2017年, 第37卷, 第9期　
刊出日期：2017-09-25

  

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研究报告
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  人类Grx3蛋白与转录因子p65相互作用的研究

  胡可越, 程宁辉, 王新泉

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 1-6. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170901

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  巯基氧化还原酶在生物体的系统内担当着非常重要的角色，其主要介导的是巯基和二硫键之间的相互转化的反应。人类Grx3蛋白作为一种巯基氧化还原酶在谷氧还蛋白系统中有着非常重要的作用。已有的研究表明，Grx3蛋白对NF-κB信号通路的活性有十分显著的影响。p65（RELA）是人类机体内十分重要的一种蛋白质，其在NF-κB信号通路有着重要的调控作用，几乎调控着NF-κB信号通路中的所有下游反应。通过大肠杆菌提纯表达的p65与Grx3在体外条件下进行偶联实验，为p65与Grx3存在相互作用提供了强有力的证据，同时也为Grx3蛋白对NF-κB信号通路的影响机制提供了一个可能的解释。
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  人白血病抑制因子在原核细胞中的表达与纯化

  张鹤铭, 蔡楚凡, 刘杨, 甘龙站, 焦雪苗, 田永强

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 7-14. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170902

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  研究证明人白血病抑制因子（hLIF）是一种对多种不同类型的细胞和组织具有重要功能的细胞因子，其独特的生物学特性使其被广泛应用。介绍了自制的具有生物活性的hLIF，将hLIF基因克隆到pET32a中，并利用硫氧还蛋白（Trx）作为融合配体，在大肠杆菌中成功表达可溶性融合蛋白Trx-hLIF。亲和层析纯化后利用SDS-PAGE和Western blot对纯化结果进行检验。利用肠激酶（EK酶）切割融合蛋白，释放hLIF，随后通过简单的阳离子交换得到纯度高达98.1％的hLIF 4.75mg。小鼠M1髓系白血病细胞增殖分析测定纯化的rhLIF的功能与hLIF具有相似的生物活性，EC₅₀为5ng/ml，对应的比活性为0.5×107 IU/mg。
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  Thymidine Kinase 1(TK1)重组蛋白的表达、纯化及鉴定

  王云龙, 赵二霞, 李玉林

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 15-22. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170903

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  为获得具有免疫原性的TK1重组蛋白。通过构建能够表达TK1蛋白的重组菌BL21-pET32a-TK1，采用大肠杆菌pET32a表达系统，优化IPTG浓度、诱导温度、诱导时间使BL21-pET32a-TK1重组菌表达目的蛋白的作用条件最佳。表达产物用镍离子亲和层析纯化获得TK1蛋白，并用SDS-PAGE和Western blot进行检测。用TK1重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体，检测蛋白质免疫原性。实验结果表明，成功构建能够表达TK1蛋白的重组菌BL21-pET32a-TK1，在37℃条件下，IPTG浓度为0.2mmol/L、诱导6h时重组蛋白TK1表达量最高。镍离子亲和层析梯度洗脱在80mmol/L咪唑条件下TK1蛋白纯度最大，灰度分析为87.3%，浓缩后蛋白质浓度为5.96mg/ml。用该蛋白质制备杂交瘤共获得10株稳定分泌TK1抗体的阳性单克隆细胞株，表明TK1重组蛋白具有较好的免疫原性。成功获得可溶性、抗原活性高、免疫原性强的TK1重组蛋白，为肿瘤科学及临床应用研究提供物质支撑。
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  D97N突变对光受体蛋白古紫质4质子泵和能量转换效率的影响

  王娟, 郜玉娇, 孙超, 赵欣

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 23-30. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170904

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  古紫质4（archaerhodopsin 4，aR4）是新近发现的古生菌Halobacterium species xz515红膜上唯一的光敏视黄醛蛋白，具有和细菌视紫红质（Bacteriorhodopsin，bR）相似的质子泵功能，但在中性pH条件下，其质子释放和摄取顺序与bR相反。针对质子供体天冬氨酸97（Aspartic acid 97，D97）对aR4光循环；特别是对质子释放摄取顺序和菌株ATP生成率的影响，采用基因定点突变技术，构建了aR4的单突变体D97N，以及相对应的bR单突变体D96N。采用紫外-可见吸收光谱和闪光动力学光谱技术初步研究突变对视黄醛键合区、光反应中间态M态和O态、质子泵功能以及菌株ATP生成率的影响。结果表明，D97N突变对视黄醛紫外-可见光吸收波长没有太大影响，但造成M态衰减时间的显著延长、质子泵功能的消失及菌株ATP的生成率大幅降低。与bR中的D96作用相比，D97对aR4质子功能的影响有所不同，这可能与D97所处的一个更为疏水性的胞外侧环境有关。
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  海藻多糖通过下调肝癌细胞Hep3B糖酵解途径抑制细胞增殖和迁移

  冯源, 唐云, 徐蕾, 谭海刚

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 31-40. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170905

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  目的：探讨海藻多糖（algal polysaccharides，AP）对肝癌细胞Hep3B的增殖和迁移的影响及其可能的作用机制，为治疗肝癌提供新的思路。方法：①比较正常细胞与癌细胞中糖酵解（embden-meyerhof-parnas，EMP）途径的表达差异，用紫外分光光度计比色法检测EMP限速酶酶活力：己糖激酶（hexokinase，HK）、丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK），用乳酸测定试剂盒测定EMP产物：乳酸。②AP处理Hep3B后，检测EMP表达水平变化。③AP处理细胞后，检测肝癌细胞Hep3B的增殖和迁移能力及对上皮细胞-间充质转化（EMT）的影响，方法包括MTT、qPCR和Transwell小室实验。④MTT、Transwell和qPCR检测HK抑制剂3-溴丙酮酸（3-bromopyruvate，3-BrPA）对肝癌Hep3B细胞的活力和迁移能力及EMT的影响。⑤Western blot和相关试剂盒检测AP与3-BrPA分别处理细胞时，对EMP水平及Akt通路的影响。⑥AP联合3-BrPA处理HepB3后，检测HK和Akt信号通路表达水平及细胞活力和迁移的变化。结果：①癌细胞（Hep3B、HeLa、SW480）EMP代谢水平均高于正常肝细胞（HL02），其中Hep3B差异最为显著。②AP能抑制Hep B细胞 EMP代谢水平，且抑制程度随着AP浓度升高而升高，存在浓度依赖性。③AP可抑制肝癌细胞Hep3B的增殖和迁移，且抑制EMT的发生。AP浓度为200mg/ml，处理时间为48h时，生长抑制率达（55±2.8）%，细胞迁移数为对照组的（32±2.9）%；④3-BrPA可下调Hep3B细胞HK活性，并抑制细胞活力与迁移，且抑制EMT的发生。200μmol/ L 3- BrPA作用细胞48h后，与对照组相比，细胞活性下降了（52±5.8）%（P<0.001），细胞迁移数下降了（48±6.1）%（P<0.01）。⑤AP和3-BrPA均下调EMP代谢水平，且抑制Akt信号通路。⑥AP与3-BrPA联合处理Hep3B后，HK表达下降，显著抑制Akt信号通路，细胞活性和迁移能力均较AP单用组显著下降（P<0.05）。结论：肝癌细胞Hep3B EMP代谢水平高于正常肝细胞，AP可下调 Hep3B细胞 EMP代谢水平，低EMP代谢水平可能通过下调EMT和Akt信号通路抑制Hep3B的增殖和迁移。当AP和3-BrPA联合应用时，抑制肝癌迁移和增殖效果更明显。
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  鲁氏酵母胞内海藻糖积累过程的代谢特征分析

  刘翠翠, 胡梦蝶, 王志, 代俊, 姚娟, 李沛, 李志军, 陈雄, 李欣

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 41-47. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170906

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  海藻糖合成是微生物对抗环境逆境的一种重要途径。研究10L发酵罐中的分批、分批补料及分批补料控温三种不同的海藻糖发酵调控策略下酱油风味形成微生物鲁氏酵母CCTCC M2013310的代谢特征。色谱结果表明，乳酸、丙酮酸和α-酮戊二酸受到不同发酵调控模式的显著影响，但谷氨酸和谷氨酰胺总含量在三种发酵调控模式间却无显著差异。这些结果表明，细胞还原力平衡途径和碳氮调控代谢均对胞内海藻糖的积累产生影响。研究结果为鲁氏酵母CCTCC M2013310的高浓度内源性海藻糖细胞代谢工程改造提供了新思路。
技术与方法
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  Taqman多重实时荧光PCR同步定量检测6种动物源性成分方法的建立

  付理文, 张宇, 依含, 李雪, 朱乃硕

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 48-59. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170907

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  旨在建立一种可同时检测猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅6种动物源性成分的六重实时荧光定量PCR方法。根据猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅细胞核基因组保守序列，参照序列比对结果选择差异位点设计6对特异性引物和6条以不同荧光素标记的Taqman探针。通过对PCR反应体系和反应条件的优化筛选，建立能同步定量检测猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分的六重实时荧光PCR方法。应用此方法分别对18种不同源性动物DNA和200份不同来源样品进行猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分检测，结果表明，所建立的六重实时荧光PCR方法灵敏度高，对六种动物的最低核酸检测量分别为0.049ng、0.048ng、0.085ng、0.13ng、0.162ng、0.074ng（50μl体系）；特异性强，对狗、兔、鼠、驴、马、骆驼等其他12种动物无特异性扩增；200份样品的检测结果表明六重qPCR检测方法敏感，同一反应体系下实现一次对6种动物快速定量检测，耗时短、效率高、适用性广，可用于肉品、奶品、皮毛和饲料等动物产品猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅源性成分单一或混合物种的鉴别诊断。
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  新型可控性栓塞剂MNPs-tTF的构建

  陈小丽, 邹明园, 谢鑫, 王生育, 吴婷, 苏金华

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 60-64. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170908

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  目的：构建新型的具有可控性且能诱发动物血栓的栓塞剂——磁靶向凝血蛋白，从而为动物血栓模型的建立提供新工具。方法：使用化学共沉淀法合成磁流体（magnetic nanoparticles，MNPs），通过透析对其纯化后用超导量子干涉磁强针（SQUID）测定其磁性能；利用基因工程方法表达截短组织因子（truncated tissue factor，tTF） （又称为凝血蛋白）并纯化与鉴定；采用戊二醛交联法构建磁靶向凝血蛋白（MNPs-tTF），体外分析其磁控靶向性及凝血效力。结果：成功构建了磁靶向凝血蛋白MNPs-tTF，体外实验证实其保留有磁流体MNPs的磁控靶向性，以及凝血蛋白tTF的凝血效力。结论：成功构建了磁靶向凝血蛋白MNPs-tTF，为血栓模型动物的建立提供一种新工具。
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  基于电泳温度提升建立大鼠肝快速透明化模型

  袁小川, 连芳, 赵荫农, 陈闯, 黄山, 李科志, 曾爱屏, 何剑波, 邬国斌

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 65-70. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170909

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  目的：探索一种基于CLARITY技术的快速肝组织透明化手段，为该技术在肝脏上的应用提供研究基础。方法：水凝胶灌注大鼠，取出肝脏待水凝胶凝固后切为1mm薄片。切片随机分为两组，对照组采用常规被动脂质清除法处理，实验组置于特制电泳装置中，在外加电场条件下洗涤脂质，通过提高电泳温度并量化组织透明度，探索最优肝透明化条件。结果：实验组在12V电压下37℃电泳48h时肝切片相对透明度达到最高并保持至96h，随后相对透明度开始下降，而在48h电泳清除脂质后提高温度继续电泳48h，肝组织切片相对透明度可进一步提高且对照组脂质清除速率明显低于实验组。结论：在12V电压下肝组织切片37℃电泳48h再辅以52℃电泳48h可以实现较快速的脂质清除。
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  合成8二甲基异戊烯基柚皮素的人工酿酒酵母菌株构建

  李博, 梁楠, 刘夺, 刘宏, 王颖, 肖文海, 姚明东, 元英进

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 71-81. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170910

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  8二甲基异戊烯基柚皮素（8DN）作为生产黄酮类药物淫羊藿苷的重要前体，在医药合成领域具有重大应用潜力。由于其合成路径及相关基因的复杂性，目前主要通过饲喂8DN的直接前体（柚皮素、异黄腐酚等）的方式合成8DN，而在生物体内全合成8DN的研究工作还未见报道。为了实现8DN在酿酒酵母体内的生物全合成，通过组合筛选8DN前体物柚皮素合成所需的多种外源基因（TAL、4CL、CHS、CHI），获得30株柚皮素生产菌，发现不同来源的基因组合使柚皮素产量的具有明显差异（0.37~22.33mg/L）。并且利用Delta位点将较优的基因组合整合至酵母基因组，实现了稳定的柚皮素高产菌株（SyBE_Sc02050031）构建。在此基础上进一步导入带有苦参来源的异戊烯基转移酶基因（N8DT）多拷贝质粒，实现8DN合成的完整反应过程，8DN的摇瓶发酵产量达到36.7μg/L。另外，通过关键限速酶N8DT的序列优化策略，发现截断定位信号肽序列的N8DT明显提高了从柚皮素到8DN这一关键反应的催化效果，8DN的产量提高到52.6μg/L（144.2%）。首次在酿酒酵母中成功构建高产8DN的生物全合成路径，为在微生物体内合成其他黄酮类天然产物提供了参考，具有重要的指导意义。
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  微生物谷氨酰胺转氨酶催化细胞色素c赖氨酸残基的定点修饰

  张宸, 陈韶华, 吴文倩, 周建芹

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 82-88. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170911

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  研究微生物谷氨酰胺转氨酶（mTG）催化细胞色素c（Cyt c）的PEG定点修饰的可行性，并优化修饰条件，研究PEG修饰对Cyt c性质的影响。将单甲氧基聚乙二醇氨（mPEG-NH₂）与N-苄氧羰基-谷氨酰胺-甘氨酸（CBZ-QG）共价结合制备含谷氨酰胺残基的甲氧基聚乙二醇衍生物（N-苄氧羰基-谷氨酰胺-甘氨酰-单甲氧基聚乙二醇，CBZ-QG-mPEG）；mTG分别催化mPEG-NH₂、CBZ-QG-mPEG（mTG）修饰Cyt c，研究酶法定点修饰Cyt c残基的可行性；改变酶的用量、温度、反应时间和pH等反应条件优化谷胺酰胺转氨酶催化修饰Cyt c的条件。研究结果表明：①mPEG-NH₂不能作为mTG的底物修饰Cyt c，甲氧基聚乙二醇氨（mPEG-NH₂）分子上引入谷氨酰胺残基后，在mTG的催化作用下了实现Cyt c的PEG修饰，而且基于mTG的底物特异性实现了PEG定点修饰Cyt c的赖氨酸（Lys）残基；②37℃温度下，pH 8.0的溶液中，1mg/ml的mTG催化修饰反应2h是最佳修饰反应条件；③化学法PEG修饰Cyt c产物复杂，是多种多点修饰产物的混合物，酶法催化PEG修饰Cyt c只产生单一产物；④与天然Cyt c相比，修饰后Cyt c的活力、稳定性都有所提高。提出的谷胺酰胺转胺酶催化修饰法解决了蛋白质Lys残基难以定点修饰的难题，拓展了mTG在蛋白质修饰方面的应用。
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  产对香豆酸酿酒酵母菌株的构建及优化

  张伟, 刘夺, 李炳志, 元英进

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 89-97. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170912

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  对香豆酸（p-coumaric acid）作为苯丙素类物质、芪类物质及黄酮类物质的重要前体化合物，在生物医药、化妆品及食品工业中均有广泛的应用价值。以酿酒酵母作为底盘菌株，利用合成生物学原理构建一株高产对香豆酸的人工酵母细胞。通过对比不同拷贝数的酪氨酸解氨酶（tyrosine ammonia lyase）合成的对香豆酸产量，发现随着基因拷贝数的增加对香豆酸的产量也相应提高；同时对酪氨酸的负反馈调控相关的蛋白质进行氨基酸定点突变得到Aro4p^K229L和Aro7p^G141S，利用delta位点将突变后的基因整合至酵母基因组，并挑取24株构建成功的酵母细胞进行发酵验证，发现菌株最高产量与最低产量相差28.87mg/L；为了进一步增加对香豆酸的代谢通量，对生成芳香醇类物质的旁路基因 ARO10和PDC5进行敲除，发现同时敲除两个基因的菌株对香豆酸的产量最高，是敲除前产量的2.05倍（从42.71mg/L到87.56mg/L）。此外，通过设计前体酪氨酸的梯度添加实验，发现当添加1mmol/L的酪氨酸时，对香豆酸产量达到峰值（174.57±0.30）mg/L，相较于未添加时提高了将近1倍。通过运用合成生物学原理在酿酒酵母中实现了对香豆酸的高产，为后续的芪类化合物和黄酮类化合物生物合成奠定了基础。
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  亚麻芥种子油体的提取及稳定性研究

  高红桃, 郭晓威, 孙丹, 解长睿, 王法微, 李海燕

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 98-104. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170913

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  油体是植物种子内储藏脂肪的亚细胞单位，其内部为三酰甘油（TAG），外部由单层磷脂和油体蛋白组成。这种稳定的结构可以使油体抵抗环境的压力，便于应用到食品及制药工业中。对比碱法、水法、Tris-HCl法、Tricine法4种油体提取方法，对亚麻芥油体采取梯度离心法，制备亚麻芥油体，并对不同pH、温度、NaCl浓度条件下油体稳定性做初步研究。结果表明，4种方法所提取的油体大小均在0.5~1μm；相较于水法、Tricine法、碱法所回收油体被破坏，Tris-HCl法提取油体大小均一，提取率达17%。同时，油体在4 ≤ pH ≤ 7条件下，油体稳定性破坏。8 ≤ pH ≤ 10时；油体均匀分散，稳定分布。经过不同温度及NaCl浓度处理的油体均呈上浮状态，稳定性破坏。
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  基因组重排筛选高产谷氨酰胺转胺酶菌株

  宋佳雯, 田苏, 张玉如, 王志珍, 常忠义, 高红亮, 步国建, 金明飞

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 105-111. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170914

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  谷氨酰胺转胺酶（TGase）的产量不足的问题一直限制其工业化生产规模，故采用基因组重排的方法，筛选高产谷氨酰胺转胺酶菌株。通过对不同制备条件下原生质体纯度和形成率的考量，获得制备原生质体的最优条件为以6mg/ml的溶菌酶浓度进行酶解，酶解时间2h。再优化融合条件，以2min紫外灭活和40min热灭活结合的方法挑选出融合子。通过两轮基因组重排，经过96孔板发酵高通量筛选和摇瓶发酵复筛验证，获得了一株产酶达7.12U/ml的茂源链霉菌，相比最初选用菌株的平均酶活提高65.5%。发酵结果显示，酶活提高的原因可能是在重组后原酶成熟更快、更彻底，且得到的菌株遗传稳定性良好。证明基因组重排能够有效提高菌株的产酶水平，同时为谷氨酰胺转胺酶产量提高提供理论依据。
综述
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  干细胞3D支架的研究进展

  徐竹, 诸葛启钏, 黄李洁

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 112-117. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170915

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  干细胞是一类具有无限增殖潜能，可自我更新的细胞，不同的培养或诱导条件下能够分化成为不同的细胞类型。目前，随着医学治疗手段及干细胞研究的不断发展，发现干细胞可应用于很多疾病的治疗，干细胞临床应用日益广泛，逐渐成为科研工作者研究的热点。然而干细胞移植进入生物体后繁殖效率很低，无法达到需求的量，因此如何对干细胞在生物体外进行大量培养扩增、在生物体内如何更稳定地增殖分化成为迫切需要解决的难题。当前干细胞最主要的培养方法仍是2D培养，2D培养无法模拟体内的3D微环境，繁殖效率较低，正是由于2D培养局限性太多，促使国内外学者对3D培养技术和3D支架材料进行深入探索，并取得了大量成果。对3D培养技术在干细胞中的发展与应用进行概述和展望。
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  溶葡球菌酶高效表达与应用

  王曦, 陈熙明, 浦铜良

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 118-125. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170916

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  溶葡球菌酶（lysostaphin，Lys）是采用基因克隆技术使溶葡球菌酶基因实现外源表达所产生的蛋白质。它是Zn²⁺依赖的金属蛋白酶，具有肽链内切酶活性，能专一性地水解葡萄球菌细胞壁Gly五肽桥联，使金黄色葡萄球菌（特别是MRSA）细胞壁破裂，达到溶菌杀菌作用，而不产生耐药性。作为一种抗菌剂，在兽药与临床等领域具有巨大的应用潜力。综述对溶葡球菌酶的来源、作用机制、不同表达系统及前景与展望进行综述。
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  蛋白质赖氨酸乙酰化修饰对中间代谢的调控研究

  赖木兰, 陈雪岚

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 126-133. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170917

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  生命活动的中间代谢酶存在大量的赖氨酸乙酰化修饰作用，这些在特定位点进行的可逆的赖氨酸乙酰化修饰作用能精确地调控胞内各种代谢路径。因此，对中间代谢酶赖氨酸乙酰化的研究成为了当今热点。对中间代谢酶的乙酰化修饰的研究进展进行综述，并归纳了几种典型的中间代谢酶的可逆乙酰化作用及其乙酰化位点的分布和在中间代谢路径中重要的调控作用，以期为深入研究蛋白质乙酰化修饰提供参考。
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  球拟假丝酵母生物合成槐糖脂及其衍生物研究进展

  张亚光, 张传波, 卢文玉

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 134-140. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170918

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  槐糖脂是一种糖脂类生物表面活性剂，因其低毒性、生物可降解性、生物相容性及良好的生物活性而备受关注，利用球拟假丝酵母生产生物表面活性剂槐糖脂极大地加速了其产业化进程。对槐糖脂在球拟假丝酵母中的生物合成途径、关键酶的特点和基因工程改造假丝酵母合成新型生物表面活性剂的最新进展进行了综述。为扩展球拟假丝酵母作为糖脂化合物合成底盘细胞提供建议和前景分析。
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  腈水解酶克隆表达、固定化及分子改造的研究进展

  李继彬, 陈志, 陈华友

  中国生物工程杂志. 2017, 37(9): 141-147. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170919

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  随着基因工程技术的快速发展，通过对不同菌株腈水解酶基因的分析，将其克隆到表达菌株内，可以构建高效并且稳定的基因工程菌。对腈水解酶进行分子改造可以明显提高酶的活性、稳定性、底物耐受性和底物特异性等性能，为腈水解酶的工业化应用提供了可能。综述了腈水解酶的来源、结构、催化机制、克隆表达、固定化及分子改造等方面的研究进展。同时对腈水解酶的研究进行了展望，具有重要的指导意义。