LYC5是一种c型人溶菌酶蛋白。根据毕赤酵母密码子的偏爱性，对LYC5的mRNA编码序列进行优化设计，将优化后的基因序列克隆至毕赤酵母分泌型表达载体pPIC9K中，构建重组酵母表达质粒pPIC9K- LYC5 。重组质粒经线性化处理后转化毕赤酵母GS115，应用G418抗性筛选出高拷贝转化子，并对其进行摇瓶诱导表达，产物经SDS-PAGE电泳检测，发现在约15 kDa的位置出现了一条特异蛋白条带，此条带经LTQ Orbitra pelite MS鉴定，证明此蛋白即LYC5溶菌酶蛋白，表达量约为20 mg/L。对表达上清液进行活性分析，发现表达上清对溶壁微球菌具有较好的溶菌活性，活性约为40 000 U/mg，最适酶活反应温度为45℃，最适pH为5.0。采用基因工程方法，首次表达出了有生物学活性的人源LYC5溶菌酶蛋白，为深入探讨人溶菌酶家族成员的抗菌谱及其应用前景的研究奠定了基础。
以离心换液的批培养为例，通过设计谷氨酰胺和天冬酰胺不同的添加方式来考察两者对CHO细胞生长，代谢及产物表达的影响。结果表明：基础培养基中谷氨酰胺和天冬酰胺不能简单地相互替换，缺失谷氨酰胺或天冬酰胺的基础培养基均不能支持dhfr-CHO细胞的正常生长和产物表达，仅谷氨酰胺和天冬酰胺的浓度同时达到4mmol/L，才能满足细胞生长所需。另外，代谢副产物氨的生成仅与谷氨酰胺和天冬酰胺的加和线性相关，与两者添加比例无关。但适当提高天冬酰胺与谷氨酰胺的比例可提高抗体表达水平，同时减少乳酸的生成。因此，为培养基开发与优化过程中谷氨酰胺和天冬酰胺的添加策略提供了依据，为建立高效的流加培养过程奠定了基础。
目的：在大肠杆菌中进行含硒抗病毒多肽的可溶性半胱氨酸缺陷型融合蛋白的表达，并对其纯化蛋白进行生物学活性的初步鉴定。方法：将含硒抗病毒多肽Se-GBVA10基因克隆到GST融合表达载体pGEX-2T中，转化至半胱氨酸缺陷型大肠杆菌BL21 cysE51 后进行半胱氨酸缺陷型表达，通过谷胱甘肽Sepharose 4B 亲和柱纯化目的蛋白质，并对其含硒量、抗病毒活力等性质进行初步鉴定。结果：利用半胱氨酸缺陷型表达法成功地可溶性表达了sjGST-Se-GBVA10和sjGST-GBVA10融合蛋白，并经凝血酶切后获得了纯化的Se-GBVA10和GBVA10抗病毒多肽。测定Se-GBVA10的含硒量为0.974 mol/mol peptide，GPX活力为47.52 U/μmol，其EC50为21.73μmol/L，CC50为849.41μmol/L。结论：Se-GBVA10具有与GBVA10相同的抗病毒活性，并具有一定的抗氧化活力。
目的：构建人甲状腺激素受体相互作用蛋白15（thyroid hormone receptor interacting protein 15，TRIP15）的原核表达载体，在大肠杆菌表达并纯化、结晶表达产物；证实TRIP15在人脐静脉内皮细胞株、血小板、二尖瓣、胆囊和胶质瘤存在表达。方法：以人肝细胞cDNA文库为模板，通过PCR扩增TRIP15的全长编码区序列，双酶切后连接到pGEX-6P-1载体上，转化E.coli BL21（DE3）菌株，通过亲和层析及分子筛对表达产物进行纯化，采用气相扩散悬滴法筛选并优化结晶条件，通过X射线晶体衍射技术检测晶体衍射；采用RT-PCR和Western blot研究TRIP15在人脐静脉内皮细胞株、血小板、二尖瓣、胆囊和胶质瘤的表达情况。结果：成功构建了TRIP15的原核表达载体，获得了电泳纯TRIP15蛋白，得到了蛋白质晶体，但衍射能力很弱；通过RT-PCR证实其在人脐静脉内皮细胞株、血小板、二尖瓣、胆囊和胶质瘤存在表达。结论：成功构建了TRIP15的原核表达载体、建立了表达纯化策略并获得了初步结晶的实验条件，为最终解析其三维结构奠定了基础；初步证实TRIP15在人脐静脉内皮细胞株、血小板、二尖瓣、胆囊和胶质瘤存在表达，为相关研究的开展奠定了基础。
目的：通过shRNA干扰高效敲低猪肝脏细胞中 IRS1和IRS2 基因的表达，进而验证其对于糖脂代谢相关基因表达的影响，为构建2型糖尿病模型猪奠定基础。方法：首先通过重叠PCR方法克隆了猪 IRS1 基因全部的mRNA序列（4 814bp）以及通过3'RACE方法克隆了猪 IRS2 基因的部分3'非编码区（3-untranslated region，3'UTR）。然后，通过Real-time PCR筛选获得了能显著敲低这两个基因的shRNA片段，并在同时敲低 IRS1和IRS2 的猪肝脏细胞中，检测糖脂代谢相关基因的表达。结果：猪肝脏细胞中 IRS1和IRS2 的表达被显著敲低，分别下降了78%和64%。另外，糖异生作用酶磷酸烯醇丙酮酸激酶（phosphoenolpyruvate carboxykinase，PEPCK）和果糖-1，6-二磷酸酶（fructose-1，6-bisphosphatase， F-1，6-BP）基因表达显著上升，并导致催化肝脏中糖酵解反应的葡糖激酶（glucokinase，Gck）基因表达的显著下降。同时，胆固醇调节元件结合蛋白（sterol regulatory element-binding proteins， SREBP-1）基因的表达也显著上升以及胆固醇调节基因 Abcg8，CYP7a1 表达明显上调。结论：猪肝脏细胞中 IRS1和IRS2 基因的敲低可激活糖异生作用，并抑制糖酵解反应，从而导致糖代谢的异常，同时也能引起脂类代谢的异常。
谷氨酰内切酶在生物制药及检测中应用较多，但来源受限，将全基因合成的金黄色葡萄球菌来源的谷氨酰内切酶功能区部分对应的基因进行改造后，克隆入表达载体pGEX-4T-2，导入E.coli BL21（DE3），重组蛋白以可溶性形式表达。采用亲和层析等纯化步骤对重组蛋白进行纯化，用底物Z-Phe-Leu-Glu-pNA（L-2135）对重组蛋白的酶学性质进行了研究，用HPLC、LC-MS/MS检测方法对酶切融合蛋白的位点特异性进行了鉴定。结果表明该酶的相对活性为1568U/mg，最适作用温度为42℃、最适作用pH为8.0，在pH 9.0，50℃时仍有较高的酶活，将该酶与胰酶酶切融合蛋白所得肽段结合能够提升质谱检测结果的精确度。以上结果表明该重组酶具有良好的应用前景。
雌马酚是大豆异黄酮的代谢产物，是一种天然的选择性雌激素受体调节剂，稳定性和生物学活性高。为实现雌马酚的微生物合成，采用模块途径工程策略，构建编码雌马酚合成关键酶基因 orf-1、orf-2和orf-3 的表达载体，成功用于转化酿酒酵母BY4741，得到工程菌株。结果表明，工程菌株有效表达了外源基因，并可将大豆异黄酮代谢中间体二氢大豆苷元转化为雌马酚。为构建从头合成雌马酚的微生物细胞工厂提供了重要科学参考。
有机酸代谢途径在丁醇发酵过程中具有重要的作用，对细胞内碳流的分配和产物的合成影响显著。在7 L厌氧发酵罐中，进行了间歇添加乙酸或丁酸的发酵实验。结果表明，乙、丁酸的添加显著提高了总溶剂的生产效率，分别提高了47.1%和39.2%；此外，丁醇/丙酮比在添加丁酸的批次中提高了21.7%，在添加乙酸的批次中降低了16.2%；厌氧瓶中的发酵实验也证实了以上结果。有机酸代谢计算的结果表明，乙、丁酸的添加基本上阻断了相应有机酸闭环的吸收途径。基于相关报道和代谢计算结果，构建了针对乙、丁酸添加批次的图论模型，并利用该模型对不同发酵条件下的溶剂浓度和丁醇/丙酮比进行了计算。结果表明，该模型很好地预测了实验结果，合理地构建了乙、丁酸添加批次的信号传递线图。
为了提高谷氨酰胺转胺酶的纯度和扩展在医药领域的应用，探索了一种适合工业化生产的、安全高效的微生物谷氨酰胺转胺酶纯化方法。轮枝链霉菌发酵后，经离心10 000 r/min 4℃除去菌体，调节发酵液电导率至4.1mS/cm和pH6.0后，以直线流速60cm/h通过SP Sepharose FF阳离子交换层析柱对目的蛋白高 选择性和高载量地捕获，再通过phenyl sepharose 6 FF（high sub）疏水层析柱进行精细纯化。纯化后经SDS-PAGE鉴定纯度达到95%以上，HPLC分析纯度> 99%。鲎试剂测定内毒素含量为0.013EU/ml，达到中国药典中血制品要求的低于0.15EU/ml标准。
目的：通过合成生物学的BglBrick方法快速构建不同种类HSA/ Exendin-4长效融合蛋白，为进行各HSA/Exendin-4融合蛋白生物学活性的筛选比较奠定基础。方法：选用酵母表达载体pPICZαA质粒，构建pPICZαA-E4和pPICZαA-HSA两种基础Brick表达载体，运用BglBrick方法，实现了不同数目Exendin-4分子在HSA的不同末端的快速组装。将构建出的10种HSA/Exendin-4融合蛋白，转入毕赤酵母菌KM71H中，用甲醇诱导目的蛋白的表达。结果：用BglBrick方法构建的HSA/Exendin-4融合蛋白在毕赤酵母中都成功诱导表达出相应的目的蛋白。结论：利用BglBrick方法能够实现HSA长效融合蛋白的快速组装。
鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）是禽类一种变异性很强的冠状病毒，为获得高度纯化的IBV核蛋白，建立监测IBV抗体的方法，通过RT-PCR从IBV中扩增IBV-N基因，定向连接到表达载体pGEX-KG中，转化E. coli BL21（DE3）菌株，诱导获得表达产物，SDS-PAGE分析产物大小、Western blot分析其免疫学活性，通过亲和层析法获得高度纯化的表达蛋白，建立一种检测IBV抗体的方法，并应用于临床监测。结果显示，IBV-N基因全长1230bp，GST融合蛋白表达产物大小约为80kDa，表达量约占菌体总蛋白的25%，具有良好的免疫学活性；通过GST亲和层析柱成功获得纯化蛋白，以该蛋白包被酶标板，成功地建立了一种检测血清中IBV抗体的间接ELISA方法。研究表明重组N蛋白作为IBV诊断抗原，具有制备简便、特异性强、敏感性高、重复性好的特点，可用于该病的临床监测，为该病疫情监测、发病机制研究奠定了基础。
目的：旨在建立一种在红花油体中表达EGF的转基因植物的方法。方法：通过PCR技术把大豆油体基因（DDoil）与EGF构建成融合基因，克隆至植物表达载体pCAMBIA1390R中，构建成植物表达载体p1390Do-EGF，然后转化进农杆菌 LBA4404 中用于侵染红花外植体，通过甘露糖筛选培养基培养可获得红花转化苗。通过PCR、实时荧光相对定量RT-PCR、SDS-PAGE和Western blot分析目的基因的表达情况，通过MTT法检测EGF的促细胞增殖活性。结果：PCR结果显示，红花叶片中能检测到EGF基因；实时荧光相对定量RT-PCR结果显示，在红花种子中EGF能成功实现转录；SDS-PAGE和Western blot检测证明，在转基因红花种子中能有效表达出EGF，并具有其原有的免疫原性，MTT法实验结果表明EGF具有促进balb/c 3T3细胞增殖的生物活性。结论：大豆油体和EGF融合基因已经成功转化进红花细胞的基因组中，并实现了EGF外源蛋白在红花种子油体中的表达，为EGF蛋白的产业化生产探讨了一种新的生产途径。
近年来溶胶-凝胶法固定脂肪酶已成为研究热点。选用TMOS、MTMS、ETMS和PTMS 4种硅烷试剂对黑曲霉脂肪酶进行了固定化研究。固定化的最佳配方为ETMS/TMOS=5：1、水与硅烷试剂分子比为8；固定化脂肪酶的固定率为80.2%、相对活性为136.3%；以乳化橄榄油作为底物，在50℃和pH4.0的条件下，固定化脂肪酶与游离脂肪酶Km分别为1.899×10-4M和2.789×10-4M；最适反应pH均为pH4.0，固定化脂肪酶在pH4.0~pH5.5之间其活性能保持95%以上；固定化脂肪酶最适反应温度为60℃，较游离脂肪酶提高了10℃；固定化脂肪酶的酸碱稳定性和热稳定性较非固定化酶有显著的提高。固定化脂肪酶的使用寿命和保存稳定性良好，使用12次后仍能够保留71.7%活性，在室温避光条件下保存180天后仍可保留79.2%活性。
抗体偶联药物（antibody-drug conjugates，ADC）因其良好的靶向性及抗癌活性目前已成为抗肿瘤抗体药物研发的新热点和重要趋势，受到越来越多的关注。ADC药物由单克隆抗体、高效应的细胞毒性物质以及连接臂三部分组成，它将抗体的靶向性与细胞毒性药物的抗肿瘤作用相结合，可以降低细胞毒性抗肿瘤药物的不良反应，提高肿瘤治疗的选择性，还能更好地应对靶向单抗的耐药性问题。与传统单抗药物相比，因其结构复杂，ADC药物质量属性分析方法的建立具有更大的难度和特殊性。对抗体偶联药物的研发现状、质量属性分析方法和挑战以及质量控制要点进行了简要介绍，为ADC药物的研究和质量控制提供参考。
基因组序列的功能分析以及代谢途径的构建改造等都需要克隆目的DNA。获得大片段DNA序列的方法有构建和筛选基因文库，PCR扩增，体外大片段DNA合成和组装等，但体内重组直接克隆的方法在操作、克隆长片段和应用等方面更具优势。介绍了Red/ET重组介导的大片段DNA体内直接克隆的主要方法及其应用。
微环境影响着细胞的增殖、迁移、分化以及细胞功能，细胞微环境影响细胞命运的因素包括细胞之间相互作用、细胞与细胞外基质相互作用、可溶性信号分子以及缺氧和营养对细胞的影响。组织工程支架的制备就是要利用仿生学原理最大程度模拟细胞微环境，从而应用于细胞行为研究以及临床治疗。全面了解细胞微环境对细胞的影响因素是制备组织工程支架的重要条件，而组织工程支架的研究也进一步推动了细胞微环境对细胞影响的认识。组织工程支架研究在组织工程研究中仍具有广阔前景，新的制备工艺也在组织工程支架研究中发挥着巨大推动作用。
黄酮类化合物是植物特有的多酚类化合物，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、改善血液循环等生理功能，在保健品、化妆品和医药等方面具有广阔的应用前景。黄酮类化合物主要通过植物提取制备，受时间空间及植物种类等因素限制，且分离纯化步骤复杂，产率较低。随着合成生物学与代谢工程的发展，构建黄酮类物质的生物合成代谢途径线路，并对基因来源、基因序列、基因组合方式、菌株底盘改造等方面进行筛选和优化已取得较大成果。现已能用工程酵母和大肠杆菌等微生物合成二氢黄酮、黄酮、异黄酮、黄酮醇、花色素和黄烷酮等黄酮类化合物，在此基础上还可经甲基化酶或糖基化酶修饰，增加新的生物活性。综述了目前国内外微生物合成各类黄酮类物质的研究进展，并对将来的发展趋势进行了讨论和分析。
泛素/26S蛋白酶体途径（ubiquitin/26S proteasome pathway，UPP）是目前已知最有效的、最具特异性的蛋白质降解途径。该途径介导了真核生物80%-85%的蛋白质降解，参与了细胞多项生命活动过程，对于维持细胞正常生理功能具有重要意义。研究结果表明，植物生长发育的诸多方面以及干旱胁迫响应等过程都受到该途径的调控。概述了泛素/26S蛋白酶体途径及其在植物生长发育过程中的作用，并着重阐述了由泛素-蛋白连接酶E3介导的植物干旱胁迫响应及其作用机制的研究进展。
L-精氨酸是一种非常重要的半必需氨基酸，其作为生物体生成NO的前体，参与尿素循环，对人和动物均具有重要的生理功能。现阶段生产精氨酸的主流方法是微生物发酵法，因此，如何快速、高效地选育精氨酸高产菌种成为业内关注的焦点。主要对精氨酸产生菌分子育种方法的最新研究进展进行了综述，并就目前存在的问题和发展方向进行了探讨。
