髓样分化因子MyD88(myeloid differentiation factor 88)信号通路是一个具有多种调节功能的传导通路,在免疫反应、炎症反应及肿瘤的发生和发展过程中均发挥重要作用。构建猪(Sus scrofa)MyD88基因的shRNA干扰载体,并在转录水平和蛋白质表达水平对其干扰效果进行验证,以筛选出干扰效果最优的干扰载体。根据猪 MyD88 基因(GenBank登录号:KC766424.1)全长cDNA序列,利用Invitrogen公司在线设计软件设计出4对shRNA干扰序列,退火成双链后,分别将其插入到pYr-1.1载体中,构建 MyD88 基因的shRNA真核表达载体pYr-1.1-pigMyD88-sh1、pYr-1.1-pigMyD88-sh2、pYr-1.1-pig MyD88-sh3、pYr-1.1-pigMyD88-sh4,并通过双酶切和测序对其进行鉴定。构建成功后转染猪肺泡巨噬细胞3D4/2,通过Real-time PCR及Western blot验证 MyD88 基因的表达水平,以及对LPS刺激后炎症因子TNF-α基因表达水平的影响。结果表明,所构建的猪 MyD88 基因的特异性shRNA表达载体均可显著降低猪MyD88 mRNA和蛋白质的表达水平(P<0.05),干扰效率分别达到36%、67%、60%、69%;相比于未干扰组,LPS刺激MyD88沉默之后的巨噬细胞,炎症因子TNF-α基因表达水平显著下降(P<0.05),表明所构建猪MyD88干扰载体干扰效果较好。
目的:构建2型猪链球菌强毒株05ZYH33中MocR家族转录调控因子 SSU0562基因敲除的突变株,探索SSU0562 基因缺失对细菌基本生物学特性和毒力的影响。方法:构建左右两侧为 SSU0562 基因上下游的同源序列,中间部分为壮观霉素抗性基因(Spcr)的基因敲除质粒,通过同源重组的方法筛选 SSU0562 基因敲除突变株Δ0562。对突变株与野生株的基本生物学特性进行系统的比较分析,并且将小鼠作为动物感染的模型来研究突变株的毒力。结果:组合PCR的分析及基因测序结果均表明Spcr完全取代了S. suis2中 SSU0562 基因位点,表明基因敲除突变体Δ0562构建成功,反转录PCR(RT-PCR)证实了突变株Δ0562中 SSU0562 基因在转录水平的缺失;在溶血活性、生长速率及对小鼠的致病力方面,突变株Δ0562与野生株05ZYH33相比均无显著差别,然而革兰染色实验显示突变株Δ0562的成链能力明显减弱。结论:猪链球菌强毒株05ZYH33的毒力并未因 SSU0562 基因的缺失而发生显著性改变,表明 SSU0562 基因并非猪链球菌的毒力决定因子,但很有可能参与猪链球菌成链能力的调控。
组织特异性启动子作为基因工程的一种重要调控元件,在生物反应器、转基因新品种培育等领域有重要的应用前景。基于芯片数据的基因数字化差异显示分析,筛选到一个根特异表达的大麦水孔蛋白基因 HvTIP2;1,利用实时荧光定量RT-PCR方法了解该基因在不同组织和处理条件下的表达特性,并对基因启动子及功能进行了研究。结果表明, HvTIP2;1 表达具有根特异性并受植物生长发育的调控,其在成株期的表达量明显高于苗期。ABA激素处理组, HvTIP2;1 表现先上升,处理10h后又下降的表达变化趋势;铝、锰有毒金属离子处理组, HvTIP2;1 表达量明显高于对照组,但表现出上升-下降-上升的波动变化特征;盐胁迫导致 HvTIP2;1 表达量持续下降,而干旱诱导 HvTIP2;1 表达量不断升高,处理24h后表达量迅速下降,低于对照水平。利用PCR方法克隆位于基因编码区上游的启动子序列Hv1310p,该序列含有多个与根特异表达和胁迫响应有关的顺式作用元件。通过5'端缺失法分别构建514bp和1 258bp启动子的融合GUS报告基因表达载体,转基因烟草的GUS活性检测表明两个启动子片段都具有根特异性的启动活性。
应用Illumina Hi-seqTM 2000高通量测序技术对文冠果花芽进行转录组分析。共获得N50为1 180bp、平均长度为686bp的 unigene 58 311条。与公共数据库Nr和Swiss-Prot同源性比较后发现37 047条unigene获得基因注释,另有21 264条unigene未被注释。利用COG数据库将unigene分成25类。通过GO分类和KEGG Pathway富集性分析,将unigene分别归类于55个GO term 和128 个代谢途径。此外,在9 794条unigene中共搜索到12 213个SSR位点,单核苷酸重复基元出现频率最高(34.95%),其次分别为二核苷酸(32.74%)和三核苷酸(28.64%)。在获得的unigene 中发掘出涉及4 个开花调控途径(光周期途径、春化途径、GA 途径和自主途径)多个基因的同源序列。研究结果可在一定程度上解析文冠果花芽形态分化的分子调控模式与机制。
在BG-11培养液的基础上,选择不同的乙酸钠和硝酸钠浓度组合培养绿球藻Chlorococcum sp.,分析培养过程中干重、类胡萝卜素、总脂及脂肪酸成分,完成Chlorococcum sp.生长及油脂积累的评价。实验结果表明,外源碳源乙酸钠对Chlorococcum sp.的生长和油脂积累有很好的促进作用。乙酸钠和硝酸钠浓度分别为2g/L和1g/L条件下,Chlorococcum sp.培养16天后生物质产率高达276.19mg/(L·d), 同时类胡萝卜素和总脂的产率也分别高达1.347mg/(L·d)和108.59mg/(L·d), 高附加值脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)与二十二碳六烯酸(DHA)占脂肪酸总量也超过了1.5%。
为提高嗜热厌氧菌T. calidifontis Rx1的乙醇产率,通过同源重组的方式敲除Rx1乙酸生成途径的乙酸激酶(ack)基因,得到了代谢工程菌Δack突变株。分别以葡萄糖、纤维二糖、木糖和玉米芯酸水解液为底物,研究突变菌株的底物利用、细胞生长和发酵产物的变化情况。结果表明,与野生菌株相比,突变菌株的干重都有所降低,但是乳酸或乙醇的得率显著提高;当以纤维二糖为底物时,突变菌株的乙醇产量达3.60g/L,得率为0.55g/g,远高于突变菌株对其它底物的产量;以玉米芯水解液为底物时,突变菌株的乳酸产量高于野生菌株,而且野生菌乳酸、乙醇的产量都高于以木糖为底物时的产量。
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,Lm)是一种重要的革兰氏阳性食源性致病菌,它能在大多数活性或非活性固体表面形成生物被膜,从而使抗逆性大大增强并且难以清除,给食品行业造成很大困扰。SigB(σB)作为革兰氏阳性菌中主要的压力应答因子,在Lm生物被膜形成中起着重要作用,而RsbU是单核细胞增生李斯特菌SigB操纵子中的主要信号(能量和物理化学信号)传导蛋白。为检测RsbU在Lm生物被膜形成中的作用以及与SigB的关系,本实验构建了rsbU和sigB基因单缺失及双缺失突变株,比较在不同温度(25℃和37℃)和营养环境(营养丰富的BHI培养基和营养贫乏的MEM基础培养基)下,野生株和突变株生物被膜形成能力的差异。结果表明,缺失RsbU和SigB显著降低Lm在不同温度和培养基中生物被膜的形成能力;低温(25℃)和贫瘠的营养条件(MEM)更有利于RsbU传递压力信号激活SigB,从而作用Lm生物被膜的形成。
配制PLGA/HA复合生物材料,应用3D打印技术制造可移植入体内的骨支架,通过体外物理和生物学方法检测其性能,最后通过动物体内实验对其进行安全性评价。方法:使用3D打印技术打印PLGA/HA复合物立体支架生物材料,参照GB/T 1040和GB/T 9341检测支架材料的拉伸强度和弯曲强度, 验证其支持hMSC的增殖及分化能力,并按照医疗器械生物学评价标准(GB/T 16886)对支架材料进行体外和体内生物相容性及生物安全性评估。结果:成功制作了PLGA/HA复合材质的多孔3D支架材料;复合材料的机械拉伸强度和弯曲强度分别为38MPa和42MPa,是正常人软骨的5.35倍和5.25倍;体外细胞试验证明3D支架可支持hMSC增殖和分化为软骨细胞,生物安全性试验结果表明支架符合国家医疗器械生物学评价标准。
通过对猪细小病毒接毒时间TOI、MOI和收毒时间进行优化,开发了一种基于PK-15细胞静置培养的猪细小病毒生产工艺,最大病毒滴度达到107.5 TCID50/ml。通过进一步优化接毒时间,成功建立了基于PK-15细胞反应器微载体悬浮培养的猪细小病毒培养工艺,在5L反应器上最大病毒滴度达到107.2 TCID50/ml。首次发现乳酸对葡萄糖得率与病毒滴度的正相关性,当猪细小病毒滴度处于最大值时,乳酸对葡萄糖得率也达到最大值,可作为指针病毒滴度及收毒时间的重要参数。
脱氮硫杆菌(Thiobacillus denitrificans)中的Sox蛋白在硫代谢过程中起着至关重要的作用,硫化合物需先与硫氧化基因族(sox)编码的蛋白质SoxYZ二聚体共价连接后才能与其他酶发生相互作用。利用同源建模法构建硫化合物载体 SoxYZ蛋白的二聚体结构并验证了其合理性。二聚体相互作用分析发现SoxYZ蛋白的溶剂可及表面积(solvent accessible surface,SAS)为10 922.9 Å2, 疏水率为50.85%;亚基SoxY和SoxZ界面处共含有12个氢键和1个Π键来维持其三维结构的稳定性;二聚体表面呈现明显的正负电势互补,两亚基界面处氨基酸残基的VDW作用能和静电作用能分别为－80.925 13kcal/mol和－323.856 57kcal/mol,这说明静电作用是二聚体形成的主要驱动力;SoxZ亚基的残基Thr28、Arg31、Lys32、Ser64、Gly65、Val66、Ser67对SoxY亚基活性位点构象的稳定有重要作用。
为了解决地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)工业菌株难以转化的问题,将原生质体制备、电穿孔和原生质体再生技术相结合,建立了一种地衣芽孢杆菌原生质体电击转化方法。在对菌体生长状态、溶菌酶作用时间、电转电压、渗透压保护剂等条件进行优化后,试验了将不同类型的表达载体,即游离型质粒pGJ103(3.3kb)和整合型质粒pAX01(9.3kb),分别转入两株地衣芽孢杆菌工业生产菌株B. licheniformis CICC 10181和B. licheniformis CICC 20204中。实验结果显示,对数生长期后期的菌体酶解40min后制备的地衣芽孢杆菌原生质体得率为96%,再生率达25%以上。原生质体与质粒DNA在最适电压0.6kV/mm下电击转化,并以0.5mol/L山梨醇或甘露醇作为渗透压保护剂进行再生培养后,最终游离型质粒的转化率可达0.88×102~1.1×102 CFU/μg pGJ103,整合型质粒的转化率达到0.45×102~0.52×102 CFU/μg pAX01。该方法为地衣芽孢杆菌野生工业菌株的遗传改造提供了一种新的、高效的转化手段。
哺乳动物早期胚胎体外培养所用各种化学成份明确的培养基是研究生命科学中一项重要技术。它已被常规用于研究胚胎早期发育,多种动物及人类辅助生殖技术,转基因动物,动物克隆等领域。介绍了用于移植前胚胎培养基的研究和发展历史,当前所用化学成份明确胚胎培养基的主要组成,特别是针对小鼠和大鼠移植前胚胎所用各种培养基及其成份,讨论了这类培养基发展前景和研究方向。
成纤维细胞生长因子9(fibroblast growth factor 9,FGF9)是成纤维细胞生长因子家族(FGFs)的成员之一。广泛分布于人体各种组织中,它参与骨骼发育、血管形成、胚胎发育、损伤修复、细胞凋亡、神经再生、肿瘤生长等多种生理和病理的过程,可有效促进有丝分裂和细胞生长。研究发现,FGF9不仅在骨骼发育和生长期对软骨形成和成骨生成起着重要的作用,而且对卵巢癌的发生、神经再生、性腺分化等方面也有重要的影响,对 FGF9作为一个有用治疗靶点发挥作用的功能和机制仍有待进一步的发现及研究。现针对 FGF9的特点,综述了其在表达及适应征机制方面的研究进展,为FGF9进一步的研究及合理开发利用提供参考。
脂肽类生物表面活性剂由亲水的寡肽和疏水的长链脂肪酸两部分组成,根据其结构特征,可将其分为环状脂肽和线性脂肽两大类。芽孢杆菌合成的环状脂肽主要包含芬芥素、表面活性素和伊枯草菌素三大家族,其中芬芥素表现出显著的抑菌活性,在植物病虫害防治方面具有良好的应用前景。综述了芬芥素的基本结构、合成机理、抑菌性能以及生物合成强化的研究进展,旨在为芬芥素的合成与应用研究提供参考。
法国学者塞拉利尼的转基因致癌论文在学术界和国际社会引起了极大关注与争议。在对塞拉利尼论文发表的各界反应及相关研究文献追溯的基础上,对其试验材料、试验设计、数据统计等进行了分析。研究结果表明,塞拉利尼的研究,存在试验材料无法确保其结论的唯一性、试验样本不能保证其研究结论的可重现性,以及试验结果存在多种解读等问题。研究结果也对塞拉利尼论文所发杂志的审稿制度提出了质疑,认为这是塞拉利尼论文目前仍是影响国际社会对转基因安全性争议的原因之一。此外,在其施引文献中,有试验数据支撑的研究结果均表明了转基因作物饲喂动物未显著影响动物的健康。因此,"转基因致癌"是非科学研究的结论,学者和公众有必要回归科学理性的轨道探讨和解决有争议的问题。
