目的:探讨运用增强子上调肿瘤特异性启动子hTERT转录活性后,调控自杀融合基因CDTK对人肝癌细胞系Bel-7402的体内外杀伤作用。方法:将CMV增强子、hTERT启动子及CDTK自杀融合基因克隆入核糖体基因区打靶载体pHrn,构建pHr-CeTpCDTK-GFP 治疗载体并转染Bel-7402细胞,经RT-PCR、HPLC、MTT检测CDTK基因的表达和对肝癌细胞的体外杀伤效果。再将Bel-7402细胞接种到裸鼠皮下致瘤,以肿瘤杀伤载体pHr-CeTpCDTK-GFP进行瘤内转染并检测其抑瘤效果,此外将转染后的细胞接种致瘤,检测其成瘤时间及肿瘤生长曲线等,从两方面检测其体内杀伤效果。结果:成功构建了肿瘤特异性治疗载体,体外转染肝癌细胞后,经RT-PCR、HPLC证明CDTK基因能在肝癌中表达,且治疗载体在体外对肝癌细胞有明显毒性。动物实验结果发现裸鼠致瘤后治疗组血清中5-Fu浓度为7.694μg/ml,治疗组肿瘤体积与对照组相比减小6.5倍。而细胞转染治疗载体后致瘤,治疗组成瘤时间比对照组晚8天,且治疗组裸鼠的平均生存期较对照组延长16天。结论:pHr-CeTpCDTK-GFP载体能在体内外高效靶向杀伤肝癌细胞,为肝癌基因治疗提供了一种新的途径。
目的:探索结核杆菌异柠檬酸裂合酶(ICL)蛋白322位点赖氨酸(Lys322)的乙酰化修饰对蛋白功能的调控作用。方法:构建结核杆菌ICL蛋白原核表达载体pET28a-icl,并对Lys322位点进行定点突变为精氨酸(Arg,R)和谷氨酰胺(Glu,Q),体外表达纯化获得重组蛋白ICLWT、ICL322R和ICL322Q。通过Western blotting和酶活性测定来揭示Lys322位点突变前后对蛋白的乙酰化修饰水平及蛋白功能的影响。结果:Western blotting检测发现大肠杆菌表达体系获得的ICLWT、ICL322R和ICL322Q蛋白均有较高水平的蛋白赖氨酸乙酰化修饰信号,较ICLWT,ICL322R和ICL322Q突变蛋白的酶活性分别下降了大约50%和70%。结论:在大肠杆菌的表达体系中,ICL蛋白可以获得乙酰化修饰。ICL322Q突变蛋白酶活性的显著下降,揭示Lys322位点乙酰化修饰对ICL蛋白的功能存在负向调控。为未来深入探索赖氨酸乙酰化修饰对结核杆菌代谢,潜伏感染的调控作用奠定了基础。
目的:观察发状分裂相关增强子 Hey1 在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的小鼠间充质干细胞(MSCs)C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法:包装 Hey1、BMP9以及GFP的过表达慢病毒,并分别作用于C3H10T1/2细胞,RT-PCR和Western blot检测 Hey1、BMP9以及GFP的慢病毒是否包装成功,碱性磷酸酶(ALP)检测早期成骨指标ALP的变化,茜素红S染色检测晚期成骨指标钙盐沉积,MTT检测 Hey1 对BMP9调控的C3H10T1/2细胞增值的影响,流式细胞术检测 Hey1 对BMP9调控的C3H10T1/2细胞周期的影响。结果: Hey1、BMP9以及GFP的慢病毒包装成功;在成骨分化早期,过表达 Hey1 基因可促进BMP9调控的C3H10T1/2细胞的成骨分化与增殖;在成骨分化晚期,过表达 Hey1 基因可促进BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的成骨分化, 并将BMP9调控的C3H10T1/2细胞周期阻滞在G1期。结论: Hey1 基因可参与调控BMP9诱导的小鼠C3H10T1/2 细胞的早晚期成骨分化,并对细胞的增殖与周期有一定的影响。
SP0306蛋白是肺炎链球菌TIGR4菌株中的一种假想的转录因子,但其蛋白三维结构及生物学功能尚未明了,生物信息学分析提示其可能调控碳水化合物代谢相关基因的表达。成功构建了SP0306蛋白的全长表达载体PET28a-sp0306,利用大肠杆菌BL21(DE3)菌株进行原核表达,获得了以可溶形式表达的目的蛋白。经Ni-NTA柱亲和层析及DEAE阴性离子交换层析纯化后,获得了高纯度的目的蛋白。采用悬滴气相扩散法获得了质量较好的SP0306蛋白晶体,并初步进行了晶体X射线衍射,为其最终的三维结构解析及生物学功能研究奠定了基础。
由于缺少适合的内参蛋白,所以用Western blot的方法来研究鸭疫里默氏杆菌蛋白表达的调节尚未见报道。以鸭疫里默氏杆菌基因组为模板,PCR扩增含有组氨酸标签His-tag的recA基因和截段的recAP基因,并分别将其克隆于原核表达载体pET32a。将重组质粒转化到表达菌Rosetta中,经1mmol/L的IPTG诱导进行蛋白质表达。用组氨酸标签亲和试剂镍-琼脂糖进行重组蛋白质的纯化。用纯化的重组蛋白对4周龄的昆明鼠进行免疫,制备多克隆抗体。Western blot实验表明,截段表达的RecAP的多克隆抗体血清比全长RecA蛋白的多克隆抗体血清与鸭疫里默氏杆菌总蛋白反应更特异;在铁离子限制性环境和血红素丰富环境中培养的鸭疫里默氏杆菌的RecA蛋白表达量一致。因此,鸭疫里默氏杆菌的RecA蛋白可以在铁离子和血红素代谢等研究中作为Western blot的内参蛋白。
14-3-3γ作为蛋白质与蛋白质之间的"桥梁蛋白",广泛参与细胞凋亡、细胞分裂、信号转导和蛋白质合成等生物体所有的重要生命活动的调节。以体外培养的荷斯坦奶牛(Vaccas)乳腺上皮细胞(dairy cow mammary gland epithelial cells, DCMECs)为模型,研究14-3-3γ对奶牛乳腺上皮细胞乳蛋白、乳脂合成的影响。瞬时和稳定转染pGCMV/IRES/EGFP/14-3-3γ即14-3-3γ过表达的奶牛乳腺上皮细胞,应用CASY细胞活力分析仪分析细胞活力的变化,测定细胞中甘油三脂(triglyceride, TG)和β-酪蛋白(β-Casein,CSN2)的合成,并且通过Western blot检测DCMECs中mTOR(mammalian target of rapamycin, mTOR)和p-mTOR的表达量,探究14-3-3γ影响奶牛乳腺上皮细胞生理功能的机制。结果显示,瞬时和稳定转染pGCMV/IRES/EGFP/ 14-3-3γ 的奶牛乳腺上皮细胞相对正常培养的奶牛乳腺上皮细胞,细胞活力极显著增强(P<0.01),CSN2和TG表达量极显著增加(P<0.01),同时mTOR和p-mTOR的表达量也显著增加(P<0.01)。研究结果表明14-3-3γ参与泌乳关键信号通路即mTOR信号通路,能够增强乳腺上皮细胞活力,促进奶牛乳腺上皮细胞CSN2和TG的合成,丰富了奶牛泌乳信号通路,为乳品质研究提供了新的理论依据。
为了提高茂源链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的产量,研究了甲壳素对茂源链霉菌发酵产酶的影响。结果表明,添加0.5%的甲壳素对茂源链霉菌发酵产酶的促进效果极显著,但甲壳素的添加量达到2%时反而会抑制菌株产酶。从菌株生长代谢过程中pH变化、产酶情况、发酵液中蛋白含量及总氮含量等方面,对甲壳素促进茂源链霉菌发酵产酶的作用机理进行了初步探讨。研究显示,甲壳素在茂源链霉菌发酵过程中对菌体生长产生一定的胁迫,刺激菌体大量分泌次级代谢产物,从而提高茂源链霉菌的产酶。对菌株发酵过程的显微观察则表明,甲壳素也可能通过分散菌体生长,提高菌体向胞外分泌谷氨酰胺转胺酶的量来促进产酶。
目的:利用实验室构建的微流控芯片对乳腺癌细胞(MDA-MB-231)进行捕获,提高捕获率并保证细胞活性,实现再培养。抗肿瘤药物阿霉素处理正常培养和再培养的细胞,分析细胞内的基因表达变化。方法:对微流控芯片进行基底修饰, 利用MUC1抗原与抗体特异性结合捕获肿瘤细胞,优化捕获条件提高捕获率。对微流控芯片捕获的细胞进行分离、收集和再培养。用1μmol/L 阿霉素对正常培养和再培养的细胞分别孵育24h,然后提取RNA并逆转录合成cDNA。选择乳腺癌细胞中高表达及与肿瘤转移相关的基因 FN1、ITGA6和LAMB3 设计引物,以cDNA为模板分别进行RT-PCR扩增,对琼脂糖凝胶电泳结果进行灰度分析。结果: 经MUC1抗体修饰的微流控芯片能有效地捕获肿瘤细胞,捕获率达80%±3%,释放率约98%,细胞释放后存活率高实现再培养。阿霉素对正常培养和再培养的乳腺癌细胞中 FN1、ITGA6 和LAMB3 的基因表达均有抑制作用。结论: MUC1抗体修饰的微流控芯片能有效捕获乳腺癌细胞并实现再培养,捕获前后细胞内基因表达无显著差异,均能产生药物敏感性。
目的:采用三种不同的脱细胞方法制备小肠黏膜下层(small intestinal submucosa,SIS)支架,研究其生物相容性、免疫原性以及构建真皮替代物等方面,为组织工程化皮肤的细胞载体支架提供优选方案。方法:将新鲜猪小肠分别采用单纯机械法、机械-化学法、机械-酶消化法制备三种不同的SIS,分别作为A、B、C组;通过复合成纤维细胞构建真皮替代物,利用HE染色观察支架组织学形态以及细胞粘附情况、MTT法检测细胞增殖情况,同时观察支架移植SD大鼠皮下1、2、4周后炎症反应及血管化程度。结果:组织学观察A组有细胞残留,B、C组未见细胞残留。MTT结果显示细胞在支架上生长旺盛增殖能力强,其中A组优于B、C组;皮下移植后的HE结果表明B组引起炎症反应较A、C组弱,而C组血管化程度较A、B组更明显。结论:机械-化学法以及机械-酶消化法制备的SIS具有良好的生物相容性以及免疫原性,可作为构建组织工程化皮肤细胞载体的选择。
hpt是转基因植物中最常用的筛选标记基因之一,建立了HPT蛋白质免疫印迹检测技术、了解其在转基因植物中的表达特征具有重要的理论意义和应用价值。在大肠杆菌中进行了HPT蛋白质的重组表达,利用纯化的HPT蛋白质制备了其特异性的单克隆抗体,采用免疫印迹学方法对转基因水稻4021中HPT蛋白质的表达情况进行了检测,该方法可检测出单粒稻米的10%(约1.5mg)所含的HPT蛋白质。定量分析发现水稻苗期HPT蛋白质含量约占鲜重的0.01‰。对CaMV35S启动子驱动下的转基因水稻中HPT蛋白质的表达谱进行分析,发现其在苗期和成株期的叶片中表达量较高,在灌浆期的种子中呈现不断增加的趋势,而在茎、分蘖节、茎节、叶鞘、叶枕和根等组织中表达量较低。建立了完整的利用免疫印迹方法检测HPT蛋白质的技术,同时系统分析了HPT蛋白质在转基因水稻中的表达谱。
琼脂糖是一种来源丰富、成本低廉的天然高分子材料,具有生物安全性和可降解性,利用其凝胶化现象可制成形状可塑的具有三维网络结构的凝胶。与其他天然材料相比,琼脂糖凝胶在机械性能上具有一定优势,如抗拉伸/压缩性、粘弹性、流变性等。其特殊的防粘连作用,使其必须与其他材料复合或者选用适宜的定型方式制成组织工程支架,以提高支架的组织相容性,用于填充、修复或者再生机体缺损组织。琼脂糖在组织工程领域的研究历史虽然不长,但在软骨、神经、骨、角膜和口腔黏膜等方面已经取得一些研究成果,其独特的微观结构和力学性能使其在软骨组织工程方面的研究最为广泛。目前,琼脂糖的组织工程研究离临床应用还有一段距离,材料制备和作用机理探索将是未来研究的重点。
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)是成纤维细胞生长因子家族(FGFs) 的成员之一。它是哺乳动物和人体中一种非常微量的活性物质,因其具有广泛的生理功能和重要的临床应用价值受到了国内外学者的高度重视。bFGF生物活性的多效性以及神经营养的广谱性,为其从基础走向临床提供了保证。而bFGF如何发挥神经损伤修复作用的功能和机制,仍有待进一步的发现及研究,这也是目前国内外探索和开发bFGF新临床药物的研究热点之一。针对bFGF的生物学特点及其在神经损伤修复中的功能,特别是在中枢神经系统和外周神经系统疾病中的研究进展进行了综述。
RNAi是一种序列特异的同源依赖型基因沉默现象,在真核生物中普遍存在,是生物体抵抗核酸入侵、调控自身基因表达的重要途径。RNAi发现以后,很快就作为一种反向遗传学手段广泛应用于基因功能鉴定,并且在作物改良中得到了广泛应用,在作物抗病毒及品种改良方面得到了成功应用。近年来,随着对RNAi机制认识的不断加深,RNAi技术作为一种增强植物抵抗线虫、草食昆虫、真菌等有害真核生物的新策略的研究逐渐展开,并取得了一定成果,展现出良好的发展前景。对RNAi及其在增强植物抵抗有害真核生物方面的研究进展进行了综述,并对RNAi作为一种持久抗病虫育种策略的前景进行了展望。
自然感受态是指菌体在自然生长过程中吸附、摄取和内化外源DNA的生理状态。大部分细菌具有相似的DNA摄取机制,该机制主要由两部分组成:外源DNA在多种感受蛋白的共同作用下被核酸酶降解为单链DNA进入细胞,然后单链DNA在DprA、SsbB和RecA等蛋白的保护下整合到受体染色体上。目前对变形链球菌自然感受的调控系统研究较为广泛,拟以变形链球菌为例,结合其他细菌介绍自然感受的研究进展。ComX是变形链球菌的感受核心调控因子,可以激活多种后期感受基因的转录,这些后期感受基因对外源DNA的摄取发挥着重要作用。以变形链球菌的comX为核心,梳理总结了ComDE、ComRS、HdrRM、BsrRM和RcrRPQ等系统对comX的调控机理,分析了ComX稳定性及其对后期感受基因的调控,阐述了自然感受与生物膜形成、耐酸性和细菌素合成等毒力因子的内在联系,在此基础上展望了自然感受未来可能的研究方向。
抗体类生物治疗药物的活性测定在质量控制中至关重要。目前抗体药物的活性分析方法主要是体外(in vitro)检测,其中基于细胞的分析方法由于其具有操作简便,周期短,特异性好,变异度小等优点得到广泛应用。为了获得反应性理想的细胞和简便易行的检测方法,构建转基因细胞成为目前常用的策略之一。此外,一些新型技术也快速应用于抗体类药物的活性评价中。结合抗体类生物治疗药物活性测定方法的现状以及发展趋势,主要从基于细胞、转基因细胞以及新技术应用三方面对抗体药物活性测定方法进行简要综述,为抗体药物的研发和质量控制提供新思路。
CRISPR/Cas9技术是一种新型的基因组定点编辑技术,具有设计简单、特异性强、效率高及可以在目标位点产生多种类型的编辑结果等特点,适用于在多种细胞中进行大规模的基因编辑。综述了CRISPR/Cas9技术的研究背景、基本原理和研究进展,从靶基因敲除(knock-out)、外源基因整合(knock-in)和目标基因转录沉默(knock-down)等方面总结了CRISPR/Cas9在转基因动物中的应用概况,并对现有的三种基因组定点编辑技术进行了比较。CRISPR/Cas9技术在转基因动物中具有明显的应用优势和良好前景。
以科学引文索引SCIE数据库为数据源,下载水稻转基因研究领域的文献记录,利用TDA软件、Histcite软件和可视化工具Citespace,重点对1988年到2013年间的文献数据进行统计与分析。通过分析该领域的发文数量、发文期刊、主要研究机构、发文作者和主题词,绘制可视化图谱,揭示水稻转基因研究领域的研究趋势、国家、机构、研究者以及研究热点和前沿,并以此帮助科研人员快速把握该研究领域的脉络和概貌。
从中国转基因科普的实践入手,结合国内外经验研究,从传播学、心理学和社会学的维度,辨析了当前转基因科普面临的困境,梳理了公众转基因态度极化和固化的原因。科学知识与转基因接受度的相关度弱,信任、价值和科学体制等诸多因素影响着大众对转基因的态度。据此,提出了中国转基因科学传播的五点可能路径。
