近年来,基于抗体药物的被动免疫策略在人类免疫缺陷病毒(HIV)预防和治疗中获得一定的成效,但仍需要定期补充抗体,才能维持体内长期有效的药物浓度,如何延长抗体药物的作用时间是亟待解决的问题。根据乳酸杆菌的食品安全性和黏膜定植稳定性,把HIV单链抗体连接到具有宿主同源启动子和信号肽的乳酸杆菌表达质粒pldhl0373中,电转化乳酸杆菌WCFS1感受态细胞,通过红霉素筛选出阳性单菌落,发酵培养后菌液经Western blot检测证明了单链抗体得到表达,并具有抗病毒能力。与野生型WCFS1菌株相比,重组菌体外生长能力未发生改变,发酵24h后菌液的CFU均可达到10 9/ml;单链抗体基因的插入不会明显改变重组菌黏膜细胞定植能力,每平方厘米单层上皮细胞可稳定定植10 5CFU的菌落。以宿主黏膜共生菌为媒介,在黏膜细胞表面实现抗病毒蛋白的长期稳定表达为预防HIV黏膜传播提供了一种新的思路。
热休克蛋白70(HSP70)作为一种分子伴侣,在环境毒理学中受到广泛研究。前期研究表明稀有鮈鲫HSP70基因(GrHSP70)表达量与五氯酚(pentachlorophenol, PCP)处理的浓度和时间在肝脏中呈现剂量/时间-依赖效应。为探究启动子在热休克蛋白70表达调控中的作用,根据已知的GrHSP70 cDNA序列,采用染色体步移技术克隆了GrHSP70的5'侧翼区的核苷酸序列。生物信息学分析从预测的转录起始位点(C)起的5'侧翼区域共1 487bp,潜在的转录因子结合位点包括雌激素响应元件(ERE)、Sp1结合位点(Sp1)、糖皮质激素响应元件(GRE)、TATA结合蛋白(TBP)、CCAAT/增强子蛋白结合位点(C/EBP)、Oct-1结合位点(Oct-1)、GATA转录因子结合位点(GATA-1)等。实验构建了含有启动子缺失片段的萤火虫萤光素酶(firefly luciferase)和海肾萤光素酶(renilla luciferase)报告基因表达载体,瞬时转染HeLa细胞后,利用双荧光活性检测确定获得的GrHSP70启动子具有启动活性,其核心启动位点位于转录起始点上游-1 487~-1 093bp。同时,用不同浓度PCP暴露成功转染了重组质粒(pGL-HSP70 promoter-Luc+)的HeLa细胞,培养24h后检测双荧光活性,与对照相比,随PCP浓度的增加,荧光活性均显著增加。说明在稀有鮈鲫肝脏中PCP会通过激活GrHSP70启动子来诱导GrHSP70表达,但PCP在稀有鮈鲫体内通过何种机制来调节HSP70的合成,仍然需要进一步研究。
背景 碱性蛋白酶(alkaline protease)是一种具有广泛用途的工业酶制剂,其发酵活力目前仍不能满足工业生产需要。目的 旨在通过优化启动子及其组合来提高Bacillus subtilis WB600 中碱性蛋白酶AprE的产量。方法 以Bacillus subtilis WB600 为出发菌株,成功构建了含有4种不同类型启动子(P1、P2、P-1-2、P-2-1)的碱性蛋白酶AprE表达菌株。结果 含不同启动子的4株重组菌均可成功表达碱性蛋白酶,发酵48h,含单一启动子P2的重组菌株表达碱性蛋白酶的活力为4 041U/ml,是P1的1.23倍。双启动子重组菌B.subtilis WB600/P-2-1-aprE表达的酶活性最高,是双启动子P-1-2的1.35倍,达到了6 125U/ml。结论 为工业化高产碱性蛋白酶提供了一种有效策略。
葡糖氧化酶(GOD)可催化葡萄糖生成过氧化氢和葡萄糖酸,在工业上被广泛应用。在构建的一株整合多拷贝GOD基因且含有HAC1表达单元的重组毕赤酵母G/GMH1的基础上,共表达分子伴侣二硫键异构酶基因PDI1和苹果酸脱氢酶基因MDH1,考察PDI1、MDH1基因与HAC1共表达后对GOD分泌表达的影响。这些基因共表达后对重组菌的生长无明显影响。PDI1和MDH1分别与HAC1共表达后,重组菌G/GMH1-PDI1和G/GMH1-MDH1的胞外GOD产量达到11 731.9U/g DCW和1 1047.6U/g DCW,比出发菌提高了17.3%和10.4%,前者达到了目前所报道摇瓶培养的最高单位菌体酶活水平。而三基因共表达重组菌G/GMH1-PDI1-MDH1的GOD产量略有下降。在所构建的菌株中,GOD基因的转录水平仅在G/GMH1-PDI1-MDH1中略有提高,与酶产量的提高无直接关系。与出发菌相比,共表达基因的转录水平在新构建的菌中有不同程度的升高,说明这些基因被成功转录。PDI1和MDH1基因转录在G/GMH1-PDI1和G/GMH1-MDH1中分别被上调,可能与GOD产量提高有关。虽然GOD、HAC1、PDI1和MDH1基因在G/GMH1-PDI1-MDH1中均被上调,但并未促进酶产量的提高。
目的 尿嘧啶DNA糖苷酶UDGase是一种广泛应用于qPCR、二代测序等领域的工具酶,由于其应用特性,只有热敏性UDGase才具有较大开发利用潜力。目前全球热敏性UDGase工具酶仅有2个物种来源,均有专利保护且价格昂贵,亟待开发新来源且具有优良热敏特性的UDGase。方法 根据前人研究及序列分析推测大菱鲆(Scophthalmus maximus)具有热敏性UDGase。经验证,大菱鲆肝脏匀浆呈现UDGase活性。从大菱鲆肝脏匀浆克隆得到大菱鲆UDGase基因SmUDGase,并使用大肠杆菌工程菌株实现重组表达,分离纯化后进行活力表征检测。结果 序列比对结果表明,SmUDGase基因克隆成功。重组表达并经亲和层析、离子交换层析分离纯化,获得纯酶纯度约95%,产率1.51mg/L,比活力2 295.08U/mg。SmUDGase具有热敏性,在40℃时酶活即开始迅速降低。其他酶学性质,如pH适应范围、金属离子依赖性和对抑制剂的敏感性均与当前商业化UDGase一致。结论 成功克隆并鉴定来自大菱鲆的新来源SmUDGase,该酶具有热敏感性,酶学特性接近目前商业化UDGase。并探索该酶的重组表达和纯化工艺,所得纯酶基本达到商业化生产水平,为该类型生物工具酶的开发提供了理论参考和技术储备。
在真核细胞中,内质网、高尔基体、质膜等膜结构间的蛋白质运输主要通过囊泡出芽和融合实现。SNARE蛋白家族在介导囊泡与目的膜结构融合过程中发挥关键作用。在模式生物酿酒酵母中,对全基因组SNARE蛋白的系统研究仍有不足。此研究构建了一套用于标记酿酒酵母基因组全部24种SNARE的工具质粒。该系列质粒既能呈现出良好的定位特征,又避免了过度表达造成的定位异常。通过与细胞器标记共定位验证了SNARE蛋白的亚细胞定位。结果发现3种SNARE的定位与之前报道不符:Bos1定位于早高尔基体,Snc1和Bet1定位于晚高尔基体/早内体。另外,Sec9定位于芽尖和芽颈,这是首次观察到Sec9在活酵母细胞中的定位。这项工作首次全面的检验了酵母SNARE家族蛋白的亚细胞定位,为后续SNARE蛋白功能研究提供了新线索,并为相关研究提供了一套工具质粒。
首先构建了5株表达NADH依赖型谷氨酸脱氢酶的大肠杆菌基因工程菌,获得来源于Amphibacillus xylanus的谷氨酸脱氢酶AxyGDH。其最适温度为60℃、最适pH为8.0,该条件下比酶活达到(903.1±24.6)U/mg,酶活半衰期为167h。其次,确定了表达AxyGDH的大肠杆菌基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET-28a(+)-AxyGDH的产酶条件:诱导剂IPTG浓度为0.7mmol/L、诱导温度为25℃;优化后的培养基组成为:甘油11.3g/L,酵母粉16.3g/L,MgSO4·7H2O 0.62g/L,NaCl 0.5g/L,Na2HPO4·12H2O 17.1g/L,KH2PO4 3g/L,NH4Cl 1.5g/L。最后,在10L发酵罐中控制比生长速率为0.2h -1进行补料分批发酵,所得AxyGDH的发酵酶活为(9 066±45)U/ml,是LB摇瓶发酵酶活的51.1倍,为谷氨酸脱氢酶的低成本生产奠定了基础。
以组氨酸营养缺陷型菌株构建为例,在前期分离、诱变和筛选得到的安琪酵母工业菌株衍生菌株K-a中试用CRISPR-Cas9系统进行基因修饰。针对菌株K-a为单倍体、ura3和对潮霉素B敏感的特点,构建了以URA3为选择标记的Cas9表达载体YCplac33-Cas9、以hphNT1为选择标记的gRNA表达载体pRS42H-gHIS1,使用PCR方法合成donor DNA片段。使用醋酸锂法制备感受态细胞K-a (YCplac33-Cas9)、将pRS42H-gHIS1和donor DNA共转化,涂布(CMG -URA+300μg/ml潮霉素B)平板,经表型筛选和PCR产物测序证明筛选平板生长菌落为目的转化子K-a (his1)的比例为74.4 %,初步建立了适于利用CRISPR/Cas 9系统进行基因修饰的工业菌株宿主平台和相应的简便、快速进行基因修饰的操作技术流程。
α-葡糖苷酶以低聚寡糖为底物,通过切割非还原末端α-1, 4糖苷键以获得葡萄糖基,同时转苷生成α-1, 6糖苷键,广泛应用于低聚异麦芽糖生产、代谢生理研究、疾病预防治疗等各个领域。Aspergillus nidulans来源的α-葡糖苷酶在毕氏酵母中外源表达时存在酶活较低、蛋白质降解等问题,为进一步提高α-葡糖苷酶表达量,共表达N-乙酰转移酶(Mpr1)以降低发酵过程细胞受到的氧化胁迫,提高酶活。以实验室保藏的P.pastoris KM71/pPIC9K-AgbB为出发菌株,构建共表达菌株Pichia pastoris KM71/pPIC9K-AgbB/pPICZA-Mpr1,经过摇瓶发酵120h,α-葡糖苷酶转苷酶酶活和蛋白质含量可达22.56U/ml和0.52mg/ml,分别是出发菌株摇瓶产酶的1.92倍和1.27倍。在此基础上进行3.6L罐发酵温度和甲醇诱导浓度优化,在25℃,以1%的甲醇浓度诱导发酵最高酶活和蛋白质含量可达128.12U/ml和1.81mg/ml,分别是起始菌株上罐产酶的1.96倍和1.50倍。
生物大分子药物与传统治疗方式相比作用靶点具有高度的专一性,成为21世纪药物研发中最具发展前景的领域之一,但由于细胞膜的天然屏障作用致使许多潜在的胞内药物靶标无法应用于新药研究。细胞穿膜肽(cell-penetrating peptides,CPP)是一类具有穿膜功能的小分子短肽,可高效携带核酸、蛋白质等生物大分子穿过细胞膜进入胞质发挥功能,在介导生物大分子药物入胞上有着高效、低毒等诸多优势,但仍存在效率低、靶向性差等问题。CPP携带货物分子入胞的方式可以根据是否依赖能量分为直接入胞和内吞。直接入胞依据孔隙形成的方式不同分为四种模型:桶板模型、超环面模型、地毯模型和反向胶团模型。内吞则根据受体的不同又分为巨胞饮、网格蛋白介导的内吞、小窝蛋白介导的内吞、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖介导的内吞以及神经毡蛋白-1介导的内吞。CPP自身的类型、浓度、效应分子的物理化学性质以及分子大小都会影响CPP的入胞过程,进而决定CPP携带生物大分子入胞的途径。对CPP介导生物大分子的入胞机制进行综述,为研究更加高效、靶向性强的CPP提供依据,从而推动其在生物、医学领域的应用。
与常规治疗药物相比,抗体药物具有靶向性强、特异性好等优点,其作为一类重要的治疗性药物,近年来在临床中的应用逐渐增多,为疾病的治疗提供了新的选择,应用范围逐渐从肿瘤、自身免疫性疾病及慢性炎症扩展到心血管和感染性等疾病中。人源抗体的全部结构是由人类抗体基因所编码的,因此避免了异种蛋白长期应用引起的不良反应,加之人源抗体制备技术的不断发展完善,使其逐渐成为治疗性抗体研发的首要选择。综述了近年来治疗性人源抗体的主要制备技术及其在临床中应用的最新进展,同时探讨了人源抗体制备技术的不足之处,以期为人源抗体的发展提供借鉴和思路。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的重要跨膜受体,在多种恶性肿瘤中异常表达,与肿瘤细胞增殖、分化、转移等生命活动密切相关。EGFR已成为治疗肿瘤的靶点,针对该靶点设计的药物主要分为单克隆抗体和小分子抑制剂两大类,小分子抑制剂易导致EGFR出现突变而产生耐药现象,从而影响其临床应用。突变主要发生在酪氨酸激酶区域ATP结合位点附近,主要为19号外显子上的缺失突变,18号和21号外显子上的点突变。针对近几十年来国内外研究者对EGFR出现的耐药突变类型,及其与小分子抑制剂的相互作用方式进行综述,以期为后续EGFR靶点药物的研发提供参考。
以单克隆抗体药物(monoclonal antibodies,mAbs)为代表的生物制品药物销售在不断扩大,并呈现持续上升势头,mAbs的使用为疾病治疗提供了新策略。随着mAbs使用量增大,对产品质量提出了更高要求,随着宿主细胞表达mAbs水平的不断提高,宿主细胞蛋白(host cell proteins,HCP)含量也随之增加,上下游生产工艺面临不断挑战。 HCP所含蛋白质异常复杂,虽然一些HCP可能会被降解,但残留HCP仍会引起药物临床使用中的不良反应,从而影响药物的安全性和有效性。酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunesorbent assays,ELISAs)是目前HCP检测的重要方法之一, ELISAs可以定量检测药物中总HCP含量,但存在局限性。对正在开发的包括LC-MS / MS在内的多种分析方法进行HCP检测,将为药物工艺过程开发和验证提供更多依据。讨论了以CHO(Chinese hamster ovary,中国仓鼠卵巢)细胞系为宿主的mAbs生产中, HCP 的质量控制及检测分析方法的研究进展。
硅纳米线场效应管(silicon nanowire field-effect transistor,SiNW-FET)生物传感器已成功用于蛋白质、核酸、糖类等多种生物分子的检测,并且具有超高灵敏度、高特异性、免标记、即时响应等检测优点。但是,半导体器件德拜屏蔽效应的存在严重影响SiNW-FET生物传感器对血液样品中生物分子检测的灵敏度,尤其对于蛋白质分子的检测,并且其在很大程度上阻碍了SiNW-FET生物传感器的实际应用。目前有效克服德拜屏蔽效应并实现血液样品中蛋白质分子检测的方法主要包括稀释法、去盐法、目标蛋白提纯法、应用渗透性生物分子聚合物层法、裁剪抗体法和适配子替代法。
