中国生物工程杂志

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姜博, 毕研伟, 张营营, 蔡路奎, 姬秋彦, 李智华, 徐维明

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 1-6.

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目的:将编码HPV16衣壳蛋白L2的65~71、112~120免疫优势表位连接到RNA噬菌体衣壳蛋白AP205氮端,组装形成病毒样颗粒,通过在大肠杆菌中实现表达及纯化,对其免疫原性进行研究。方法:合成编码AP205衣壳蛋白基因和HPV16 L2的65~71、112~120位氨基酸表位的基因序列,PCR连接并克隆至pET30a(+)原核表达载体,构建重组表达质粒pET30-AP205-HPV16ΔL2,转化大肠杆菌BL21(DH3)感受态细胞,IPTG诱导表达。表达蛋白经凝胶层析纯化及SDS-PAGE、Western blot等理化性质检测,免疫接种ICR小鼠,通过间接ELISA法检测其免疫原性。结果:成功构建重组表达质粒,重组蛋白在大肠杆菌中以可溶性表达,透射电镜观察可见典型病毒样颗粒,该VLP在动物实验中表现出较好的免疫原性。结论:成功将HPV16 L2表位偶联AP205以形成VLP,在大肠杆菌中实现可溶性表达。

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小鼠胚胎干细胞对黑色素瘤细胞体外生物学行为的影响

张小梅, 方廖琼, 王智彪

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 7-12.

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探讨体外共培养环境中小鼠胚胎干细胞对小鼠黑色素瘤B16细胞的影响。建立C57BL/6小鼠胚胎干细胞系,通过小鼠胚胎干细胞与肿瘤细胞体外共培养模型观察小鼠胚胎干细胞对肿瘤细胞的形态及生长行为的影响,MTT法与transwell小室法分别检测共培养后肿瘤细胞粘附性、迁移性及侵袭性的变化。共培养中小鼠胚胎干细胞能够侵入并推开小鼠黑色素瘤细胞形成自己的生长空间,与对照组比较共培养后肿瘤细胞的粘附性、迁移性及侵袭性均显著降低(P<0.05,P<0.01)。结果表明体外共培养体系中小鼠胚胎干细胞能够侵袭肿瘤细胞,并降低细胞粘附、迁移及侵袭相关恶性生物学行为。

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Y盒结合蛋白1单克隆抗体的研制、表位测定及其免疫学应用

李朴, 史静, 成凤, 梁勤东, 匡文斌, 王秦, 董晋豫, 涂植光

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 13-19.

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建立稳定分泌抗人Y盒结合蛋白1单克隆抗体(anti-YB-1 mAb)的杂交瘤细胞株,鉴定其表位与免疫学应用。将重组 YB-1 蛋白免疫 BALB/c 小鼠,取脾细胞与 Sp2/0 骨髓瘤细胞融合。经 ELISA 法筛选鉴定、定株后采用腹水诱生法制备 anti-YB-1 mAb;Protein G 亲和层析法纯化 mAb,ELISA 法测定 mAb 效价、亚型及相对亲和力。采用抗原表位预测法鉴定 anti-YB-1 mAb 识别表位所在区域。Western blot 和免疫组化鉴定 mAb 识别内源性 YB-1 的特异性。经筛选鉴定获得 2 株稳定分泌 anti-YB-1 mAb 的杂交瘤细胞 (1-D9,3-E8);腹水抗体效价均 ≥ 1×10^-6,亚型均为 IgG_l;1-D9 和 3-E8 单抗识别表位分别位于(134-160aa)与(266-303aa)肽段。Western blot、免疫组化结果证实 anti-YB-1 mAb 能特异性识别内源性 YB-1。该研究为 YB-1 免疫学定性、定量检测方法的建立、肿瘤靶向抗体治疗及进一步探讨 YB-1 的生物学功能奠定了基础。

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褪黑素对绒山羊皮肤FGF5等绒毛生长相关基因的影响

赵德超, 付绍印, 吕晓曼, 吴江鸿, 张燕军, 李金泉, 王志新, 张永斌, 张文广

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 20-26.

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目的:旨在分析埋植褪黑素后对绒山羊皮肤绒毛生长相关基因表达的影响,进而探讨褪黑素促绒毛生长的机理。方法:以内蒙古白绒山羊为研究对象,选取体况相近的4月龄母羔羊10只,按试验要求随机分为2组,处理组按照2mg/kg BW(体重)的剂量每两个月耳后皮下埋植褪黑素,对照组不埋植,试验时间为1年。实验开始后每月采集绒山羊体侧皮肤和毛样,利用荧光定量PCR技术检测9个绒毛生长相关基因的表达变化。结果:(1)埋植褪黑素后各个基因的平均表达水平都有所上调,其中显著上调FGF5(P<0.0001),而对β-catenin、MSX-2、 Wnt10b、 BMP2、BMPRIB、NTRK3、Delta1、hairless等无显著影响(P>0.05);(2)埋植褪黑素明显提高了FGF5与hairless的相关性,并且使FGF5与β-catenin、NTRK3的相关性由负相关变成正相关,与Wnt10b的相关性降低,FGF5与其余4个基因的相关性变化不大。结论:结果提示,褪黑素上调绒山羊皮肤FGF的表达,影响FGF5与hairless、β-catenin、NTRK3之间的相关性;山羊中FGF5基因对被毛表型的作用与其他动物不同;褪黑素对复杂组织和单个细胞的作用不同;MAPK信号通路是受褪黑素影响最大的一个信号途径。推测褪黑素可能通过调节绒山羊皮肤中RORα来发挥作用,影响FGF5与hairless、β-catenin、NTRK3和Wnt10b等的相关性,同时抑制MSX2和BMP2的功能,进而促进绒毛的生长。

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果蝇吡咯啉-5-羧酸还原酶的表达、纯化及理化特点

冯昌增, 谢月辉, 曹毅, 孟照辉

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 27-34.

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吡咯啉-5-羧酸还原酶(P5CRs)是普遍存在于原核和真核生物中的一种重要管家蛋白,其主要的功能是催化吡咯啉-5-羧酸(P5C)转化为脯氨酸,同时将NAD(P)H氧化为NAD(P)⁺。为揭示果蝇P5CR的聚合形式、酶学性质及晶体结构,提取了果蝇的总RNA,通过逆转录获得了cDNA,进而通过PCR获得了编码果蝇P5CR的cDNA片段;将此片段连接到pET-28a(+)载体上,在大肠杆菌(Escherichia coli)中得到了高效表达,依次经过硫酸铵分级沉淀、亲和层析及凝胶过滤层析得到了适合晶体生长的高纯度蛋白;通过EGS交联实验和凝胶过滤层析检测了P5CR在溶液中的聚合形式;应用分光光度法测定了果蝇P5CR的酶活性参数;采用悬滴气相扩散法筛选了P5CR的结晶条件并进行了优化。实验结果:(1)纯化后的蛋白样品经SDS-PAGE检测,结果显示,凝胶上已基本观察不到杂蛋白质条带,说明目的蛋白质纯度较高;(2)果蝇P5CR在溶液中的基本存在形式是十聚体,在此基础上可形成更大的聚合形式;(3)果蝇P5CR参与抗癌药物硫代脯氨酸的代谢,在该逆向反应中最适pH为高碱性,该酶在45℃的半衰期约15分钟;(4)筛选得到了果蝇P5CR的初步结晶条件(0.2mol/L Ammonium phosphate dibasic, 20%PEG3350 pH 8.0)。

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叶绿体分裂蛋白PDV1胞质侧结构域可溶性表达条件的研究及纯化

韩翠晓, 李锋, 严孝金, 冯舵, 李倩倩, 高宏波, 高伟

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 35-42.

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目的:探索叶绿体分裂蛋白PLASTID DIVISION1(PDV1)胞质侧结构域的高效可溶性表达条件,并得到高纯度目的蛋白。方法:通过改变表达载体种类、基因片段大小、诱导剂浓度、诱导温度的方法,以及运用分子伴侣的协助,实现目的蛋白高效可溶性表达。通过镍柱亲和层析和分子筛层析纯化目的蛋白。结果:(1)带His标签的目的蛋白大部分以包涵体形式存在于沉淀中;(2)截掉疏水区域并与增溶标签GST或NusA融合表达,再通过改变诱导表达条件,可以实现PDV1胞质侧结构域的可溶性表达;(3)比较目的蛋白可溶性表达量,选择高效可溶性表达体系,并在该条件下纯化得到高纯度目的蛋白。结论:PDV1胞质侧结构域的高效可溶性表达及纯化,为进一步研究该蛋白的结构及其在叶绿体分裂过程中的作用奠定了一定基础。

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沙蜇(Stomolophus meleagris)刺丝囊毒素生物活性的初步分析

李荣锋, 于华华, 邢荣娥, 刘松, 李鹏程

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 43-47.

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从沙蜇触手提取刺丝囊细胞毒素,并对该毒素进行溶血活性、致死活性、SOD活性和抗肿瘤活性的研究。结果显示,沙蜇毒素具有明显的溶血活性,其半溶血率(HU₅₀)约为10.5 μg/ml;该毒素还对草鱼显示出较强的致死活性,半致死量(LD₅₀)为50 μg毒素/g鱼;同时该毒素具有明显的SOD活性和抗肿瘤活性,当毒素浓度为18 μg/ml时其总SOD活性为161 U/mg,而毒素浓度为1 mg/ml时,该毒素对肝癌细胞Bel-7402表现出显著的抑制效果,其抑制率达到54.9%。因此,有必要对沙蜇毒素内的生物活性组分进行深入研究,为沙蜇毒素的开发利用提供依据。

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不同缺氮营养水平对金色奥杜藻生长及光合生理的影响

王璐瑶, 桑敏, 李爱芬, 张成武

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 48-56.

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采用了Φ6 cm柱状光生物反应器,在不同氮素营养条件(17.6 mmol/L N、8.8 mmol/L N、5.87 mmol/L N、0 mmol/L N)下通气培养硅藻金色奥杜藻,分析探讨藻细胞的光合生理及生长状况与氮素营养水平的关系。结果表明,不同氮素实验组藻细胞达到最大生长的时间明显差异,与对照组(17.6 mmol/L)相比,氮限制(5.87 mmol/L N、8.8 mmol/L N)在培养的前期对金色奥杜藻的生长具有促进作用,氮饥饿(0 mmol/L)显著抑制藻细胞生长(P<0.05)。氮限制实验组藻细胞总碳水化合物的含量显著增加(P<0.05),而总蛋白含量明显下降(P<0.05)。藻细胞叶绿素a、c及总类胡萝卜素含量与培养液的氮素营养水平呈正相关。藻细胞最大光合放氧速率P_m随氮浓度下降而降低,呼吸速率R_d呈现相反趋势,PSⅡ最大光能转化效率(Fv/Fm)、实际光能转化效率(Yield)、潜在活性(Fv/Fo)以及相对电子传递效率(ETR)均随氮素限制而显著下降(P<0.05),说明藻细胞的表观光合生理状况与氮素营养水平直接相关。

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新型小片段基因表达载体构建方法

金磊, 赵文秀, 马岚

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 57-63.

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介绍一种新型快速构建小片段基因表达载体的方法。该方法省去了目的基因酶切和酶切后纯化步骤,并省去了载体酶切后胶回收纯化步骤,具有简单快速,节省试剂费用,连接效率高等特点。应用该方法已经完成了4个小片段基因(67bp)表达载体的构建。

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一种蛋白质B细胞表位展示系统的构建及验证

刘英富, 霍景瑞, 范国才, 孙志贤, 王清明

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 64-68.

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目的:建立一种能够有效展示蛋白质B细胞表位的载体系统,以用于表位特异性抗体的制备和表位疫苗的设计。方法:选用抗体的可变区作为蛋白质B细胞表位展示的骨架蛋白,B细胞表位的展示部位为CDR3区。全基因合成骨架蛋白基因,通过重叠PCR将B细胞表位编码序列插入到骨架蛋白基因中,原核表达目的蛋白,利用Sephacryl S-100层析柱进行蛋白纯化,用纯化的蛋白按常规方法免疫小鼠,采用ELISA法检测免疫血清的滴度及特异性,通过Western blot和间接免疫荧光技术进一步验证免疫血清对目的蛋白的识别。结果:成功构建了3种表位展示蛋白,均表现出了很好的抗原性,表位展示蛋白免疫血清具有较好的特异性,能够特异识别所展示的B细胞表位。结论:抗体可变区作为骨架蛋白能够很好地展示B细胞表位,免疫小鼠后获得的免疫血清表现出了较好的特异性。

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无饲养层和动物源蛋白的β-地中海贫血诱导多能干细胞系的建立

范勇, 骆玉梅, 陈欣杰, 孙筱放

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 69-73.

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β-地中海贫血患者因无合适的造血干细胞供体来源从而不得不靠输血维持生命。诱导多能干细胞(iPS)技术为获得患者自身遗传背景的干细胞进行临床治疗开拓了新途径。目前,建立iPS细胞系的过程需要使用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层和动物源的蛋白成分,因此建立的iPS细胞系存在病原体和动物源蛋白污染的可能性,不能应用于临床。采用目前商品化的TeSR^TM2 和 StemAdhere^TM Defined Matrix限定培养体系,利用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4个转录因子组装在同一表达载体的可切除的慢病毒感染人β-地中海贫血成纤维细胞,建立了5株无饲养层和动物源蛋白的β-地中海贫血iPS细胞系,这些iPS细胞系具有人胚胎干细胞典型的特征,表达人胚胎干细胞的多能性分子标记,如Oct4、Nanog、Tra-1-60等。在体外分化能够形成拟胚体,在体内分化能够形成含有3个胚层类型细胞的畸胎瘤。

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靶向肽位置影响融合蛋白与细胞结合活性

王海, 石必枝, 杨胜利, 李宗海, 罗晓莹

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 74-78.

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目的:探讨靶向多肽与标签蛋白(绿色荧光蛋白)的位置关系是否会影响融合蛋白与细胞之间的结合能力。方法:将获得的GE11和LyP1两种靶向多肽分别与增强型绿色荧光蛋白在不同位置融合表达,通过原核系统表达纯化,将纯化的蛋白加入血清饥饿的SMMC-7721肝癌细胞株培养液中,处理3h,通过荧光显微镜观察细胞中绿色荧光蛋白的情况检查融合多肽与细胞的结合情况。结果:绿色荧光蛋白的羧基端和GE11、LyP1多肽分别融合表达,处理细胞后,融合蛋白显示与细胞有很强的结合能力;当GE11、LyP1在绿色荧光蛋白氨基端融合时,融合蛋白几乎不能与细胞结合。在此基础上,检测了多种靶向肽对多种细胞的靶向效应。结论:不合适的融合策略会降低,甚至消除靶向多肽的结合能力;融合大分子量蛋白也会改变靶向肽的靶向效应。因此,当使用靶向多肽携带基因进行研究时,其在融合蛋白中的位置应该非常谨慎。

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一种新的Bt杀虫基因HJC原核表达蛋白活性的鉴定

苏旭, 王静, 吕莉琨, 李力, 杨东靖, 刘洪亮

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 79-83.

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HJC基因是由2个Bt基因(cry1Ab和vip3)经过人工融合而成,具有更广谱的杀虫活性,可延缓害虫产生交互抗性的时间。将已构建好的携带HJC基因的重组质粒pET28a-HJC转化到大肠杆菌BL21中诱导表达。该HJC融合蛋白主要以包涵体形式存在,变性条件下使用镍亲和层析柱对其进行纯化,并经尿素梯度透析复性后,进行免疫反应活性及美国白蛾杀虫活性测定。Western blot结果显示, 该原核表达蛋白与转HJC基因水稻中的HJC蛋白有相同的免疫反应性,对美国白蛾也有一定的杀虫活性,可以替代植物外源蛋白进行转HJC基因产品的食用安全性评价。

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九种单核细胞增生性李斯特菌检测技术效果比较及评价

刘雅莉, 刘芳, 韩舜愈, 刘箐, 孙志博, 夏俊芳, 朱小清

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 84-92.

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采用传统生物学方法、显色培养基方法、自制三抗体夹心ELISA试剂盒(TAS-ELISA)、基因组直接PCR(DNA Direct-PCR)、菌裂解直接PCR(Bacterium Direct-PCR)、免疫捕捉PCR(IC-PCR)、生物PCR(Bio-PCR)、SYBR Green染料实时荧光PCR(SYBR Green Real time-PCR)、探针实时荧光PCR(TaqMan Real time-PCR)检测纯菌液及模拟带菌食品中的单核细胞增生性李斯特菌(Listeria monocytogenes, LM)。结果表明:传统生物学培养方法出现假阳性;TAS-ELISA、DNA Direct-PCR、Bacterium Direct-PCR、IC-PCR最低检测限分别为10⁶、10²、10⁵、10⁴CFU/ml;显色培养基、SYBR Green Real time-PCR灵敏度达10²CFU/ml;Bio-PCR、TaqMan Real time-PCR检测灵敏度最高,均为10¹CFU/ml。显色培养基、TAS-ELISA操作简单,适合大量样品的初检;IC-PCR具有灵敏、特异、快速、经济的优点,特别适合大体积样品中微量病原的检测;Bio-PCR、TaqMan Real time-PCR灵敏度高、特异性好,适合阳性样品的复检以及科研使用。

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基于RNA的抗HIV-1基因治疗方法研究进展

陈丰, 杨怡姝, 曾毅

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 93-97.

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艾滋病自发现以来在全球范围内迅速蔓延,危害性极高,目前广泛采用的高效抗逆转录病毒疗法(HAART)虽能够显著提高HIV-1感染者生活质量,但存在着价格昂贵,耐药和副作用的问题经常会导致HAART治疗的中断。要获得长期持续的抗病毒治疗效果还有待于研发新的抗病毒药物和治疗方法。近年来随着分子生物技术、干细胞研究、纳米技术等相关技术的发展,关于抗HIV-1基因治疗方法的研究受到了广泛关注。主要针对基于RNA的抗HIV-1基因治疗方法,包括反义RNA、核酶、RNA诱饵以及RNA干扰技术在抗HIV-1基因治疗方面进行综述。研究表明,以RNA为基础的抗HIV-1基因治疗方法有望成为传统治疗方法的一种有效辅助手段。

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抗生素分离纯化技术研究进展

张正玉, 吴绵斌

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 98-103.

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抗生素分离纯化是抗生素产业中的技术难点和关键环节,对抗生素常用的分离纯化技术及其研究进展进行了概述,以期为抗生素分离领域提供理论指导。最后对新型分离纯化技术进行了总结和展望。

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提高哺乳动物工程细胞抗凋亡能力的基因策略

徐洪记, 张兵兵

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 104-108.

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利用哺乳动物细胞发酵生产重组蛋白药物具有细菌、酵母等表达系统所不具备的显著优势,因此在生物制药工程中的重要性越来越突出。哺乳动物细胞对工业生产环境下的各种应激环境耐受能力差,易发生细胞凋亡,严重阻碍了大规模生产,降低了生产效率。细胞凋亡是细胞必经的生物学过程,随着对凋亡机制的深入了解,发展出各种抗凋亡策略,并有望应用于重构更适合工业生产的工程细胞。常用的抗凋亡策略包括:下调凋亡蛋白、上调抗凋亡蛋白、增强生长因子自表达、减少有毒代谢产物生成等。以上策略虽然能在一定程度上提高细胞的抗凋亡能力,但距离满足生产的工程细胞重构还有距离,围绕提高工程细胞的抗凋亡能力,已发展出"凋亡工程"这一重要的技术领域。

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植物蔗糖磷酸合成酶研究进展

黄东亮, 李双喜, 廖青, 秦翠鲜, 林丽, 方锋学, 李杨瑞

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 109-119.

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蔗糖磷酸合成酶(Sucrose Phosphate Synthase, 以下简称SPS)是植物体内控制蔗糖合成的关键酶。植物体内蔗糖的积累与SPS活性正相关,SPS还参与植物的生长和产量形成,并在植物的抗逆过程中起重要作用。高等植物中至少存在A、B、C三个家族的SPS,而禾本科植物至少存在A、B、C、D_III和D_IV五个家族的SPS。不同植物体内不同家族的SPS基因的表达特性不同,它们所发挥的功能也存在差异。SPS的活性在基因表达调控和SPS蛋白磷酸化共价修饰作用两个层面受到植物生长发育、光照、代谢产物、外源物质如激素和糖类等多种因素的复杂调控。转基因研究表明,转SPS基因是提高作物产量和品质、增强作物抗逆性的有效途径,值得深入研究。全面总结了国内外在植物蔗糖磷酸合成酶方面的研究进展,并提出问题与研究展望,期望为进一步研究并利用植物SPS基因改良作物品种提供参考。

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提高木霉逆境适应性与生物防治效果的基因工程研究进展

陈勇, 朱廷恒, 汪琨, 崔志峰

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 120-124.

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木霉生存范围广、生长繁殖迅速,对其他真菌有一定的拮抗能力,并能促进植物生长、诱导植物对病原菌产生抗性,是迄今开发最成功的植物病害生防真菌。目前,运用基因工程的方法对木霉进行遗传改良,提高它对环境的适应性与对致病菌的防治能力,已经取得了很大的进展,就近年来采用基因工程的方法对木霉进行改良的研究进行综述。

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十一五国家高技术研究发展计划“重大疾病的分子分型和个体化诊疗”重大项目布局及实施情况分析

于振行, 王德平

中国生物工程杂志. 2012, 32(6): 125-130.

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简要分析了"十一五"期间国家高技术研究发展计划("863"计划)"重大疾病的分子分型和个体化诊疗"重大项目的课题设置及实施情况。分别从本项目研究方向及课题设置、课题承担单位及研究人员结构、课题完成情况及所取得的代表性研究成果等方面进行了具体分析和归纳总结,供广大科技工作者参考。

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2012年, 第32卷, 第6期　
刊出日期：2012-06-25

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