及胞内活性氧、ATP和NADPH等进行测定,进一步证明了转录组分析结果。结论:六偏磷酸钠能够强化磷酸戊糖途径与cAMP合成途径,提高ATP供应,同时维持胞内氧化还原平衡,促进产物合成与积累。
目的:Tth DNA聚合酶是一种同时具备DNA聚合酶和逆转录酶活性的耐热型工具酶。为消除其在一步法逆转录-实时荧光定量PCR(reverse transcription-quantitative real-time PCR,RT-qPCR)反应时的非特异性扩增,筛选可在较低温度下抑制其活性的核酸适配体,从而实现温启动一步法RT-qPCR。方法:在前期获得不依赖Mn2+的Tth DNA聚合酶突变体的基础上,检验四种DNA适配体及其对应的RNA适配体对Tth DNA聚合酶突变体的DNA聚合酶活性和逆转录酶活性的封闭效果以及解离温度,并通过分子对接模拟适配体与聚合酶的结合模式。结果:TQ21-11和TQ21-11-RNA两种适配体在40℃可有效抑制Tth DNA聚合酶的DNA聚合酶活性和逆转录酶活性,抑制率达到97%以上;两种适配体在50℃可几乎完全解离。这两种适配体均可用于温启动一步法RT-qPCR,其中TQ21-11-RNA的非特异性扩增更低。结论:利用TQ21-11和TQ21-11-RNA两种适配体在室温下封闭Tth DNA聚合酶突变体活性,可以实现温启动一步法RT-qPCR。
肝细胞癌是常见的恶性肿瘤,其发病机制尚未完全明确。Wnt信号通路与人体内多种病理生理过程相关,其中肝癌的发生、发展可能与经典的Wnt/β-catenin信号通路密切相关。Wnt/β-catein信号通路通过表达癌症相关基因、激活肝星状细胞、调控肝干细胞行为、促进肝癌细胞侵袭转移等方式调控肝癌的发生、发展。Wnt/β-catein信号通路在肝癌发生、发展中的作用有望为肝癌研究提供新的思路。
传统骨组织工程支架材料存在强度不足、生物活性低等缺点。近年来,碳纳米材料在骨再生方面展现出独特的优势。氧化石墨烯(graphene oxide,GO)是一种具有代表性的二维碳纳米材料,作为石墨烯的氧化形式,GO具有优异的力学性能、良好的生物相容性、大比表面积、易于改性等特点。GO不仅能够直接促进干细胞黏附、增殖和分化,还可以改善传统支架的机械性能、生物活性、抗菌能力、免疫调节能力等,基于GO的复合材料有望成为理想的骨再生支架。综述GO的物理化学性能、生物相容性、生物降解和清除等特性,总结GO作为涂层、控释材料和复合支架在骨组织工程中的最新应用,并对其未来研究方向进行展望。
干细胞移植是一种有潜力的替代治疗方案,虽然大量实验模型研究已经证实了干细胞移植能够修复受损或退化的组织并恢复其功能,但是在实际治疗中仍面临诸多困难,如免疫排斥、伦理障碍以及致瘤性等。围产期干细胞可以解决干细胞治疗所面临的问题,被认为是潜在的可靠干细胞来源。与其他干细胞相比,人羊膜来源干细胞(human amniotic stem cells,hAMSCs)具有显著优势。动物实验发现,hAMSCs具有高分化潜能以及免疫调节活性,在妇科疾病、神经系统疾病、肾脏疾病、肺部疾病、皮肤疾病、糖尿病、癌症等多种疾病的治疗中表现出了巨大潜力。随着科学的进步以及临床的迫切需求,hAMSCs的临床应用也逐渐突破了传统治疗的局限性。综述hAMSCs生物学研究进展及应用潜力,以期为hAMSCs的实验研究和临床应用提供理论依据。
光遗传学技术是将遗传学技术与光控技术相结合,利用光源控制生物过程的一项全新技术。光控表达系统是基于光遗传学技术与合成生物学方法相结合的策略,将光作为感测模块与生物体内已有的基因模块组合构成全新的基因回路,通过光信号动态调控基因表达的系统。该系统是一种低成本、低毒性、高灵活性的新型动态调控开关,对基因精准调控的同时还能有效解决能源短缺问题。目前,该系统已经成熟地应用于疾病诊疗、材料合成等领域,同时也极大促进了微生物代谢及合成生物学的发展。光受体是光遗传学技术中不可缺少的工具元件,根据不同生物光受体的感光特性,介绍用于控制基因表达的光调控系统,重点分析其在调控微生物系统内基因表达、代谢途径和药物递送中的应用,探讨光遗传学技术在合成生物学应用中可能存在的问题及未来发展前景。
随着后基因组时代的到来,简单高效的基因编辑工具和方法在研究微生物的基因表达调控、工程菌株的遗传改造等方面发挥了巨大作用。反选标记法是基于同源重组原理进行基因敲除的一种便捷高效的方法,该方法通过选择性的遗传标记的丢失和回补,实现对靶基因的敲除或目的基因的插入等分子遗传操作。这种选择性的遗传标记一般不依赖于传统的抗生素筛选标签,且同一反选标记能够反复使用,可连续进行多轮遗传操作,实现对多个基因靶位点的分子编辑。对近年来反选标记基因的种类、作用原理及在微生物基因敲除实验中的应用进行综述,以期为高效、可靠的分子编辑方法的研究提供参考。
微生物细胞中的大部分酶促反应都需要各种辅因子的参与,辅因子平衡对维持细胞内的生化反应稳态非常重要,辅因子供应不足会导致细胞生长和化合物生产的紊乱。近年来,辅因子在生化反应过程中的关键作用备受关注,但由于其价格较昂贵、稳定性差,因此限制了辅因子工程的发展。合成生物学和代谢工程的发展为辅因子的可持续供应提供了可行的解决方案,多种加强辅因子供应的策略有效地推动了目标化合物的生物合成。其中,烟酰胺类辅因子NAD(P)+、NAD(P)H是微生物代谢过程中最常见的氧化还原辅因子,它们在所有生物体内作为重要的电子受体或供体推动合成与分解代谢反应,对维持胞内氧化还原动态平衡起着决定性作用。从NAD(P)H的主要来源和NAD(P)+/NAD(P)H的平衡对天然产物生物合成中的影响出发,重点从三个不同维度讨论辅因子工程策略,综述代谢途径调节、外源氧化还原酶的引入、蛋白质工程等多种辅因子再生策略的最新研究进展及应用,展望辅因子代谢工程在生物合成中的未来发展方向。
全细胞催化作为生物催化的一个重要分支,以完整的细胞为催化剂,避免了细胞裂解和酶纯化步骤,极大地削减了生产成本。同时,细胞壁成分可以保护胞内酶不受外界环境的影响,能够满足对催化剂的低成本和高稳定性的要求。对适宜乙醇、二醇、糖醇等醇类物质生产的菌株以及目前食品、化工工业中利用细胞催化技术生产醇类物质的应用进行综述,探讨提高醇类物质产量的生产策略,以期为细胞催化转化生产醇类物质的研究与工业开发提供参考。
