目的: 探讨OPCML与胃癌临床病理学因素和预后的关系,并分析OPCML基因对胃癌细胞株AGS生物学行为的影响。方法: (1)免疫组织化学方法检测118 例胃癌组织中OPCML蛋白的表达,并分析其与胃癌临床病理学特征和预后的关系。(2)RT-PCR 法检测OPCML在正常胃粘膜组织及7株人胃癌细胞中基因的表达情况。(3)构建重组质粒pcDNA3.1-OPCML,转染至胃癌细胞株AGS中,采用CCK8法、平板集落形成实验分析OPCML表达上调对AGS生物学行为的影响。结果: (1)OPCML在胃癌组织中低表达的占68.6%,OPCML表达与胃癌浸润深度和分化程度密切相关(P<0.05);OPCML的表达、胃癌浸润深度、淋巴结转移和远处转移是影响患者预后生存率的重要因素(P<0.05)。(2)OPCML在胃癌细胞的mRNA表达水平显著低于正常胃粘膜组织。(3)RT-PCR显示pcDNA3.1-OPCML转染后AGS细胞株中OPCML mRNA表达水平明显升高,CCK8实验、平板集落形成实验均显示OPCML基因对AGS细胞增殖有显著抑制作用。结论: OPCML在胃癌发病中发挥肿瘤抑制作用,可能是一个新的胃癌预后评估的指标。
硫利达嗪(Thioridazine,THO)在临床上通常用于治疗精神类疾病;近年来,研究发现THO对肿瘤细胞具有杀伤效果,但其对肝癌干细胞的杀伤作用还未曾有报道。肿瘤干细胞在肿瘤的转移、复发及耐药性方面起着十分重要的作用。利用体外悬浮培养富集肿瘤干细胞并检测药物THO对其杀伤效果,并以此评价THO对肿瘤生长的体外抑制效应。通过检测体外悬浮培养肝癌干细胞在肿瘤干细胞相关因子表达、耐药性及细胞周期等方面因素,显示在一定程度上其具备肿瘤干细胞样特征,磷酸化STAT3、NANOG和XIAP表达显著上调,而Albumin表达下调;进一步运用MTT、Western blotting和细胞流式等实验验证了THO对肝癌干细胞具有较强的杀伤效果并能诱导caspase依赖的细胞凋亡,而对分化的肝癌细胞影响较弱;此外,THO和化疗药物盐酸阿霉素(DOX)的联合使用显著增强了其对肝癌干细胞和分化的肝癌细胞的杀伤作用。因此,该结果首次显示THO对肝癌干细胞具有较强的杀伤能力,可能为今后肝癌的临床治疗带来新的希望。
家畜胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)的研究进展缓慢,绵羊ES细胞的研究虽早有报道,但仍未建立可稳定传代的细胞系。在已建立的绵羊体外受精发育体系的基础上,摸索了饲养层(Feeder)细胞对绵羊ES细胞生长的影响,包括在一定的丝裂霉素浓度下处理Feeder的时间、细胞种类、代数、接种密度及新鲜制备和冷冻复苏后的Feeder细胞,通过试验比较研究,目的在于筛选合适的饲养层细胞,为建立绵羊ES细胞体外培养体系奠定基础。结果表明,10 μg/ml丝裂霉素C处理2~2.5h获得的1~5代的SEF和1~3代的MEF及两者的1:1混合细胞都能较好地支持绵羊ES细胞的生长。
目的:铵离子是细胞内合成各种核酸、氨基酸和辅助因子等含氮化合物的重要原料之一。微生物细胞膜上的铵载体蛋白介导了铵离子的转运。通过异源表达刺糖多孢菌中铵载体蛋白基因,研究其对链霉菌产孢能力和次级代谢产物产量的影响。方法:从刺糖多孢菌S04-41菌株中克隆铵载体蛋白基因amtS,通过接合转移导入天蓝色链霉菌M145和变铅青链霉菌TK24中,分析比较amtS基因的异源表达对其产孢能力和次级代谢产物产量的影响。结果:天蓝色链霉菌重组菌株M145/pMF-amtS和变铅青链霉菌重组菌株TK24/pMF-amtS中放线紫红素的产量分别提高了2.85倍和30.02倍。结论:刺糖多孢菌中的铵载体蛋白能够提高链霉菌中次生代谢产物的产量,为进一步研究该基因的功能与对刺糖多孢菌中多杀菌素合成的作用奠定了重要基础。
目的: 探讨重楼/七叶一枝花(Paris polyphylla)的醇提物单体pp-10诱导人胃癌BGC-823细胞凋亡和自噬及其分子机制。方法:采用MTT法和克隆形成抑制实验观察不同浓度的重楼单体pp-10对人胃癌BGC-823细胞的增殖抑制作用;Hoechst33342染色法检测pp-10作用于人胃癌BGC-823细胞后细胞核形态的改变;AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡;Western blotting检测重楼单体pp-10对细胞凋亡和自噬相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、(ADP-核糖)聚合酶(PARP)、Bax、Bcl-2、LC3、P62以及PI3K /Akt信号通路相关蛋白(Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、P70s6k、p-P70s6k)表达的影响。结果:重楼单体pp-10能显著抑制BGC-823细胞的生长,作用呈时间-效应关系及剂量-效应关系;克隆形成抑制实验表明随着pp-10浓度的增加,细胞克隆形成逐渐减少,与对照组相比有显著差异; 在荧光显微镜下观察可见其细胞核固缩、边聚、裂解等细胞凋亡形态学变化;流式细胞术检测显示,随着作用药物浓度的增高,其凋亡率逐渐升高;Western blotting结果表明,随着药物浓度的增加,线粒体相关凋亡信号通路蛋白Caspase9、Caspase3及PARP均出现酶切活化条带,细胞促凋亡蛋白 Bax的表达水平增加,抗凋亡蛋白Bcl-2减少,自噬相关蛋白Ⅱ型LC3增加,P62蛋白减少,p-Akt蛋白的表达水平下降,Akt下游蛋白p-mTor、p-p70S6K表达减少。结论: 重楼单体pp-10通过抑制BGC-823细胞增殖,诱导细胞凋亡和自噬,与下调P13K/Akt信号通路有关。
以维氏气单胞菌B565基因组DNA为模板,扩增得到β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶 nag565基因,构建nag565 -pET28a表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达。经过分析与预测, nag565 氨基酸序列与其他气单胞菌属相似,NAG565蛋白序列分析预测其含有一个信号肽、一个碳水化合物结合结构域、两个糖苷水解酶20家族催化结构域和一个β-氨基葡萄糖苷酶 C端结构域。通过Ni-NTA纯化获得的NAG565纯蛋白比活为7328U/mg,并对其酶学性质进行了初步研究,NAG565在pH7.0保持最高活性,并且在pH5.0~9.0范围内稳定,最适温度为37℃,0~30℃对其酶活无明显影响,并对多种金属离子和蛋白酶具有良好抗性,符合水产动物的养殖环境条件(养殖温度20~30℃,多数养殖鱼胃肠道pH值呈中性并含有蛋白酶),为其在水产养殖等领域的应用提供了理论基础。
目的: 构建呈递HPV16 E7 CTLs抗原表位的病毒样颗粒,并初步评价病毒样颗粒作为治疗性疫苗载体的潜能。 方法: 根据文献选择有效的HPV16 E7 CTLs表位,合成其正负链寡核苷酸序列,并通过退火形成双链DNA片段。将片段克隆于表达乙肝核心抗原的重组质粒pThioHisA-HBcAg,使抗原肽得以呈现于病毒样颗粒。重组菌经IPTG诱导后经SDS-PAGE鉴定目的蛋白表达。菌体破碎后经硫酸铵盐析法和蔗糖密度梯度离心进行纯化,并经高效液相凝胶过滤色谱和电镜鉴定病毒样颗粒的存在。制备的病毒样颗粒免疫接种了TC-1细胞的肿瘤模型小鼠,检测小鼠肿瘤大小。此外,在体外以抗原肽刺激脾细胞,以ELISA检测IFN-γ表达水平。结果: 构建的三个重组表达质粒经酶切鉴定及测序分析证实构建正确。表达的重组蛋白大小与预期相符,并形成了病毒样颗粒。免疫小鼠后显示了抑制肿瘤增长的一定作用趋势。此外,抗原肽体外刺激促进了疫苗免疫小鼠脾细胞IFN-γ的表达,显示疫苗引起机体产生E7特异性的细胞免疫应答。 结论: HBcAg VLPs是有潜能的治疗性疫苗载体。
目的:建立以蛋白酶Neprilysin(NEP)为靶点的高通量药物筛选模型,应用该模型筛选抑制剂。方法:利用毕赤酵母表达系统。构建重组质粒pPICZα-A-NEP,表达载体通过与酵母菌X-33基因组染色体发生同源重组,将外源基因整合于染色体后实现目的蛋白的表达。应用荧光共振能量转移法(FRET)检测蛋白酶活性,优化反应条件,建立药物筛选体系,筛选抑制剂。结果:成功构建表达载体pPICZα-A-NEP;建立了以NEP为靶标的药物筛选模型,获得模型反应动力学参数Vmax=3.6μM/s, Kcat/Km=4.5×105M-1s-1,测定模型Z-因子为0.89,说明体系稳定可用于以NEP为靶标的药物的高通量筛选;并用该模型对天然产物组分库进行筛选,在0.5mg/ml的药物浓度下,得到抑制率较高的药物为4种,并测得半数抑制浓度IC50值,其中MDCNCL01000242的IC50值最低,为(8.31±0.03)μg/ml。结论:建立的药物筛选模型较为理想,适用于NEP抑制剂的筛选,可促进药物的研发。
头孢菌素C酰化酶能直接将头孢菌素C(CPC)转化为7-氨基头孢烷酸(7-ACA),此一步酶法具有很大的经济价值,所以得到很多研究者的关注,特别是提高CPC酰化酶活性及专一性的研究。以CPC酰化酶基因 ecs50 为基础,利用重叠延伸PCR,对文献报道的活性提高的突变体酶S12的6个位点分别进行突变,将得到的6个突变体V122A、G140S、F297N、I314T、I415V、S710L进行诱导纯化后,检测酶活,以此来研究不同突变位点对酶活力的影响。结果V122A的比活为106U/mg,它的转化效率比初始酶提高23.7%。
目的:制备Her2抗体与海兔毒素MMAE的偶联物,检测该抗体-药物偶联药物(ADC)对于乳腺癌细胞的抑制作用。方法:将Her2抗体通过一个可降解的linker与小分子毒素(MMAE)连接起来,形成抗体药物偶联物(ADC)。通过细胞学试验检测Her2抗体-MMAE偶联物对于肿瘤细胞抑制、细胞凋亡和细胞周期的作用。结果:通过优化偶联条件,ADC偶联率达80%以上。肿瘤细胞生长抑制的实验显示ADC药物的IC50比单克隆抗体的IC50明显降低,作用效果更加明显。细胞凋亡和细胞周期实验结果表明,ADC药物72h诱导细胞凋亡率高达40%,单一抗体药物则仅为20%。结论:该ADC药物具有很好的抑制乳腺癌细胞的作用。
以游动放线菌(Actinoplanes)BCLP-016为出发菌株,采用常压室温等离子体(ARTP)诱变技术对其孢子进行处理,并将三个不同时间处理的孢子悬液混合。稀释涂布后,根据菌株菌落形态挑取部分单菌落进行初筛,经发酵复筛后,筛选得到了一株雷帕霉素高产菌株ARTP-039,其雷帕霉素的产量可达到369.39mg/L,较出发菌株BCLP-016的产量256.86 mg/L,提高了43.81%。以筛选出的ARTP-039高产菌为出发菌株,进行传统的紫外诱变,选取高、中、低三个致死率相对应的时间对其孢子悬液进行处理,并基于核糖体工程的理论选取了链霉素、庆大霉素、利福平、氯霉素和红霉素五种抗性物质,进行抗性初筛。发酵复筛后,最终筛选得到了一株雷帕霉素高产菌株St8+Gen6+Rif9+Chl3+Er4-015,该菌株同时具有五种抗性。该菌株的摇瓶实验结果表明,发酵7d后,其雷帕霉素的产量可达到589.79mg/L,较出发菌株BCLP-016的产量,提高了129.61%,且其遗传稳定性良好。
重组基因工程菌经中试发酵后,诱导表达出以包涵体形式存在的重组大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)蛋白。采用Q Sepharose High Perfomance 阴离子交换层析,将洗涤、裂解后得到的可溶性蛋白进行纯化,得到纯度高达98%的重组LTB蛋白。利用Sephadex G-25分子筛层析法将重组LTB蛋白中的盐和尿素脱去,使蛋白复性,最终获得目的蛋白纯度为95%。将得到的重组LTB蛋白进行免疫双扩散实验,结果表明此蛋白具有良好的生物学活性。通过高效表达重组LTB蛋白的大肠杆菌发酵,确定了其中试发酵工艺,并建立了Q柱一步纯化即可获得目的蛋白的方法,该工艺简捷、高效、易于工业化生产,为重组LTB蛋白的生产和应用奠定了基础。
冠状病毒广泛存于自然界中,人和多种动物均易感。虽然冠状病毒具有相对严格的宿主特异性,但是其广泛的宿主性及其自身基因组的结构特性使得该病毒在进化过程中极易发生基因重组和突变,新型冠状病毒在此过程中不断出现。近年来,反向遗传学技术的发展为冠状病毒跨种属传播及致病机制、疫苗以及抗病毒药物的研发开辟了新的思路。对冠状病毒反向遗传操作技术的进展及其应用现状进行了简要综述与展望。
转基因动物乳腺生产人类重组蛋白人血清白蛋白(hSA)、人纤维蛋白原(hFIB)、人蛋白C (hPC)、人凝血因子(hF-Ⅷ) 和(hF-Ⅸ)等具有较高市场潜力,使其在医学领域获得广泛应用。对转基因动物乳腺生物反应器的优势、目的基因选择、载体构建、基因工程技术、重组蛋白在肿瘤治疗上的应用、当前困境和未来前景等方面进行较为全面的综述,以期能有助于转基因动物生物反应器的研究。此外较详细地探讨了利用 CRISPR-Cas基因打靶技术生产高表达量的人类重组蛋白的可能性。
甾体生物碱(SA)主要是茄属植物体内的一种次级代谢产物。它复杂的结构多样性决定了生物活性的多样性。它的合成途径也比较复杂,尚不十分清楚。以生物碱类化合物的化学结构为基础,对近几年来茄属生物碱的研究现状进行了简要综述。主要论述了茄属生物碱的化学结构、含量分布、生理活性以及与茄属生物碱合成途径相关的分子生物学研究。并分析了茄属生物碱今后的发展方向。以期为以后研究糖苷生物碱的生物合成途径、毒性机制、药理学作用等奠定一定的基础。
环糊精葡萄糖基转移酶(CGTase,EC 2.4.1.19)是一种多功能酶,主要用于生产环糊精(CD)、糖基化碳水化合物,同时在食品行业也有重要作用。为改善CGTase在这些方面的应用性能,筛选出优势突变酶,异源表达、定点突变、固定化等技术被研究和应用,取得了实质性的进展。综述了CGTase基因高效异源表达策略,概述了基因改造CGTase的研究进展,并且还总结了用于改造CGTase的其他手段,例如固定化酶、嵌合酶、化学添加剂等,以期为在相关CGTase研究领域开展研究提供参考。
透明质酸是一种以葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖胺为双糖单位交替连接而成的黏多糖。由于其具有独特的分子结构和理化性质,已被成功应用于化妆品、医学美容、眼科手术、关节炎治疗等。对最近几年国内外透明质酸及其衍生物,尤其是海洋生物来源的透明质酸的制备以及将不同分子质量的透明质酸作为新型药用载体及其他方面的研究进展进行了综述。
