目的: 探究谷氨酸脱氢酶缺失对单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)生物被膜、毒力及胞外蛋白表达的影响。方法:利用微孔板法,检测谷氨酸脱氢酶缺失对Lm生物被膜形成能力的影响;比较野生株、谷氨酸脱氢酶缺失株EGDeΔgdhA及回复菌株EGDeΔgdhA+pERL3-gdhA的溶血活性和对棉铃虫幼虫的半数致死量,检测谷氨酸脱氢酶缺失对Lm毒力的影响;利用iTRAQ技术对Lm野生株EGDe与谷氨酸脱氢酶缺失株EGDeΔgdhA的胞外蛋白进行分离与鉴定,并对差异表达蛋白质进行生物信息学分析。结果:与野生株相比,缺失株形成的生物被膜量显著降低(P≤0.01),溶血活性下降,对棉铃虫幼虫的半数致死量上升了1.6倍;蛋白质组学结果显示,缺失谷氨酸脱氢酶后差异性表达的胞外蛋白有62个,其中47个蛋白质表达量下调,15个蛋白质表达量上调。进一步将这些差异表达蛋白质同COG数据库进行比对及功能聚类分析,结果显示,这些蛋白质的功能分别属于碳水化合物转运与代谢、核苷酸转运和代谢、能量合成与转运相关、转录及细胞膜细胞壁相关蛋白等16个功能类别;其中碳氮代谢及能量转运相关蛋白数量最多,为24个,占所鉴定出的差异蛋白质总量的38.71%。表明谷氨酸脱氢酶是单核细胞增生李斯特菌中碳氮代谢和能量转运中的关键酶。同时,发现有3个与细菌黏附及生物被膜形成相关的蛋白质表达量下降。以上结果较好地解释了EGDeΔgdhA在基础培养基中生长缓慢和生物量显著性下降,以及生物被膜形成能力降低的现象。结论:谷氨酸脱氢酶在单核细胞增生李斯特菌生物被膜、毒力及胞外蛋白表达方面有重要作用。
高山被孢霉是一种富含多不饱和脂肪酸的丝状真菌,但其脂质过程中NADPH的来源还没有研究透彻。以高山被孢霉(尿嘧啶营养缺陷型)作为出发菌株,研究亚甲基四氢叶酸脱氢酶(MTHFD1)对高山被孢霉脂质合成的影响。首先构建了过表达载体pBIG2-ura5s-MTHFD1,采用根癌土壤杆菌介导转化真菌的方法,将二元表达载体转化进高山被孢霉CCFM501中,在筛选培养基SC-CS平板上进行筛选,进而得到稳定遗传MTHFD1基因的过表达菌株(MA-MTHFD1);其次提取MA-MTHFD1菌株基因组进行PCR鉴定,并结合qPCR分析结果,表明MTHFD1基因成功在高山被孢霉中实现了过量表达;最后通过对MA-MTHFD1中的脂肪酸含量、NADPH含量及NADPH合成途径中相关基因转录水平进行分析,研究MTHFD1基因过表达对脂质合成的影响。实验结果表明,过表达MTHFD1基因可以提高高山被孢霉脂质合成能力。与原养型高山被孢霉相比,MA-MTHFD1菌株中脂肪酸含量提高了40.13%,NADPH的含量提高了26.45%,而且NADPH合成途径中其他相关基因苹果酸酶(ME)和异柠檬酸脱氢酶(IDH)的转录水平也发生了上调。这一系列研究结果表明,在高山被孢霉脂质合成还原力形成中,MTHFD1基因起到了关键作用。这为解析高山被孢霉中NADPH来源及深入研究脂质合成机制,从而对其胞内脂肪酸代谢通路进行分子水平上的改建提供了一定的理论依据。
对来源于枯草芽孢杆菌菌株168(Bacillus subtilis 168)的壳聚糖酶编码基因进行了序列优化及全合成,并在毕赤酵母(Pichia pastoris)中实现了分泌表达,表达产物的蛋白质浓度达到0.30mg/ml。表达的壳聚糖酶最适pH为5.6,最适温度为55℃,比酶活达84.54U/ml。该酶在50℃及以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并使用超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS)对产物的组分进行了分离及鉴定。根据一级质谱信息,推测酶解产物中包含至少37种聚合度2~18,不同脱乙酰度的壳寡糖组分。综上,利用毕赤酵母分泌表达了来源于枯草芽孢杆菌菌株168的壳聚糖酶基因,利用表达产物水解制备了低脱乙酰度壳寡糖并对其组分进行了分析,可为后续壳寡糖结构与功能关系的研究提供参考。
裂壶藻作为一种生产DHA的重要菌种,其脂肪酸合成途径除了已经被广泛了解的聚酮合酶(PKS)途径外,还残存着作为真核微生物中常见的脂肪酸合酶(FAS)途径中的功能酶和中间产物。经过前期的研究,运用基因工程手段,将载有与裂壶藻近缘藻种中已知的Δ12-desaturase表达模块和相关筛选标记构建入载体,通过电击转化导入Schizochytrium sp.ATCC20888中, 以期望修复裂壶藻中FAS途径的合成能力。通过分子水平检测确定目的功能基因已稳定转化后,再由气相色谱分析转化株油脂中相关脂肪酸含量分布情况。经过长期筛选验证,最终证明获得了两株阳性转化株,其生物量初步测定分别较野生株提高11.14%和4.12%,其油脂中DHA含量分别较野生株提高了19.50%及14.65%。
华氏巨球蛋白血症(Waldenström’s macroglobulinemia,WM)是一种罕见的,不可治愈的淋巴浆细胞淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma,LPL)。MYD88 L265P突变在华氏巨球蛋白血症患者中检出率很高(>90%),可以用于疾病的鉴别和诊断,因此,开发一种高灵敏度的检测方法对这个突变进行检测具有较大的临床价值。通过将ARMS技术与Clamping PCR技术相结合,建立的新型MYD88 L265P突变富集检测体系可以满足这一需求。优化后,该检测体系检出限为10 2拷贝,灵敏度为0.1%,对19份临床样品的双盲试验中,检测结果准确率达到100%。所建立的方法具有灵敏、准确的优势,适用于华氏巨球蛋白血症的早期诊断,有较为广阔的应用前景。
目的:建立钙通道Orai1的体外研究方法。方法:利用脂质体重组技术,将体外纯化的Orai1蛋白重组到脂质体膜上,利用蔗糖密度梯度离心来检测其重组效率及Orai1蛋白在脂质体膜上的结构,并利用钙染料Fura-2检测脂质体内钙离子的释放。结果:成功制备了脂质体及体外纯化了GST-Orai1融合蛋白,蔗糖密度梯度离心结果证明GST-Orai1蛋白成功重组到脂质体上,以及Orai1蛋白以多聚体的形式定位在脂质体膜上。钙离子释放实验证明脂质体内钙离子包装完好,可用于后续Orai1钙通道的功能研究。 结论:利用脂质体重组技术建立了一种新的Orai1的研究方法,能够更直接有效地研究其功能及其活化机制。
目的: 建立简便、快速、灵敏的锁核酸(locked nucleic acid,LNA)探针实时荧光聚合酶链反应(PCR)检测方法,检测乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV) 阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil,ADV)耐药相关位点(rtA181V、rtN236T)突变。方法: 通过基因测序筛选阳性样本,进而构建ADV rt181和rt236位点野生株和突变株重组质粒,设计包含扩增阿德福韦酯rtA181V和rtN236T耐药位点在内的特异性引物和LNA荧光探针,以构建的重组质粒为标准品建立实时荧光PCR反应体系,并通过与基因测序平行检测血清样本以判断检测方法的可行性与准确性。结果:所建立的LNA-PCR法能够检测10 2copies/ml的HBV中ADV基因突变,同时具备较高的特异性。通过对89例ADV治疗一年后HBV阳性临床样本进行检测,有8例(8.98%)rtA181V突变、5例(5.61%)rtN236T突变、2例(2.24%)rtA181V和rtN236T混合突变,检测结果与测序结果一致。结论:所建立的LNA-PCR法是一种简便、快速、灵敏的基因突变检测方法,能有效的区分单碱基突变,对慢性乙型肝炎患者德福韦治疗过程中耐药突变的监控和抗病毒药物的调整具有指导意义。
目的: 制备用于检测小鼠胚胎早期Ucp2基因表达的地高辛标记的特异性RNA探针。方法: 提取小鼠胚胎脑组织总RNA,设计引物,通过RT -PCR方法获取Ucp2基因片段,将其克隆到pGEM -T载体。分别利用Sp6、T7和Ucp2特异性引物,PCR扩增获得转录模板,通过Sp6及T7 RNA聚合酶,获得地高辛标记的正义、反义Ucp2 RNA原位杂交探针。检测标记探针的效价后,通过全胚胎原位杂交分析制备探针的特异性和杂交效果。结果:成功获得Ucp2基因正义、反义探针,反义探针能高效灵敏检测到Ucp2基因在小鼠胚胎Ed9.5、Ed10.5神经系统呈现高表达,而正义探针未能检测到表达信号。 结论:成功制备了特异高效的地高辛标记Ucp2 RNA 原位杂交探针,为进一步研究Ucp2基因在小鼠胚胎组织中的表达,尤其在神经组织的定位奠定基础。
(S)-6-氯-3-羰基-5-羟基己酸叔丁酯[(S)-CHOH]是他汀类药物合成的关键手性中间体。利用醇脱氢酶催化6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯不对称合成(S)-CHOH是很有潜力的制备路线,目前存在的主要问题是醇脱氢酶催化活性较低。首先对来源于Lactobacillus kefir DSM 20587的醇脱氢酶的四点突变体LkTADH(A94T/F147L/A202L/L199H)进行回复突变,确定了关键位点147和202,并获得比酶活提高1倍的突变体MF147L-A202L。对这两个位点进行饱和突变,获得比酶活比LkTADH提高1.47倍的突变体MF147I-A202L。其比酶活为10.17U/mg,为目前文献报道最高水平。通过动力学分析和分子对接,分析了突变位点对酶活影响的机制,为后续研究奠定了良好的基础。
实现抗癌药物的口服给药,对于癌症的化疗及患者的生活会有很大的方便性。但大多数抗癌药物直接口服给药时,由于受到胃肠道的屏蔽作用导致生物利用度降低,所以寻找一种有效的药物载体,对于实现抗癌药物的口服给药是至关重要的。纳米技术的出现,带动了纳米药物载体的发展,使得抗癌药物的口服给药有了很大的突破。对不同材料,主要包括合成高分子材料、天然高分子材料作为口服抗癌药物载体的特点以及体内体外的研究结果进行回顾和综述。
近年来,趋磁细菌及其生物自身合成的磁小体由于良好的生物安全性逐渐被人们所认识,并被用于生物工程和医学应用研究。与人工化学合成磁性纳米颗粒相比,从趋磁细菌中提取的磁小体具有生物膜包被、生物相容性高、粒径均一及磁性高等优势。趋磁细菌因磁小体在其胞内呈链状排列,具有沿磁场方向泳动的能力,也被应用于各种应用研究。因此,综述了趋磁细菌及磁小体特性,并就最近的研究进展重点综述趋磁细菌和磁小体在生物工程及医学应用等领域的最新研究进展。
随着全球变暖和能源危机日益加剧,生物丁醇因能用作清洁能源和重要化学品而备受关注。大肠杆菌(Escherichia coli)由于具有优良的遗传操作性能成为丁醇生产的底盘菌,但丁醇对细胞的毒害作用已成为提高工程菌丁醇产量的瓶颈,因而增强E. coli丁醇耐受性是提高工程菌丁醇产量的必要前提。为此,需要详细了解E. coli丁醇耐受机制。丁醇可破坏细胞膜的屏障作用、扰乱物质转运和传递功能,细胞产生与热激、渗透等胁迫类似的生理应答反应,通过转录与翻译调节应答丁醇胁迫。从上述几个方面综述了E. coli丁醇耐受机制,并总结了运用基因工程理性设计获得丁醇耐受菌株的研究进展。然而目前丁醇耐受机制尚未完全揭示,限制了理性设计策略的应用,因此概括了运用定向进化获得耐受丁醇菌株并解析丁醇耐受功能基因的反向代谢工程策略在此方面的研究进展。同时也关注和评述了最新的组合策略、化学修饰方法提高E. coli丁醇耐受性的研究。最后总结和展望了提高底盘菌株E. coli丁醇耐受性的关键策略。
铜绿假单胞菌是一种能引起多部位急、慢性感染且难以用抗生素控制的机会致病菌,近年来已成为院内感染的主要致病菌之一。大量研究表明,细菌将毒力因子精准输送至宿主细胞是其致病的关键,分泌系统在这一过程中扮演重要作用,其中近期发现的Ⅵ型分泌系统(type VI secretion system,T6SS)在铜绿假单胞菌与宿主间的相互作用和促进生物膜的形成等机制中发挥重要作用,已引起国内外学者高度关注。着重对铜绿假单胞菌T6SS的结构组成、效应功能和调节机制等相关研究进行简要综述,旨在为铜绿假单胞菌感染患者的治疗提供新策略。
转基因标识与消费者知情权和选择权密切相关,因而成为最受关注的转基因政策之一。从1997年第一个转基因标识制度诞生开始,全球已有70多个国家和地区开展了各具特色的转基因产品标识管理。2015年以来,受转基因产业发展政策、公众接受程度、农产品贸易需求、国家政治立场等多重因素的影响和作用,美国、韩国、俄罗斯、乌克兰和日本等国家相继着手调整转基因标识政策或改变实施细则,呈现出强制标识呼声高、标识范围扩大、标注方式更加明确、阴性标识更规范等特点。通过分析国际转基因标识制度及变动趋势,提出了我国转基因标识在扩大标识范围、设立标识豁免阈值和规范阴性标识等方面的管理建议。
生物基产品是指以可再生资源(如农业和林业残渣、有机废料等)为原料而生产的化工产品和绿色能源,因其环境友好的优越性已经成为社会绿色可持续发展的重要途径。近年来,欧美等发达国家纷纷出台战略政策促进生物基产业的发展。欧盟委员会对生物基的研究与创新(R&I)项目给予了政策与财政的重点支持,已经逐渐形成以BBI(bio-based industries)计划为核心的管理与资助体系。通过对欧盟生物基R&I项目的资助框架和经费分配情况的调研与分析,发现欧盟实现生物基经济目标的具体措施和实践方案,为我国生物基创新行动提出决策建议。同时,BBI计划作为欧盟新兴产业R&I体系建设的典型案例,对我国其他创新方向开展科技政策与管理机制改革也具有一定的参考价值。
