2014年, 第34卷, 第2期　
刊出日期：2014-02-25

  

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研究报告
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  表达轮状病毒nsp4基因重组腺病毒的构建与免疫评价

  谢力, 王晓囡, 李杨, 严敏, 曹颖, 李鸿钧, 孙茂盛

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 1-6. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140201

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  目的：应用非复制腺病毒表达系统构建表达人轮状病毒非结构蛋白4（NSP4）的重组腺病毒，初步评价其免疫保护效果。方法：构建含野生轮状病毒NSP4基因的穿梭质粒pshuttle-NSP4，与腺病毒骨架质粒pAdeasy经同源重组后在Ad-293细胞中包装获得pAd-NSP4重组腺病毒颗粒。电镜、RT-PCR、免疫荧光等方法鉴定病毒特征及在体外细胞中的表达。肌肉注射及滴鼻方式免疫小鼠，检测小鼠血清抗体效价及其中和保护效果。结果：获得了滴度为10^8.25CCID50/ml的重组腺病毒pAd-NSP4，免疫荧光检测到特异性目的蛋白的表达。二次免疫后肌肉注射和滴鼻小鼠的ELISA血清平均效价分别为1：320 和1：1436.8；中和抗体效价1：45.3和1：71.8。结论：表达轮状病毒NSP4蛋白的非复制型重组腺病毒颗粒具有良好的免疫原性。滴鼻途径比肌肉注射可更加有效地诱导小鼠的免疫应答。

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  沉默c2orf68基因对结直肠癌细胞增殖的影响

  蒋婷婷, 温晓霞, 陈尧

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 7-13. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140202

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  目的：通过RNA干扰技术抑制人结直肠癌SW480、SW620及LS174T细胞株中 c2orf68 基因的表达，进一步观察其生物学特性的改变，以阐明 c2orf68 基因对结直肠癌细胞增殖的影响。方法：利用siRNA在线设计软件设计合成干扰片段，并将2个干扰片段转入所试细胞株中。应用RT-PCR法检测细胞mRNA的表达；利用MTT实验观察细胞增殖情况；应用流式细胞技术检测细胞凋亡。结果：转染siRNA片段后，SW480、SW620及LS174T细胞株的mRNA表达都下降，其抑制率分别为：50.05%、44.79%；49.69%、30.00%；50.15%、45.79%。随后，选取干扰效率高的siRNA1干扰片段做后续实验。MTT实验发现，siRNA转染LS174T细胞后，细胞的增殖能力明显下降，细胞的增殖抑制率为21.2%（P<0.05）。同时，采用流式细胞仪检测细胞的凋亡，实验表明，实验组细胞凋亡率为18.13%（P<0.05）。结论：成功筛选了抑制结直肠癌 c2orf68 基因的特异性干扰片段，该片段可以下调人结直肠癌细胞株中 c2orf68 的mRNA，抑制人结直肠癌细胞的生长，促进细胞凋亡，说明该基因可能与结直肠癌的细胞增殖有关，进一步调控相应生物学特性的改变，引起结直肠癌的发生。
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  RNAi沉默CXCR7对人结肠癌细胞SW620特异性靶向抑制的实验研究

  王鑫, 陈玲, 孙飞, 陆航

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 14-20. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140203

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  目的：探讨慢病毒介导的CXCR7-shRNA转染人结肠癌细胞株SW620后对CXCR7蛋白表达的影响。方法：（1）设计并合成CXCR7的3对shRNA序列及1对阴性对照序列，与pSilencer^TM 4.1系统合成构建重组慢病毒载体，转染HEK293T细胞包装病毒并检测滴度；（2）将3种重组慢病毒载体及阴性对照分别感染人结肠癌细胞SW620，RT-PCR检测CXCR7 mRNA的表达情况，测定沉默效率，筛选沉默效率最高的一组CXCR7-shRNA作为后续实验表达载体；（3）MTT法检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞生长增殖的影响；（4）通过细胞划痕实验检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞侵袭迁移能力的影响；（5）Western blot检测转染CXCR7-shRNA对SW620细胞蛋白表达情况。结果：（1）测序证实3对慢病毒载体及1对阴性对照载体均包装成功，滴度分别为3.16×10⁸ TU/ml、4.27×10⁸ TU/ml、3.93×10⁸ TU/ml和2.95×10⁸ TU/ml；（2）3组慢病毒载体转染SW620细胞后，CXCR7 mRNA的表达量均较阴性对照组明显降低（P<0.05），其中CXCR7-shRNA-1对CXCR7的抑制率明显高于其他两组（P<0.05）；（3）CXCR7-shRNA-1转染SW620后，肿瘤细胞的增殖程度显著减少，与空白组相比有显著性差异（P<0.05）；（4）SW620细胞在划痕24h后，空白对照组和实验组的细胞迁移指数（MI）分别为（49.92±6.41）%和（29.13±5.38）%，有统计学意义（P<0.05），划痕48h后，对照组与实验组的MI分别为（96.52±7.44）%和（72.03±8.29）%，有统计学意义（P<0.05）；（5）CXCR7-shRNA-1转染SW620细胞后，与空病毒载体组、空白组相比，CXCR7蛋白表达量明显降低，具有统计学意义（P<0.05）。结论：CXCR7-shRNA慢病毒表达载体转染SW620细胞后可有效下调CXCR7 mRNA和蛋白的表达水平并能够抑制肿瘤细胞的增殖与迁移，为下一步研究以CXCR7/CXCL12生物学轴为靶点的结直肠癌慢病毒基因沉默治疗打下了良好的基础，为结直肠癌的基因治疗提供了新方向。
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  NANOGP8基因在肺癌细胞系中甲基化水平与表达研究

  王爱娥, 王英, 李朝霞, 宋云熙, 王东霞, 甘乐文, 马建新, 常艳, 张睢扬, 江小霞

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 21-25. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140204

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  目的：研究NANOGP8基因在肺癌细胞系A549中启动子区域甲基化水平及其与基因表达的相关性。方法：利用MethPrimer甲基化岛预测和甲基化引物设计软件，预测NANOGP8启动子区甲基化位点。分别从人成纤维细胞系和肺癌细胞系中提取基因组DNA，经过亚硫酸氢钠处理后，用针对甲基化位点设计的引物进行PCR扩增，获得相应区段DNA后，连接到pGEM-T载体，转化大肠杆菌鉴定阳性克隆后，测序并与GenBank数据库中NANOGP8基因组DNA 序列比对，获得其甲基化水平数据。分别提取两个细胞系的总RNA，RT-PCR获得相应cDNA 进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后，经酶切和测序验证，获取其表达水平数据。结果：成功预测NANOGP8的两个区域有甲基化位点，并检测到人成纤维细胞系和肺癌A549细胞系中NANOGP8启动子甲基化水平分别为59.7%和12.5%，表达检测结果显示在A549细胞系中检测到NANOGP8的基因片段，而在人成纤维细胞系中没有扩增到相应产物。结论：在正常成体细胞中NANOGP8基因由于启动子的高度甲基化而沉默，而在肺癌细胞系中NANOGP8基因启动子去甲基化激活其表达。NANOGP8基因的表达与其启动子区域去甲基化密切相关，同时NANOGP8在肺癌细胞分化过程中发挥重要作用。
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  盐酸阿霉素增强溶瘤腺病毒ZD55-TRAIL抑制肝癌细胞生长的研究

  刘涛, 韩华锋, 马步云, 杨远勤, 卓玲燕, 周立, 王毅刚

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 26-33. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140205

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  盐酸阿霉素（DOX）作为一种抗肿瘤抗生素，通过抑制癌细胞遗传物质的合成，对多种肿瘤均有杀伤作用，然而，其单独作用疗效有限，且加大剂量时其副作用较强。目前，携带抗癌基因的溶瘤腺病毒在肿瘤治疗中的作用日渐显现，溶瘤腺病毒ZD55-Trail联合DOX治疗肝癌的研究鲜有报道。通过MTT和结晶紫染色试验检测DOX药物处理对肝癌细胞系Bel-7404存活率的变化情况；Hoechst33342染色和流式细胞术检测肝癌细胞的凋亡；Western blot检测Trail蛋白和凋亡相关蛋白的表达；免疫荧光和流式细胞术检测凋亡相关受体表达的情况。结果显示，ZD55-Trail与DOX联合使用能够有效抑制肝癌细胞增长并诱导其凋亡，并且联合处理能增加Trail受体DR4和DR5的表达。初步探讨了DOX与ZD55-Trail两者协同诱导肝癌细胞凋亡的机制，为利用ZD55-Trail与DOX联合治疗肝癌提供依据。
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  聚己内酯/壳聚糖神经导管复合骨髓间充质干细胞促进大鼠坐骨神经损伤修复的研究

  刘奔, 张彩顺, 高绪斌, 李桦楠, 孔旭

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 34-38. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140206

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  目的：观察聚己内酯/壳聚糖神经导管复合骨髓间充质干细胞修复大鼠坐骨神经缺损的效果。方法：将24只SD大鼠随机分为4组，制备右侧坐骨神经5mm缺损模型，A组 聚己内酯/壳聚糖神经导管复合骨髓间充质干细胞移植组；B组 聚己内酯神经导管复合骨髓间充质干细胞移植组；C组 壳聚糖神经导管复合骨髓间充质干细胞移植组；D组 自体神经移植组。术后每2周进行坐骨神经功能指数检测，12周时行电生理、腓肠肌湿重恢复率、组织学观察和免疫组织化学检测。结果：坐骨神经功能指数显示，A组运动功能恢复速度较B、C组快，但比D组慢。A组电生理和腓肠肌湿重恢复率的检测结果与C、D组相比无统计学意义（P>0.05），但优于B组（P<0.05）。组织学观察，A组再生神经纤维排列密集。S-100免疫组织化学结果表明A组有大量雪旺细胞增生。结论：聚己内酯/壳聚糖神经导管复合骨髓间充质干细胞能够促进周围神经损伤修复，效果与壳聚糖神经导管、自体神经相同，优于聚己内酯神经导管。
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  2型猪链球菌β-半乳糖苷酶基因的克隆表达及酶活性测定

  张凤玉, 胡丹, 龚秀芳, 郑峰, 潘秀珍, 王长军

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 39-44. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140207

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  目的：克隆表达2型猪链球菌β-半乳糖苷酶（BgaC）编码基因，并测定其酶活性。方法：根据05ZYH33基因组序列设计引物，PCR扩增bgaC基因，构建重组表达质粒pET28a-bgaC，转化E.coli BL21，筛选阳性转化子进行IPTG诱导表达，产物通过SDS-PAGE鉴定；最后对表达产物进行亲和层析纯化，获得BgaC纯化蛋白后测定其酶活性。结果：bgaC基因在原核细胞中得到高效表达，重组表达的BgaC分子质量约为69kDa，其酶促反应最适温度为42℃，最佳反应时间为30min，最适反应pH为5.5，最佳底物浓度为10mmol/L。2型猪链球菌BgaC的体外酶活为1615U/ml，酶比活为1076U/mg。结论：2型猪链球菌强毒力株05ZYH33中含有bgaC基因，在原核系统高效表达的BgaC具有良好的酶学活性。
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  新型长效重组促卵泡素的纯化和性质及药代动力学研究

  杨凡, 黄虎, 李屹晨, 邓衡露, 吴茂柏, 钟翎, 侯永敏

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 45-51. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140208

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  促卵泡素（Follicle-stimulating hormone，FSH）用于治疗男女不孕不育症，由于FSH的半衰期较短，需要频繁注射给药，因此制备长效FSH制剂一直是该类药物的研发方向。首次将来自绒促性素（human chorionic gonadotropin，HCG）中的羧基端肽（carboxy-terminal peptide，CTP）和人免疫球蛋白G2（immunoglobulin G2，IgG2 ）Fc片段变体（vFc）与单链FSH有序连接，通过基因工程和哺乳动物细胞培养技术实现了其在中国仓鼠卵巢细胞中的稳定表达，然后利用Protein A柱层析手段进行纯化，制备了新型重组FSH-CTP-vFc融合蛋白，同时分析了不同细胞培养时间表达的重组融合蛋白的理化性质和体内外活性。动物试验结果表明，纯化的FSH-CTP-vFc融合蛋白具有显著的体内生物活性，药代动力学分析显示该重组融合蛋白的半衰期是重组FSH的近10倍。这种新型长效重组FSH-CTP-vFc融合蛋白在临床上可大大减少注射次数和患者痛苦，提高患者用药依从性。
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  Thermus thermophilus HB27锰过氧化氢酶在大肠杆菌中的表达及酶学性质分析

  何晓娟, 薛正莲, 赵志军, 孙俊松, 史吉平

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 52-58. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140209

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  碱性嗜热过氧化氢酶是一种重要的纺织用酶。根据大肠杆菌密码子使用偏爱性，对Thermus thermophilus HB27来源的含锰过氧化氢酶基因进行密码子优化，将优化后的基因连接至表达载体pET28a（+）上，转化到E. coli BL21（DE3）中进行诱导表达。结果表明在含有14mmol/L Mn²⁺浓度的培养液中以0.2 mmol/L的IPTG 42℃条件下诱导2 h的情况下，菌体破碎上清液中的酶活力可达25 U/ml。利用Ni 亲和层析柱对该Mn-CAT进行纯化，酶学性质研究表明：此酶的最适温度为70℃，最适pH为pH 10.0，在80℃保温2 h，酶活力不损失；pH9.0~11.0的环境中放置2 h后，酶活仅损失约10%，此酶具有良好的工业开发潜力。
技术与方法
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  技术与方法适体核酶型人工核糖开关的设计

  王佳稳, 冯婧娴, 林俊生, 刁勇

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 59-64. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140210

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  适体核酶型核糖开关是近年出现的一种人工基因调控开关。最常见的适体核酶由锤头状核酶和适体组成，结构清晰，易于设计。作为一种顺式作用元件，适体核酶型核糖开关在特异性配体的作用下，无需蛋白质辅助，即可通过调节自身裂解反应，调控mRNA的翻译，可应用于多种细胞的基因调控。目前适体核酶型核糖开关的设计，主要是通过合理组装核酶与适体元件，整合到mRNA后再进行功能筛选。该基因调控开关调节幅度大、响应迅速、调控方式简洁，有可能应用于体内传感器、基因治疗、生物处理器等多个领域。
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  免疫共沉淀结合基因芯片对m₃G帽子结构RNA的分离鉴定

  贾栋, 张彬, 马瑞燕, 唐贵刚, 赵捷, 王文华, 周琳

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 65-70. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140211

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  目的：通过免疫共沉淀和基因芯片技术，建立一种RNA 5’端帽子结构的鉴定方法。方法：利用m₃G帽子结构的特异性抗体对线虫的总RNA进行免疫共沉淀，为线虫127个非编码RNA设计探针，制备了检测基因芯片，对其帽子结构进行鉴定，并对RNA的转录进行分析。结果：37个非编码RNA被分离鉴定为含有m₃G帽子结构，与其它物种已发现m₃G 帽子的RNA比较，结果基本一致。结论：免疫共沉淀结合基因芯片技术对非编码RNA 5’端帽子结构分离鉴定的方法是可行有效的。此方法特异性强，灵敏度高，对大规模RNA帽子结构的鉴定、新RNA的发现和RNA功能的鉴定都具有一定的参考和应用价值。
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  大肠杆菌中从头合成白藜芦醇途径的设计及优化

  汪建峰, 张嗣良, 王勇

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 71-77. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140212

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  白藜芦醇是一种极具药用价值的植物源芪类化合物。为了在E. coli实现白藜芦醇的从头合成，构建了由酪氨酸解氨酶（TAL），香豆酸-CoA合成酶（4CL）和白藜芦醇合成酶（STS）组成的非天然合成途径。经3天发酵后，白藜芦醇产量仅为2.67 mg/L，而其中间体香豆酸的积累达到了95.64 mg/L。为了进一步改善异源途径的效率，对4CL和STS模块采取融合表达、高拷贝表达及启动子工程改造的策略，最终使白藜芦醇产量提高到了9.6倍，达到了25.76 mg/L，同时香豆酸的积累减少到了20.38 mg/L。这些研究结果为更高效白藜芦醇从头合成工程菌的构建及最终实现白藜芦醇的微生物大规模生产奠定了基础。

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  布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体双重PCR检测方法的建立与初步应用

  彭武丽, 罗展荣, 季新成, 员丽娟, 史茜, 于学辉

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 78-83. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140213

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  为建立同步检测布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体的双重PCR方法，根据GenBank上公布的布鲁氏菌Bp26基因和贝纳氏柯克斯氏体IS1111a基因，利用 Primer premier 5.0软件各设计一对特异性引物，分别扩增出219 bp和130 bp的目的片段，通过优化PCR反应体系和扩增条件，建立起了能够同步快速检测布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体的双重PCR方法，该方法具有较好的特异性、可重复性和较高的灵敏性。利用该双重PCR方法对流产牛抗凝全血、血清、流产胎儿及奶液等172份临床样品进行检测，共检测到布鲁氏菌感染阳性样品53份，贝纳氏柯克斯氏体感染阳性样品10份，混合感染阳性样品2份，阳性检出率分别为30.8% 、5.8% 、1.2%。初步临床应用结果表明，该方法可用来安全、同步、快速、灵敏地对布鲁氏菌和贝纳氏柯克斯氏体进行检测。
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  侧钩木霉的分离、鉴定及产孢条件优化

  高雪丽, 吴坚平, 徐刚, 杨立荣

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 84-92. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140214

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  从堆肥中分离得到一株具有较强拮抗植物病原菌活性的木霉菌，经过分子生物学方法鉴定为侧钩木霉（Trichoderma ghanense）。以该菌为出发菌株，对其固态发酵培养基进行优化，以期提高孢子产量。通过单因素筛选、Plackett-Burman实验、最陡爬坡实验和响应面分析确定影响孢子产量的最重要的三因素为蔗糖、玉米浆、硫酸镁，其最佳浓度分别为0.56%、0.56%和2.59%，最佳初始含水量为35%，最佳初始pH值为9。优化后的固态发酵培养基上，该菌孢子产量可达1.16×10⁹CFU/g IDS，约是优化前的17倍。
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  膜反应器固定化米根霉发酵产富马酸的工艺研究

  刘强, 徐晴, 李霜

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 93-97. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140215

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  以膜反应器固定化米根霉发酵产富马酸为研究对象，以Na₂CO₃为中和剂，考察固定化米根霉在5L搅拌式发酵罐中的发酵特征，采用智能可视化软件（IVOS）优化发酵工艺条件。结果表明，在80g/L初始糖浓及最优工艺下，富马酸产量、生产速率及转化率分别为21.1g/L、0.25g/（L·h）和28%；采用40g/L初始糖浓及连续批次发酵工艺时，富马酸产量、生产速率及转化率最高分别为10.8 g/L、0.36g/（L·h）和27%。搅拌式反应器中，固定化米根霉的膜反应器比表面积有限，以及菌膜的空间阻隔效应对传质传氧的限制作用，显著影响了富马酸的生产强度和转化率。因此，亟需发掘新的固定化方法及反应器形式，达到既解决米根霉形态控制问题，又有助于生产性状提升的目标。
综述
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  新型靶向基因组编辑技术研究进展

  杨发誉, 葛香连, 谷峰

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 98-103. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140216

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  传统的靶向基因组编辑技术改造基因效率非常低，严重制约了基础研究和临床应用。因此，新的靶向基因组编辑工具的研究显得非常重要，以此来提高基因原位修复、定点整合及高通量基因敲除的效率。主要论述了近年来发现的新型靶向基因组编辑技术即锌指核酸酶（ZFN）、转录激活子样效应因子核酸酶（TALENs）、规律成簇间隔短回文重复（CRISPR）/Cas系统。从它们的发现、结构和研究进展及应用前景等方面进行了总结；通过比较三者的优缺点，发现规律成簇间隔短回文重复（CRISPRs）具有明显的优点。
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  体液循环microRNA的研究进展

  满朝来, 杨美玲

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 104-108. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140217

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  循环microRNA（miRNA）是参与细胞间信息交流的一类非编码小RNA分子，作为许多疾病的生物标记物近来受到广泛关注。简要总结了循环miRNA的来源和存在形式，同时概述了体液miRNA的制备和检测方法，最后对循环miRNA的应用前景进行了简单探讨，以期为循环miRNA在理论和实践中的深入研究和应用提供参考。

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  马克斯克鲁维酵母在工业生物技术中的应用

  高教琪, 韩锡铜, 孔亮, 袁文杰, 王娜, 白凤武

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 109-117. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140218

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  马克斯克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus是目前研究较为广泛的一种非传统酵母，因其耐高温、生长速率快、底物谱广等诸多优势而越来越多地应用于工业生物技术领域。马克斯克鲁维酵母可以分泌菊粉酶、β-半乳糖苷酶等多种应用广泛的水解酶类；还可以利用菊粉类原料、乳清、糖蜜以及木糖等多种非粮底物生产乙醇；其在外源蛋白的分泌以及基因工程操作等工业分子生物学领域也取得了突破。现主要对近年来马克斯克鲁维酵母在产酶、乙醇发酵、分泌外源蛋白等诸多工业生物技术领域的研究进展及存在的挑战进行综述，为进一步推动马克斯克鲁维酵母在工业生物技术中的应用奠定基础。
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  “组学”技术在燃料乙醇生产用酿酒酵母菌株构建中的应用

  李云成, 汤岳琴, 木田建次

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 118-128. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140219

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  酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是工业乙醇生产广泛使用的微生物，构建能同时发酵戊糖以及具有优良抑制物耐受能力的高产菌株，在燃料乙醇生产技术开发中具有十分重要的地位。基因组学、蛋白组学、转录组学、代谢组学和流量组学等“组学”技术可从基因型到表现型不同层次揭示生命活动规律，在燃料乙醇生产用酵母菌株的构建中具有广阔的应用前景，特别是目标基因的识别、代谢途径的优化、代谢机理的揭示等。运用“组学”技术可使菌株构建工作更具靶向性和明确性，更加易于获得目标性状，并大大缩短育种周期。综述了“组学”技术在燃料乙醇生产用酿酒酵母菌株构建中的应用及相关研究进展。
评论
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  STAP：堪比iPS的干细胞获得新策略

  王佃亮, 张宏翔

  中国生物工程杂志. 2014, 34(2): 129-130. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140220

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