目的:建立新型冠状病毒(2019 novel coronavirus,2019-nCoV)IgM /IgG胶体金抗体联合检测试剂的制备方法,并对检测试剂的性能指标进行评价。方法: 采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液,分别用刺突蛋白(S蛋白)受体结合域(receptor binding domain, RBD)和核衣壳蛋白(nucleocapsid protein, NP)作为标记抗原,硝酸纤维素膜上包被鼠抗人IgM单抗(M线)和鼠抗人IgG单抗(G线),并用二硝基苯酚-牛血清白蛋白(DNP-BSA)和兔抗DNP多抗为独立C线质控系统制备胶体金检测试剂;比较RBD蛋白和NP蛋白临床测试符合率,选取较优抗原制备检测试剂,对试剂交叉、干扰反应性,加速稳定性及临床诊断特异性和灵敏度进行性能评价。结果: RBD蛋白临床测试总符合率 98.48%(389/395);NP蛋白临床测试总符合率89.11%(352/395),RBD蛋白总符合率高于NP蛋白。选用RBD蛋白制备检测试剂盒,与13种常见病原体抗体阳性样本均无交叉反应;样本中的甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子(RF)、人抗鼠抗体(HAMA)、抗核抗体(ANA)对测试结果无干扰。试剂盒50℃加速破坏6周稳定。临床确诊样本及排除样本测试,IgM灵敏度为78.31%(65/83),特异性为98.90%(721/729);IgG灵敏度为92.77%(77/83),特异性为99.31%(724/729);IgM和IgG联合检测灵敏度为92.77%(77/83),特异性为98.35%(717/729);一致性检验Kappa值为0.883 0,P<0.05。结论: 2019-nCoV IgM/IgG抗体检测试剂(胶体金法)检测性能的特异性和灵敏度高,检测速度快,操作便携,可作为已有的2019-nCoV核酸检测法的补充手段。
背景:禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是小麦及其它粮食作物小麦赤霉病(Fusarium head blight)的主要病原菌。目前,分子分析在研究病原菌的致病机理中已有广泛应用。MGV1菌株是禾谷镰刀菌MAPK信号通路基因MGV1缺失后的突变体,MGV1敲除突变体的差异基因表达(DGE)分析显示,MGV1基因缺失后,MDT1基因表达量显著下调。GO注释预测是参与ATP结合蛋白二聚作用的活性因子。推测该基因涉及MGV1通路。目的: 探讨MDT1基因(MGV1 dependent transcripts)的生物学功能。方法: 应用Split-Marker技术构建基因敲除盒,并通过常规方法检测缺失突变体的表型和致病性。结果: 与禾谷镰刀菌PH-1相比,MDT1基因缺失突变体的分生孢子量和子囊壳量显著下降,表明该基因对于无性繁殖和有性生殖能力至关重要。同时发现,在固体培养基上,缺失突变体的营养生长能力大大下降。该缺失突变体对细胞壁降解酶也很敏感,液体培养基中32℃下,菌丝顶端膨大,并有菌丝断裂,表明该基因与禾谷镰刀菌的细胞壁整合有关。互补实验证实了敲除突变体表型改变确实是由于MDT1基因缺失所致。结论: MDT1基因与禾谷镰刀菌的分生孢子和营养生长能力有关。
目的:利用单个突变引物,在含人呼吸道合胞病毒F蛋白基因编码序列的pcDNA3.1(+)-F质粒中,通过单次环形PCR在特定序列位置引入定点突变。 方法: 以双链环状的pcDNA3.1(+)-F质粒DNA为模板,设计分别含有三种目的突变N70Q, I431N, Q270T的三条单引物,分别进行单次PCR。用甲基化DNA特异的限制性内切酶Dpn I处理PCR产物后转化大肠杆菌DH5α,进行克隆筛选,酶切鉴定和测序分析。 结果: 酶切鉴定结果和测序结果均符合预期,利用单引物PCR法成功在含人呼吸道合胞病毒F蛋白基因编码序列的pcDNA3.1(+)-F质粒DNA 中引入了单碱基突变、两个间隔碱基突变及相邻三碱基突变三种目的突变。 结论: 单引物PCR法解决了常规定点突变方法中多个PCR反应,程序繁琐及突变效率低等问题,是一种简便、快速、有效的基因工程定点突变新方法。
目的:生物催化的氧化还原反应广泛应用于手性化合物的制备,其中很多反应涉及辅酶NADPH的原位再生。以异丙醇为辅助底物,利用醇脱氢酶再生NADPH,具有比酶活高、副产物丙酮易于分离等优势,受到越来越多的关注。选择极具应用潜力的来源于Clostridium beijerinckii的醇脱氢酶CbADH作为研究对象,针对其在大肠杆菌中的可溶性表达差、酶活低的瓶颈问题开展研究。方法: 首先通过引入诱导型质粒pGro7表达分子伴侣GroES-GroEL,将pET-28a(+)质粒表达CbADH的可溶性提高了3.57倍,酶活达到出发菌株的4.83倍。其次,考察了另外三种不同的分子伴侣表达策略:pET-28a(+)单质粒共表达、基因组强化表达GroES-GroEL和组成型改造pGro7/GroES-GroEL和pET-28a(+)/CbADH双质粒共表达。结果: 组成型改造pGro7和pET-28a(+)双质粒共表达策略的效果最优,其CbADH的可溶性表达提高了8.07倍,酶活达到了21.79U/mg DCW,是出发菌株的9.43倍。结论: 为CbADH的工业应用奠定了良好的基础,也为外源蛋白的可溶性表达提供了参考。
组织工程器官重建因不同的用途而对材料的弹性、刚度、生物活性等有一系列的需求,但当前所应用的材料多难以同时满足,例如弹性材料聚乙二醇双丙烯酸酯等高分子材料并不具备较高的生物活性,而生物材料胶原等生物活性好而弹性较差。弹性蛋白(elastin)作为广泛存在于动物体内的一种弹性极佳的功能蛋白,因其可承受较大形变而不破坏本身结构,故应用于弹性器官的组织工程重建中。为获得高生物活性的弹性蛋白样多肽(elastin-like polypeptides,ELP),根据其基本重复单元Val-Pro-Gly-Xaa-Gly设计了氨基酸序列,并进行优化,构建成原核表达质粒,通过大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行诱导表达并收集,SDS-PAGE鉴定。通过流变检测、扫描电镜检测、细胞活性检测等方法鉴定材料的弹性性能、物理结构及生物活性,为下一步通过调整交联方法提高其弹性提供了材料,也为ELP作为生物材料应用于组织工程器官重建奠定了基础。
目的:为获得具有体外切割活性的LbCpf1蛋白。方法: 将毛螺菌科细菌ND2006(Lachnospiraceae bacterium ND2006)的LbCpf1基因编码区连接至pHis*6(IV),构建原核表达质粒CRISPR-LbCpf1-6*His。将该重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导目的蛋白表达,经镍柱亲和层析纯化、透析除盐和凝胶电泳检测等步骤获得重组蛋白,进行体外切割试验鉴定重组蛋白切割活性。结果: 双酶切鉴定和测序结果表明成功构建重组质粒CRISPR-LbCpf1-6*His,经转化后获得含有重组质粒CRISPR-LbCpf1-6*His的BL21(DE3)蛋白表达菌株。将菌株接种于37 ℃,160 r/min,IPTG终浓度为0.5 mmol/L的条件下诱导5 h,最终镍柱纯化除盐后的LbCpf1蛋白终浓度可达400 ng/μl,在体外适宜条件下,该重组蛋白可与成熟的crRNA结合切断标靶DNA。结论: 获得的高纯度LbCpf1蛋白具有体外切割活性,可用于后续基因编辑研究。
猪多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是导致猪呼吸系统疾病的一类重要病原菌,给世界养猪业带来了巨大的经济损失。准确、敏感、快速的Pm检测方法有助于在临床上了解Pm的流行情况,从而采取相应的预防、治疗和综合防控措施。对Pm的病原学、分子生物学、免疫学及分子分型方法的研究现状、原理和优缺点等进行综述,为进一步建立Pm标准检测方法提供参考。
细胞DNA的完整性受到不同因素的影响,可分为内源性及外源性因素,这些因素均可引起不同程度的DNA损伤。其中,DNA双链断裂是最严重的一种DNA损伤,若未能进行及时的修复,则会引起一系列的损伤反应。严重的DNA双链断裂甚至可以造成细胞凋亡、肿瘤的发生等严重后果。因此,快速并准确地检测细胞DNA双链断裂程度能帮助评估DNA的完整性、内外环境的遗传毒性效应、临床诊断和放化疗监测。DNA双链断裂检测技术近年来发展迅速,目前可基于物理或化学方法、免疫荧光法和高通量测序技术检测DNA双链断裂程度。对这些检测方法的最新研究进展、应用以及其优缺点进行介绍,旨在为后续DNA双链断裂程度检测的研究和临床提供参考。
近年来,连续型细胞培养由于其高单位体积产量、稳定的产品质量属性以及潜在的成本节约效应正成为生物大分子制药生产的工艺焦点。相比传统的流加培养模式,灌流培养因培养的连续性、操作的复杂性,致使其反应器规模培养需消耗大量培养基,产生更高人力成本,不能满足当今加速化高效化的工艺开发需求。为获得稳健的灌流培养工艺并控制较低成本,高通量灌流培养模型被用于批量化的小规模灌流培养,进行灌流培养前期的克隆筛选、培养基筛选及工艺参数优化等工作,为后期大规模培养提供实用性数据支持,同时也被用于预测大规模培养的细胞表型和产品质量属性。重点介绍了当前高通量系统包括摇瓶/摇管系统、多平行自动化系统以及微流控体系用作灌流培养的特征、具体应用及比较,同时论述当前高通量灌流培养系统在生物工艺领域发展所面临的机遇及挑战,并展望其应用前景。
抗体药物和抗体片段药物在药物市场占据了重要的地位,主要通过哺乳动物细胞系统进行生产,操作复杂并且成本高。为了能够克服哺乳动物细胞系统生产抗体药物的弊端,越来越多的抗体及抗体片段在原核细胞及酵母菌中生产,但是产率往往不高并且没有糖基化。从基因转录和翻译的优化、分子伴侣的共表达和抑制蛋白水解降解等方面概述了在原核生物表达系统及酵母菌中提高单克隆抗体和抗体片段产量的研究进展,为未来利用原核生物和酵母菌实现工业化生产单克隆抗体及抗体片段奠定基础。
细胞色素P450氧化酶能够催化一系列具有区域特异性、立体特异性的化学步骤,并参与许多天然产物如萜类化合物、甾醇以及生物碱的合成。萜类化合物是活性天然产物中的一大类化合物,在医药、香料等领域具有重要价值。萜类化合物的生物合成及合成后修饰需要P450s,但是目前已知P450s较低的催化活性极大地限制了萜类生物合成的效率。因此,迫切需要发掘和改造用于萜类生物合成的高活性P450s,以充分实现其巨大的工业应用潜力。综述了萜类代谢中涉及到的P450s家族以及近年来萜类生物合成中P450s的发掘和工程研究进展,重点介绍了合成生物学扩宽P450s在萜类合成应用中的主要策略,提出进一步加速P450s发掘和P450s工程的可行策略,并针对合成生物学技术为今后P450s在萜类合成中的应用提出建议与展望。
