2017年, 第37卷, 第7期　
刊出日期：2017-07-25

  

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中国生物产业大会专题
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  大力培育发展生物产业加快建设生物经济强国

  林念修

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 1-2. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170701

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  在第十届中国生物产业大会暨首届官洲国际生物论坛开幕式上的致辞

  高福

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 3-4. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170702

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  着力推进生物产业供给侧结构性改革

  王昌林, 韩祺

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 5-8. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170703

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  2016年生物产业发展回顾与2017年展望

  任志武, 沈竹林, 李新, 韩祺

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 9-11. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170704

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研究报告
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  PHP14沉默对肺癌细胞凋亡的影响及其机制

  徐安健, 李艳萌, 李斯文, 乌姗娜, 张蓓, 黄坚

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 12-17. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170705

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  目的：在肺癌细胞中沉默PHP14，并研究其对肺癌细胞凋亡的影响及其可能机制。方法：利用shRNA稳定沉默肺癌细胞株A549中PHP14的表达，并利用Annexin V、PI双染和流式细胞仪检测细胞在正常培养条件下和凋亡诱导条件下的凋亡情况；通过皮下接种裸鼠，探讨PHP14沉默对肺癌细胞体内成瘤的影响，并利用Realtime-PCR和Western blotting检测PHP14沉默后凋亡相关基因的表达情况。结果：成功获得了PHP14稳定沉默的肺癌细胞株，发现PHP14沉默可促进肺癌细胞诱导性凋亡，并抑制肺癌细胞的体内成瘤能力，并且发现PHP14沉默对肺癌细胞凋亡的影响可能是通过抑制Bcl-2表达实现的。结论： PHP14沉默可促进肺癌细胞诱导性凋亡，并可能通过抑制Bcl-2影响肺癌细胞凋亡。
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  细菌性腹泻三联口服疫苗的研制及其免疫效果的初步评价

  刘地, 晏婷, 何秀娟, 郑文云, 马兴元

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 18-26. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170706

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  由细菌引起的感染性腹泻，至今仍是世界范围广泛流行的传染病之一。由于耐抗生素病原菌的不断涌现，导致了抗生素药物的治疗效果不佳。因此，研发便捷、有效的疫苗对于细菌性腹泻的预防与治疗尤为重要。针对产肠毒素大肠杆菌、霍乱弧菌与志贺氏痢疾菌这三种最为主要的细菌性腹泻病原菌，设计和筛选了以热不稳定肠毒素亚基蛋白为抗原和黏膜佐剂、霍乱弧菌鞭毛蛋白及志贺毒素亚基蛋白为抗原的三联疫苗。通过工程大肠杆菌获得了相应的抗原与佐剂蛋白，并以海藻酸钙-壳聚糖微球为疫苗的口服载体，制备了疫苗的口服制剂。体外实验表明，微球载体中的蛋白质在模拟胃液中释放较低，但在模拟肠液中释放迅速，这种载体能够实现疫苗在肠道内定向释放的目的。通过对灌胃免疫后小鼠免疫指标的检测，证明了疫苗能够刺激机体产生抗原特异性的sIgA与IgG抗体，免疫组与对照组相比，差异显著（P<0.05），并提升了外周血中CD4⁺T细胞的含量（7.5%~9.5%）与CD4⁺T/CD8⁺T细胞的比率，有效地激活了机体的黏膜免疫与系统免疫，能够对机体起到保护作用。
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  人巨细胞病毒抗原表位的重组表达及免疫原性分析

  王蒙, 孙文辉, 姬芳玲, 蒲中机, 李寅生, 包永明

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 27-33. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170707

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  目的：用大肠杆菌表达系统表达人巨细胞病毒（HCMV） pp65蛋白和gB蛋白的优势抗原表位基因，制成HCMV亚单位疫苗，探究其在Balb/c小鼠体内的体液免疫和细胞免疫活性。方法：选取pp65蛋白的490~508aa和gB蛋白的607~621aa的基因片段，经PCR扩增目的片段，连接表达载体pET-32a（+），转化BL21（DE3） plys菌株，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（SDS-PAGE）分析蛋白质表达，金属螯合亲和镍柱法纯化目的蛋白。重组蛋白免疫Balb/c小鼠，Western blotting法和间接ELISA法检测重组蛋白的体液免疫活性；通过流式细胞仪和双抗夹心ELISA法检测重组蛋白的细胞免疫活性。结果：获得分子质量约为22kDa的融合蛋白，Western blotting检测显示抗体有特异性，间接ELISA法检测其效价为1 ∶102 400。与对照组相比，实验组小鼠外周血中CD4⁺ T细胞和CD8⁺ T细胞的数量，以及IFN-γ、IL-2、IL-12的含量有显著提高（P<0.01）。结论：制备的具有免疫优势抗原表位的重组蛋白能诱导小鼠产生较强的体液免疫和细胞免疫反应。
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  黄芪多糖免疫草鱼母本对子代IgM、C3和LSZ表达特性研究

  周智愚, 王荣华, 金生振, 王红权, 肖调义

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 34-41. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170708

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  为探究黄芪多糖免疫草鱼母本所产子代早期发育阶段体液免疫因子IgM、C3和LSZ的表达特性及代间传递效率。采用ELISA、RT-qPCR等方法分析了饲喂黄芪多糖草鱼母本血液及其子代早期发育阶段3种免疫因子的蛋白质活性及mRNA水平。结果显示，黄芪多糖免疫草鱼母本血液中IgM、C3和LSZ蛋白活性均显著高于对照组。在子代早期阶段中，3种免疫因子蛋白活性呈先下降后上升趋势，实验组IgM蛋白活性在各阶段均显著高于对照组，在卵子、5d和28d仔鱼中分别提高了2.2倍、1.7倍和1.8倍。实验组C3活性在卵子、24h胚胎分别提高了1.9倍和1.6倍。实验组LSZ活性在卵子、5d和28d仔鱼中分别提高了2.4倍、2.0倍和1.9倍；在卵子和受精卵时期3种免疫因子mRNA水平显著高于对照组。在24h胚胎至5d仔鱼没有检测到IgM和LSZ mRNA，而在14d后3种免疫因子的mRNA均呈上调表达，但IgM和C3 mRNA水平与对照组无显著差异。GCRV攻毒后，实验组2月龄草鱼脾脏和头肾中IgM mRNA水平显著高于对照组。结果表明，黄芪多糖能够提高草鱼母本免疫能力并向子代垂直传递，在应对GCRV感染时发挥一定免疫保护作用。
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  密码子优化后的αB-晶状体蛋白基因毕赤酵母重组质粒的构建及表达的初步研究

  冯雪, 高香, 牛纯青, 刘堰

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 42-47. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170709

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  αB-晶状体蛋白属于小热休克蛋白家族，具有分子伴侣活性。在阿尔茨海默病大脑中，星形胶质细胞表达的αB-晶状体蛋白明显上调，并且这些上调的αB-晶状体蛋白紧密地分布在β-淀粉样蛋白沉积周围。为了在分子水平上研究胞外αB-晶状体蛋白在阿尔茨海默病中的作用机制，需要获得大量具有生物学活性的αB-晶状体蛋白。根据毕赤酵母密码子偏好性对人αB-晶状体蛋白基因进行优化，并在目的基因3'端加上6个组氨酸标签，优化后的基因克隆到巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）表达载体pPIC9K上；电转入毕赤酵母GS115中；优化确定最佳表达条件为：BMGY与BMMY的转接比为2 ∶1，表达时间为72h，甲醇补加终浓度为0.5%；经Western blotting鉴定，获得20kDa的目的蛋白，以及18.6kDa和13.1kDa两个蛋白质片段，重组目的蛋白出现了部分降解，纯化获得20kDa目的蛋白；利用胰岛素还原法测定该片段具有分子伴侣活性，为进一步研究外源αB-晶状体蛋白在阿尔茨海默病中对星形胶质细胞的保护机制奠定基础。
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  巴斯德毕赤酵母甘油转运体的发现及功能研究

  战春君, 李翔, 刘国强, 刘秀霞, 杨艳坤, 白仲虎

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 48-55. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170710

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  目的：分离确认巴斯德毕赤酵母中甘油转运体并初步研究其功能。方法：通过生物信息学方法从NCBI数据库中查找可能的甘油转运体（gt1，GeneID：8197545），并通过DAS软件对其跨膜结构域进行预测。通过PCR方法扩增该基因并将其与EGFP融合克隆到pPICZ B及pRS424载体进行亚细胞定位；同时将其与pRS424载体连接后电转到粟酒裂殖酵母中进行异源表达确定其功能；通过同源重组敲除gt1基因并在不同培养基中培养测定aox1基因表达量。结果：生物信息学显示与酿酒酵母中已经证明的甘油转运体（sugar transporter 1，stl1）类似，GT1蛋白同样为具有疏水结构域的跨膜蛋白，同时亚细胞定位结果显示GT1蛋白定位于细胞膜上，包含有gt1基因的粟酒裂殖酵母可以在以甘油作为唯一碳源的培养基中生长而野生型不可以；在Δgt1突变体中aox1基因可以获得组成型表达。结论：分离并确认了巴斯德毕赤酵母中的甘油转运体GT1，并初步证明其与aox1基因甘油阻遏相关。
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  CodY在单核细胞增生李斯特菌运动和毒力方面的作用

  张颖, 汤雨倩, 沈怡, 罗勤

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 56-63. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170711

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  目的：探究全局性转录调控因子CodY在单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，Lm）鞭毛运动和细菌毒力方面的作用。方法：通过同源重组的方法敲除Lm染色体上CodY的编码基因codY并成功构建缺失菌株的回复菌株；利用平板泳动法观测鞭毛运动的变化，RT-qPCR检测与鞭毛运动相关基因的转录表达；比较野生型菌株EGDe与CodY缺失菌株对细菌溶血活性、棉铃虫幼虫的半致死剂量和主要的毒力因子LLO和毒力基因调控蛋白PrfA转录表达的影响。结果：同野生型菌株相比，CodY缺失菌株鞭毛运动和相关基因，以及主要的毒力因子LLO和PrfA的转录表达显著降低（P≤0.01），溶血活性显著降低（P≤0.01），对棉铃虫幼虫的半致死剂量上升了5.8倍。结论： CodY在Lm鞭毛运动和细菌毒力调控方面具有重要作用。
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  同源过表达BglR对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性的影响

  来亚鹏, 邓婷婷, 刘刚, 王娟

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 64-71. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170712

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  目的：克隆嗜热毁丝霉（Myceliophthora thermophila ATCC42464）bglr基因，构建Mtbglr过表达载体，研究同源过表达bglr对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性及总纤维素酶活性的影响。方法：利用SLIC技术构建Mtbglr过表达载体；使用MtPpdc启动子及MtTpdc终止子将该基因进行同源过表达；利用原生质体转化、实时荧光定量PCR和酶活测定等技术实现bglr基因在嗜热毁丝霉中表达及酶活水平的鉴定。结果：成功构建Mtbglr过表达载体，并转化嗜热毁丝霉，结果表明，诱导培养条件下，转化子Mt8菌株的β-葡萄糖苷酶活性和胞外蛋白质浓度分别是WT菌株的1.7倍和1.9倍。结论： bglr基因对嗜热毁丝霉β-葡萄糖苷酶活性具有增强作用，为嗜热真菌β-葡萄糖苷酶基因调控奠定了理论基础。
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  进化与未进化小球藻响应苯酚的转录组学分析

  周琳, 汪靓, 高娟, 赵权宇, 魏伟, 孙予罕

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 72-79. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170713

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  苯酚是工业废水中典型的环境污染物。小球藻（Chlorella sp.）由于其生长快、抗逆性强，可以有效利用废水中的酚类化合物，是最有潜力的含酚废水处理藻株。但是高浓度苯酚产生的氧化压力会造成小球藻细胞的氧化损伤。通过实验室适应性进化已经得到了可以耐受500mg/L苯酚的小球藻藻株（L5）。通过无参比较转录组学数据，在基因组尺度上考察了原始小球藻（L3）和进化后小球藻对高浓度苯酚的响应差异。无参比较转录组学结果表明，进化后小球藻能够耐受并降解高浓度苯酚是多个代谢途径整体调控的结果。相比于原始小球藻，进化后小球藻在500mg/L苯酚浓度下对苯酚氧化胁迫的响应增强，主要体现在细胞信号转导、ABC转运蛋白、热休克蛋白、氮代谢和三羧酸循环（TCA）等相关的转录水平明显上调。进化后小球藻通过这些响应降低高浓度苯酚产生的氧化压力。
技术与方法
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  位点特异整合微环DNA的体内制备

  聂永强, 马海燕, 马晴雯

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 80-87. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170714

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  目的：应用诱导表达的LR克隆酶系统，建立一种在细菌体内获得基于链霉菌噬菌体ФC31整合酶系统的位点特异整合型微环DNA的方法，为实现无细菌骨架等冗余序列的转基因奠定基础。方法：构建包含阿拉伯糖启动子的LR克隆酶系统和ФC31整合酶系统的亲本质粒，在L-阿拉伯糖的诱导下重组产生表达ФC31整合酶的微质粒和包含有目的基因和attB位点等元件的微环DNA。以限制性内切核酸酶酶切电泳定性其重组效率，qPCR定量分析微环、微质粒及亲本质粒的比例，定量计算重组效率。观察随着诱导时间的推进微环/微质粒值的变化。结果：细菌体内LR克隆酶系统可有效催化亲本质粒的重组，重组率达85%以上。相比商品化LR克隆酶体外反应具有更高的稳定性而且更经济。结论：获得了一种高效、稳定的细菌体内产生位点特异性整合型微环DNA的亲本质粒。
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  人源Alu RNA工程菌的构建和表达

  尹舒贤, 赵月华, 刘超, 吕占军, 王秀芳

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 88-96. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170715

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  目的：外源RNA导入细胞特异性上调或下调基因表达，目前外源RNA的制备方法主要有化学合成、体外转录、细胞提取。Alu DNA和Alu RNA是人基因组和转录组中最重要的成分，参与基因表达调节。建立工程菌制备基因工程人源Alu RNA（Alu RNA）的技术，所提取的RNA满足一般生物学实验要求。方法和结果：将人Alu序列插入pET-28α质粒（pET），转化BL-21菌，探讨不同条件对Alu RNA产生的影响。用pET-Alu×8质粒转化BMBL-21（DE3）感受态细胞（简称DE3），异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导减弱细菌生长；用IPTG诱导2h、4h、6h、8h、10h、12h、14h和16h，用Northern杂交检测Alu RNA的量，发现诱导4小时RNA产量最高；1、2、4、8、14拷贝的Alu序列插入pET，转化DE3菌，随拷贝数增加Alu RNA产量上升；pET-Alu×8 DE3菌液，不加IPTG诱导，没有Alu RNA产生，0.1~0.4mg/ml IPTG诱导时，Alu RNA产量没有区别，偏离该浓度时，RNA产量略下降；34℃、37℃和40℃培养pET-Alu×8 DE3菌液，IPTG诱导4h，在37℃培养条件下，RNA产量最高；将pET-Alu×8质粒转化3种BL-21感受态细胞，包括DE3、BMBL21-DE3-pLysS（简称pLysS）和Trans BL 21（简称TransBL），发现转化DE3感受态细胞后Alu RNA产量最高。结论：建立了基因工程制备Alu RNA的技术：pET-Alu×14质粒转化DE3菌，37℃培养至600nm OD为1.0时，加入终浓度为0.2mg/ml的IPTG诱导4h，获得最高Alu RNA产量，纯Alu RNA在提取的RNA中的含量达15.8%，每100ml菌液纯Alu RNA产量平均为0.46mg。
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  基于IRES序列的多基因共表达载体构建

  田聪慧, 谢雪梅, 李英, 尹晓东, 韩军, 李军

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 97-104. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170716

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  目的：构建一个IRES序列介导的多基因共表达载体，实现两个目的基因和筛选标记基因共用一个启动子高效表达，提高多基因稳定共表达细胞株的筛选效率。方法：以实验室前期构建的载体pLV-MCS-Puro为骨架，设计并全基因合成双基因克隆表达元件，连接到骨架载体，构建多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro，以DsRed2和EGFP荧光蛋白基因验证该载体用于多基因稳定共表达细胞株筛选的效率。结果：成功构建了pLV-2MCS-Puro载体以及DsRed2和EGFP共表达重组质粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬时转染实验证明该载体能介导多基因共表达。抗性筛选获得了MDCK和HeLa两种细胞的多基因稳定共表达细胞池。细胞池涂片荧光显微镜观察和计数表明抗性细胞池DsRed2和EGFP双阳率接近100％。基因组和转录水平PCR及蛋白质免疫印迹实验表明，DsRed2和EGFP稳定整合到抗性细胞基因组，并且两种蛋白质表达水平较为一致。结论：成功构建了多基因共表达载体pLV-2MCS-Puro，实现了两个目的基因和抗性基因串联共表达，并且具有高效的多基因稳定共表达细胞株筛选效率。该载体在研究蛋白质相互作用及工程细胞构建等方面具有一定的应用前景。
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  以大肠杆菌为底盘细胞构建XylR-Pu线路检测2,4,6-三硝基甲苯

  温国霞, 黄子豪, 谭俊杰, 阚乃鹏, 凌婧怡, 张霞, 刘刚, 陈惠鹏

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 105-114. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170717

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  目的：恶臭假单胞菌中的TOL质粒上的XylR-Pu是经典的甲苯代谢通路，在甲苯类化合物存在时，调控蛋白XylR可以特异性的激活Pu启动子，进而启动相应甲苯代谢通路的表达。基于合成生物学的思想，优化设计此通路并导入遗传背景清楚、操作简单的大肠杆菌中构建全细胞生物传感器，用于检测环境污染物2，4，6-三硝基甲苯（TNT）。方法：以pETDuet-1为载体骨架，构建了XylR-Pu基因线路，并以绿色荧光蛋白GFP为报告分子，GFP的荧光值可以指征结合诱导剂后的XylR蛋白对Pu启动子的诱导强度，并在基因线路中加入四串联终止序列来降低背景值。最后对XylR蛋白的信号识别区进行连续易错PCR，构建随机突变体文库，从中筛选具有更高感应强度、更好灵敏度及特异性的调控蛋白。结果：四串联终止序列可有效降低XylR-Pu通路的背景值，随机突变体文库中筛选出的生物元件eX0-4，对TNT表现出良好的感应强度、灵敏度及特异性。结论： XylR蛋白在大肠杆菌中对硝基甲苯响应不明显，但筛选得到的突变蛋白eX0-4，为后续生物传感器的更深层次地开发提供了优良的元件储备。另外，利用易错PCR构建随机突变体文库从中筛选发挥预定功能的突变蛋白质也可成为挖掘生物元件的一种通用方法。
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  融合酰基载体蛋白可增强大肠杆菌重组蛋白的可溶性和热稳定性

  刘延娟, 李旭娟, 袁航, 刘娴, 高艳秀, 龚明, 邹竹荣

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 115-123. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170718

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  目前，蛋白质可溶性和热稳定性已成为重组蛋白高效生产、功能应用和长久保存不可回避的问题，而使用酸性蛋白融合标签可能是其有效解决策略。酰基载体蛋白（ACP）是脂肪酸生物合成途径的必要组分，在大肠杆菌中为一个高度酸性的小分子多肽。将大肠杆菌ACP与几个热不稳定的靶蛋白进行基因融合并使其在大肠杆菌中诱导表达，发现ACP融合能显著增强这些重组靶蛋白的可溶性。另外，对重组蛋白的热处理和酶活性分析发现，融合ACP还能极大提高这三个靶蛋白的热稳定性，并有效保护JcAPX1酶活免遭热失活，使其耐热性提高了至少2℃。ACP的这种效果推测可能与其高酸度特性有关，可以作为一个新的功能酸性融合标签。
综述
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  金属离子对细胞自噬的诱导作用

  李生

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 124-132. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170719

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  自噬是真核生物普遍存在的重要生理过程，通过溶酶体降解错误折叠的蛋白质、异常的细胞器从而循环利用自身内含物。细胞自噬广泛参与多种病理和生理过程，是当前生物医学领域研究的热点之一。自噬的分子机制能够揭示自噬本质，不仅有利于理解自噬的生理意义，也有利于寻找新的药物靶点，为治疗疾病提供理论基础。金属离子能通过不同的信号通路诱导自噬，其研究对药物开发和疾病治疗具有重要的意义。主要从自噬的分子机制、金属离子的诱导作用两方面进行阐述。
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  微藻生物质成分检测方法评述

  孟迎迎, 姚长洪, 刘娇, 申培丽, 薛松, 杨青

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 133-143. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170720

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  不断发展的微藻产业需要统一可信的生物质检测方法体系来评估微藻研究、培养及生产中的各种生物质指标。对目前常用的微藻生物质组成的检测方法进行综述及评估，以期推动微藻产业的生物质分析平台标准化。
行业分析
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  行业分析罕见病药物市场与管理

  李敏, 吴日伟

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 144-150. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170721

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  罕见病，又称"孤儿病"，是指发病率极低的疾病，绝大部分属于先天性疾病、慢性病，且常常危及生命。近年来，随着公众认知度的提高、国家政策的支持、诊断及治疗技术的进步，罕见病药物市场逐渐发展起来，销售额逐年增加，出现多个"重磅炸弹"级药物。国际大型药企开始抢占罕见病药物市场并且加紧药物研发，目前正在研发的罕见病药物有500多个，主要针对罕见癌症、遗传性疾病、神经类疾病、传染性疾病和自身免疫性疾病等。发达国家和地区在罕见病管理及市场发展方面都已经比较完善，而中国在这方面还比较落后。对中国罕见病药物市场的发展困境进行了分析并提出了几点建议，希望能够促进国内罕见病药物市场的快速发展。
评论
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  谈转基因管理中的预防原则及其实施

  姜韬

  中国生物工程杂志. 2017, 37(7): 151-155. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170722

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