目的：利用SUMO标签构建人TNFα原核表达载体，通过表达及纯化获得重组蛋白，为深入研究和利用人TNFα奠定基础。方法：利用PCR技术，从质粒pET32a-hTNFα中扩增出人TNFα成熟肽编码序列，并在其上游添加SUMO标签，与原核表达载体pET28a连接，构建表达质粒pET28a-SUMO-hTNFα。在BL21（DE3）工程菌中表达融合蛋白，经Ni-NTA 纯化体系纯化，切除SUMO标签，纯化获得hTNFα成熟蛋白。CCK-8法检测TNFα对L929细胞的细胞毒性，以测定TNFα的生物学活性。结果：成功构建pET28a-SUMO-hTNFα原核表达质粒，酶切鉴定和测序分析与预期结果完全一致。在BL21（DE3）工程菌中实现了融合蛋白的可溶性表达。经纯化、水解酶切除标签及再次纯化获得hTNFα成熟肽。CCK-8法检测得所制备的TNFα蛋白ED50约为12.8 μg/ml。结论：成功构建原核表达载体pET28a-SUMO-hTNFα，经表达、纯化、酶切及再纯化，获得有生物活性的hTNFα蛋白，为深入研究和利用hTNFα奠定基础。
目的：构建骆驼蓬脂转移蛋白（lipid transfer protein from Peganum harmala，PhLTP）基因真核表达质粒，并探讨其对黑色素瘤B16细胞在体内外的抗肿瘤作用。方法：将PhLTP基因亚克隆至pcDNA3.1上，获得重组质粒pcDNA3.1-PhLTP；用脂质体转染法将重组质粒及空载体外转染B16细胞，MTT检测其对B16细胞生长的影响。建立B16荷瘤小鼠模型，设重组质粒（pcDNA3.1-PhLTP）、空载（pcDNA3.1）、生理盐水和阳性药物（CTX）组，分别处理小鼠后测量各组肿瘤体积并称瘤重，计算抑瘤率。光镜观察鼠脾、肝等组织变化；免疫组织化学法检测各瘤体中PhLTP、血管内皮生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的表达。结果：pcDNA3.1-PhLTP转染B16细胞72 h后，细胞增殖能力明显受到抑制（P< 0.01）。注射pcDNA3.1-PhLTP组的小鼠肿瘤生长速度明显减慢，肿瘤体积小于空载和生理盐水组（P< 0.05）。显微镜下可见重组质粒组肿瘤细胞有不同程度的点、片状坏死，而肝、肺等无明显病理损伤。重组质粒组肿瘤组织中有PhLTP蛋白的表达，且VEGF和bFGF的阳性表达指数都低于空载和生理盐水组（P< 0.01）。结论：成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1-PhLTP，体内外实验结果显示其能有效地抑制B16细胞的生长，预示了该重组质粒在治疗黑色素瘤中的潜在应用价值。
目的：观察活体染料羧基荧光素乙酰乙酸（CFSE）标记的人羊膜间充质干细胞对四氯化碳诱导小鼠肝损伤模型的定位修复情况。方法：采用胰蛋白酶-胶原酶消化法从羊膜组织中分离间充质干细胞，通过流式细胞术和免疫荧光等方法进行鉴定。模型组按浓度为20μl/g剂量的四氯化碳和橄榄油混合液诱导小鼠肝损伤，治疗组经小鼠尾静脉注射羧基荧光素乙酰乙酸标记的人羊膜间充质干细胞约1×106个/ml。分别取模型组和细胞移植的治疗组小鼠眼球血和肝组织进行相关检测。结果：分离得到纯度较高的羊膜间充质干细胞；冰冻切片免疫荧光显示移植1周后细胞向小鼠受损肝组织定植，CFSE标记的人羊膜间充质干细胞呈绿色荧光；细胞移植后4周，与模型组比较，细胞移植组小鼠血清中天冬氨酸转移酶、丙氨酸氨基转移酶显著降低，而白蛋白明显升高（P< 0.01）；肝组织病理切片模型组小鼠细胞水肿，坏死灶多见，脂肪变性，可见不同程度的炎性细胞浸润；治疗组小鼠肝组织病理学改变和损伤程度有较明显改善；小鼠肝组织冰冻切片的免疫荧光显示移植4周后人羊膜间充质干细胞周围分泌血清白蛋白。结论：羧基荧光素乙酰乙酸标记的人羊膜间充质干细胞可有效改善肝组织的生理功能，为细胞定位移植治疗肝脏疾病的修复情况提供实验数据。
目的：制备高效价、高特异性的抗CD133胞外区新疆双峰驼来源的多克隆抗体，为制备高亲和力的抗CD133纳米抗体做准备。方法：将CD133胞外区基因序列构建到原核表达载体pET28a中，诱导表达及纯化CD133蛋白，免疫新疆双峰驼及新西兰兔。通过酶联免疫吸附实验（ELISA）和Western blot检测多克隆抗体的效价及与CD133特异性结合活性。结果：ELISA测定抗-CD133骆驼源抗体的效价可达到百万以上，通过Western blot检测多克隆抗体可特异性结合CD133蛋白。结论：重组人CD133蛋白可以在骆驼体内激发高滴度抗体反应，为今后构建骆驼免疫单域抗体噬菌体展示文库奠定基础。
CcpA是革兰氏阳性菌中由ccpA基因编码的介导碳分解代谢物阻遏的全局调控因子。近年来的研究表明，CcpA不仅参与CCR效应，还直接或间接参与病原细菌毒力基因的表达调控。为探讨CcpA对单核细胞增生李斯特菌（Lm）毒力的影响，应用同源重组方法构建CcpA缺失菌株。以BLAB/c小鼠为实验动物模型，检测野生株EGDe和缺失株EGDeΔccpA侵染小鼠后的半数致死剂量 LD50和肝脾细菌载菌量，观察小鼠肝脏和脾脏的病理形态变化。结果显示：缺失CcpA后，Lm的LD50降低了10倍，虽然肝脾细菌载菌量没有显著变化，但EGDe△ccpA对小鼠肝和脾的损害更为严重，表明CcpA缺失增强了细菌的毒力，CcpA 对Lm 毒力基因的表达可能具有间接或者直接的调控作用。
黑曲霉具备优异的外源蛋白表达和分泌能力，从而被广泛应用于工业酶制剂的生产。通过研究黑曲霉突变株和野生株在相同培养条件下生理参数和代谢流的差异，确定了黑曲霉合成糖化酶过程中的限制性因素。宏观动力学分析发现，较之野生株，突变株具有较高的最大比生长速率，并且副产物得率降低了90%，底物利用率提高了近30%，表明突变株与野生株在碳源分配和产物转化率上具有明显的差异。利用流平衡分析（FBA）计算胞内代谢通量分布，发现还原力和核糖的供应水平是限制菌体合成的主要因素，而前体氨基酸是合成糖化酶最主要的限制性因素。这些研究结果为后续发酵工艺优化和菌株基因改造提供了有益的思路。
根据已知耐热甘露聚糖酶ManAd3氨基酸序列与毕赤酵母密码子使用偏爱性，设计并合成了甘露聚糖酶ManA全基因（Accession No. KJ806637），与表达载体pPIC9k重组后，转化毕赤酵母GS115，筛选获得重组菌株ManA-GS115。该重组菌株发酵产物经SDS-PAGE鉴定，其中甘露聚糖酶ManA含量达到电泳纯级别，分子量大小约为30 kDa。其酶学性质检测结果显示该酶最适反应温度为75℃，最适反应pH为6.0，比活力高达3200 IU/mg，并且在75℃下处理30 min仍能维持90%以上相对酶活力。该甘露聚糖酶ManA表达量较高，在偏酸性环境下仍能够维持较高的相对酶活力，且热稳定性显著，可广泛应用于食品、酿造、饲料、纺织和医药等工业领域。
碳水化合物水解酶家族在自然界碳素循环及农业废弃物中几丁质、纤维素等碳水化合物的生物质转化利用中发挥了重要作用。通过PCR技术从海洋链霉菌Streptomyces olivaceus strain FXJ 7.023 的fosmid基因组文库中成功克隆得到1个全长885bp的编码295个氨基酸残基的包含1个19个氨基酸残基的N-末端信号肽的壳聚糖酶完全编码区。系统进化分析表明该基因编码蛋白与已报道的Streptomyces sp. SirexAA-E来源壳聚糖酶csnA同源性为71%，与Streptomyces coelicolor A3（2）来源的csn46A同源性为70%。将该编码区重组入原核表达质粒载体pET32a并转化大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）plysS，添加IPTG 在18℃条件下振荡诱导该蛋白表达，Ni2+-NTA亲和纯化获得分子量为50.3 kDa融合表达蛋白TrxA-SoCsn。该融合重组蛋白在最适反应条件下对底物胶体壳聚糖和羧甲基纤维素的最大酶活分别为3.673U/mg和1.302U/mg，最适反应温度分别为37℃和50℃，最适反应pH分别为pH5.0和pH6.0。TrxA-SoCsn相关的研究结果表明该酶在农业废弃物生物质转化等方面具有一定的应用潜力。
脂肪酶（EC 3.1.1.3）是应用广泛的工业用酶。高效的脂肪酶产生菌是脂肪酶工业生产和应用的前提。通过基因的重新设计与合成技术优化了解脂耶氏酵母（Yarrowia lipolytica）脂肪酶YLL的密码子，并实现了其在毕赤酵母（Pichia pastoris）中的高效表达；通过高通量筛选策略获得了更高效的脂肪酶基因工程菌菌株SILVER。在14 L发酵罐条件下，菌株SILVER酶活达40 500 U/ml、蛋白质含量达2.52 g/L发酵液，为该类脂肪酶的产业化奠定了基础。
通过对顶头孢霉（Cephalosporium acremonium）FC-01进行诱变选育及特定种子培养基的优化，提高了头孢菌素C的发酵产量。分别采用紫外-氯化锂和钴-60（60Co）γ射线对FC-01进行诱变选育，筛选到高产菌株FC-1-4和FC-4-2，产量较出发菌株分别提高了26%和54.5%。运用Plackett-Burman设计方法和响应面法对种子培养基进行优化，头孢菌素C发酵效价较对照分别提高了34.7%和13.2%，优化后的种子培养基主要成分为玉米浆3.70%、葡萄糖2.62%和硫酸镁0.15%，得到的菌株及相应的种子培养条件已成功应用在160M3工业发酵罐生产中，具有重要的工业生产能力。
目的：将自合成的超支化聚合物固定到氨基硅球上形成一种新型的糖肽富集材料，用于糖肽的高效分离与富集。方法：阴离子开环聚合法合成的超支化聚缩水甘油，经高碘酸氧化成为超支化聚甘油醛（hyperbranched polyglycerol-aldehydes，HPG-ALD）后固定于氨基硅球上，再用己二酸二酰肼修饰得到的酰肼材料应用于糖肽富集。结果：经扫描电镜（Scanning Electron Microscope，SEM）、热重分析（thermogravimetric analysis，TGA）等手段证明材料被成功合成。同时，使用制备成功的新材料来富集标准糖蛋白和糖肽都获得了良好的富集效果。结论：实验证明超支化缩水甘油酰肼材料（hyperpolymer-assisted hydrazide functionalized microspheres，HHMs）可用于低丰度糖蛋白/糖肽的富集。
植物黄单胞菌病原细菌分泌的TAL效应子（Transcription activator-like effector）可结合特异的双链DNA。TAL是由序列几乎相同的多个DNA结合域的重复串联而构成的，每个DNA结合模块的重复可变双残基特异识别一个DNA碱基。TAL和核酸修饰相关功能域融合而成的定制TAL效应子（dTALE）能特定靶向修饰基因组DNA，在新近遗传工程中扮演重要角色。目前，TAL效应子与核酸酶FokI融合成的TALEN核酸酶（TALEN）能够靶向识别基因组位点并由核酸酶切割双链DNA造成双链断裂，通过同源重组（HR）或非同源末端连接（NHEJ）进行双链修复从而引发特定位点的基因突变。TALENs在多个模式生物中都具有较高的靶向有效性，而且TAL效应子DNA结合域可进行模块化设计，能够发展成高通量的基因靶向修饰和调控的平台，具有广阔的实际应用前景。对 TAL效应子特异识别DNA的结构分析、TALENs的设计策略以及TAL效应子在基因组靶向修饰中的应用与展望等方面进行了概述。
细胞中DNA甲基化和microRNA（miRNA）相互影响，并共同调控着下游靶基因的表达活性，在细胞生长代谢、免疫、肿瘤和心血管疾病等生理和病理过程中发挥重要作用。首先简要介绍DNA甲基化与miRNA的概况，然后分析了miRNA调控下的DNA甲基化改变，探讨了DNA甲基化影响miRNA的表达活性变化，并归纳了miRNA与DNA甲基化之间的反馈调控关系；最后对DNA甲基化和miRNA的应用前景进行了简单探讨。研究DNA甲基化与miRNA间的网络调控关系，可为表观调控机制在理论和实践中的深入研究和应用提供参考。
Red同源重组技术发展迅速，已经广泛应用于大肠杆菌基因的敲除、插入与替换。与传统的DNA有痕重组技术相比，基于Red重组原理的DNA无痕重组技术，能够更为精确、快速、高效地修饰大肠杆菌基因组中的目标基因，且在基因组中不残留任何外源片段，因此不会影响后续的基因操作与基因表达。从Red同源重组的原理出发，简要综述了近年来在大肠杆菌中广泛使用的无痕重组技术的原理及操作策略，并对比分析了各种方法的优势与不足；同时，还介绍了DNA无痕重组技术在大肠杆菌基因修饰中的应用情况。
C4二元羧酸（苹果酸、延胡索酸和琥珀酸等）是TCA循环中重要的中间代谢产物，广泛用于食品、医药和化工等行业。由于市场潜在需求量巨大，微生物发酵法生产C4二元羧酸备受关注。从自然界筛选的微生物可以大量积累C4二元羧酸，但存在诸多问题。而利用模式微生物生产C4二元羧酸具有很多优势，已成为国内外的研究热点。从三个方面综述了C4二元羧酸的研究进展：利用自然筛选及改造的微生物生产C4二元羧酸，代谢工程改造模式微生物生产C4二元羧酸，C4二元羧酸的发酵生产的代谢调控。最后，提出了微生物发酵法生产C4二元羧酸今后要解决的问题和发展方向。
枯草芽胞杆菌芽胞表面展示技术是把枯草芽胞杆菌作为芽胞表面展示的宿主来展示目的蛋白的一种技术。该技术不仅具备芽胞表面展示技术可展示分子量较大的目的蛋白、目的蛋白无需跨膜及芽胞的极强抗逆性等特点外，同时由于该技术的宿主菌——枯草芽胞杆菌的分子生物学信息研究得比较清楚、安全性高而被广泛应用。介绍了枯草芽胞杆菌表面展示近10年在生产疫苗和固定化酶方面的进展，并对如何提高表面展示目的蛋白的产量做了简要概述。
组织器官三维构建就是把种子细胞和支架材料结合而获得设计的组织或器官，属于组织工程的核心内容，也最能体现组织工程的技术水平，如血管、气管的构建。由于传统组织工程存在缺陷，Shimizu于1998年首先提出了原位组织工程的概念，它是运用组织工程学基本原理，通过各种方法诱导移植的外源性的种子细胞或内源性的缺损组织局部细胞发生迁移、增殖、分化形成新生组织修复缺损。原位组织工程最大的特点是不依赖体外的细胞培养装置——生物反应器。原位组织工程是传统离体组织工程的有益补充。离体组织工程仍具有广阔的发展前景。
