探究siRNA敲减沉默信息调节因子2(SIRT2)对1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)诱导的帕金森病细胞模型细胞损伤的影响和机制。CCK-8法检测不同浓度MPP+处理对体外培养小鼠海马神经元HT-22细胞生存率的影响。将细胞分为对照组、MPP+最佳浓度处理组(1 mmol/L MPP+处理组)、阴性转染组(对照组基础上转染SIRT2阴性序列)、SIRT2 siRNA处理组(损伤组基础上转染SIRT2 siRNA)。观察各组细胞凋亡情况,检测凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase-9)、线粒体分裂及融合相关蛋白(Drp1、Fis1、OPA1、Mfn1、Mfn2)。与对照组相比,MPP+处理组细胞抑制率均升高,细胞抑制率随MPP+浓度增加而逐渐增加(P<0.05)。与SIRT2 siRNA转染组相比,损伤组Bax、Caspase-9、Drp1、Fis1蛋白表达和细胞凋亡率升高,Bcl-2、Mfn1、Mfn2蛋白表达降低(P<0.05)。SIRT2在MPP+诱导帕金森病细胞模型中表达升高,抑制SIRT2可减轻MPP+诱导帕金森病细胞模型中细胞凋亡并促进线粒体融合,从而对神经元具有一定的保护作用。
探讨miR-5047在乳腺癌细胞中的表达及其在乳腺癌细胞增殖和迁移中的作用,并明确地西他滨在miR-5047表达调控中的作用。通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测人乳腺癌细胞系和正常乳腺上皮细胞MCF10A中miR-5047的表达水平;将miR-5047模拟物(mimic),阴性对照(NC)分别转染至MDA-MB-231和MCF7细胞,经平板克隆实验、MTT实验、划痕愈合实验检测乳腺癌细胞的增殖和迁移能力,通过qRT-PCR和Western blot检测相关基因表达及蛋白水平。使用浓度5 μmol/L和10 μmol/L的地西他滨分别处理MDA-MB-231和MCF-7细胞,经qRT-PCR检测不同浓度和处理时间条件下地西他滨对miR-5047表达的影响。同时,通过形态观察和Western blot检测地西他滨对乳腺癌细胞上皮间质转化的影响。与正常乳腺上皮细胞MCF-10A相比,miR-5047在乳腺癌细胞中表达均显著下调。miR-5047过表达可显著抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,促进上皮细胞标志物E-cadherin的表达,抑制间质细胞标志物Vimentin的表达。不同浓度地西他滨处理MDA-MB-231和MCF7细胞后,miR-5047表达均增强,且10 μmol/L作用48 h效果最显著。地西他滨可诱导MDA-MB-231细胞向上皮样转变。miR-5047在乳腺癌细胞系中表达显著下调,过表达miR-5047可抑制乳腺癌细胞的增殖和迁移,地西他滨可促进乳腺癌细胞中miR-5047的表达,并诱导细胞向上皮样转变。
目的:纤维素酶水解天然纤维素产生易被微生物利用的葡萄糖是进行生物炼制的关键。丝状真菌分泌的纤维素酶大多数是经过糖基化修饰的,研究丝状真菌纤维二糖水解酶(Cel7A)的催化功能域N-糖基化修饰对其分泌及酶活的影响,有助于优化纤维素酶的表达。方法:利用定点突变将草酸青霉和深绿木霉Cel7A催化功能域的N-糖基化位点去除,构建突变体PoCel7A*和TaCel7A*。以草酸青霉为宿主构建分泌表达PoCel7A*、TaCel7A和TaCel7A*的重组菌,检测N-糖基化去除对Cel7A分泌和酶活力的影响。结果:PoCel7A催化功能域的N-糖基化去除对其蛋白分泌和酶活力无影响。TaCel7A催化功能域的N-糖基化去除不影响其蛋白分泌;但突变体的pNPCase、FPase和Avicelase酶活力分别下降了21.2%,15.2%和17.6%。去除Cel7A催化功能域N-糖基化,加强了细胞内UPR响应。外源蛋白TaCel7A和TaCel7A*的表达也加强了胞内UPR响应。结论:不仅可以为丝状真菌Cel7A的酶工程改造提供理性设计思路,而且为进一步了解糖基化在纤维素酶降解纤维素过程中的作用及机理奠定一定基础。
目的:建立并评价基于板式化学发光免疫分析(CLIA)平台的血栓调节蛋白(TM)定量检测方法。方法:以链霉亲和素包被微孔板,加入待检血浆,偶联生物素和辣根过氧化物酶的配对抗体组成分析体系,采用双抗体夹心模式,建立TM抗原定量检测方法,并对其进行条件优化和性能评价。结果:生物素化抗体和酶标抗体的工作浓度分别为0.5 μg/mL和0.75 μg/mL,加样后的孵育时间选为15 min,最低检测限为0.2 TU/mL,该检测方法的检测范围为1~200 TU/mL,批间和批内精密度(CV)均小于8%,37 ℃ 10天稳定性良好,207份临床血浆测值与希森美康测值相关性较高(R2>0.96)。结论:建立了TM板式化学发光定量检测方法,且各项性能指标良好,可满足临床检测的需要。
目的:微生物体内异戊二烯类化合物的前体物异戊烯焦磷酸酯的天然合成路径受到严格的代谢调控,因此限制了异戊二烯类化合物的高效生物合成,而新型异戊二烯醇利用途径独立于生物体内源性代谢路径,通过在微生物中引入IUP能够进行异戊烯焦磷酸酯的大量合成,从而促进异戊二烯类化合物的大量合成。方法:在油脂酵母解脂耶氏酵母中引入IUP,强化异戊烯焦磷酸酯生物合成,促进β-胡萝卜素的高效积累。结果:通过生物信息学的方法预测IUP中两个关键蛋白酿酒酵母来源的胆碱激酶ScCK和拟南芥来源的异戊烯磷酸激酶AtIPK,均为酸性亲水性蛋白,无跨膜区和信号肽,二者都具有疏松不稳定的结构特征,显著富集于磷酸类物质的合成通路中。在解脂耶氏酵母中利用同源重组技术引入外源β-胡萝卜素合成关键基因carRP和carB,强化甲羟戊酸途径的关键基因thmgR和ggs1,使工程菌株中积累2.68 mg/L β-胡萝卜素。通过Cre-loxP系统回收基因组上的ura标签,再将IUP进一步整合到工程菌株染色体上。当培养基中含有20 mM异戊二烯醇作为底物、碳氮比为4/3且发酵96 h后,重组解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的产量提高到410.2 mg/L,较原始工程菌的产量提高了近200倍。结论:IUP能够促进解脂耶氏酵母中β-胡萝卜素的高效积累,为利用IUP开展β-胡萝卜素和其他异戊二烯类化合物的高效生物合成提供新思路。
早诊断、早发现、早治疗是提升肿瘤患者生存率的主要手段。临床常用的免疫学检测方法如酶联免疫吸附法、化学发光法等,其检测灵敏度多限制在10-14~10-12 mol/L,无法满足早期诊断的需求。单分子免疫检测法,可将待检测分子限制在极小空间范围内(nL以下),对检测信号进行绝对计数,从而实现痕量(可达10-18 mol/L)标志物的检测。这一超高灵敏度技术实现的关键在于将检测范围限制在极小体积内。经过数十年发展,不论是物理隔离还是利用纳米孔,抑或通过改进显微镜性能,均可在极小体积内(10-21 L)对信号进行检测。目前基于微阵列的SimoA检测系统已成为单分子免疫检测的金标准,Quanterix公司基于此开发的HD-1分析仪已进入市场应用。基于微液滴的单分子免疫检测技术主要限于实验室,但具有床旁检测的优势。重点介绍了基于物理隔离形式如微阵列和微液滴的单分子免疫检测进展,为进一步开发超高灵敏度检测方法并促进未来临床应用提供理论基础。
酿酒酵母已被广泛用作生产精细化学品的典型细胞工厂。但在生产过程中,各种环境胁迫以及异常的细胞代谢严重制约了生产成本降低和收益提高。解决此类瓶颈问题的一种有效方法是利用转录因子工程,通过重塑关键基因的转录水平来提高菌株的耐受性和生产效率。从运用转录因子工程提高耐受性、产量和基于人工转录因子设计在优化代谢通量、定量分析中的应用两方面综述转录因子工程的价值,讨论转录因子工程的开发以及应用于生产大宗化学品方面的挑战和解决方案。
tRNA作为生命中心法则中翻译过程的重要参与分子,其种类、丰度都会对蛋白质的正常合成产生巨大影响。近年来通过对微生物tRNA的结构功能以及合成修饰过程的解析获得诸多启发,开展密码子扩展的研究,实现将非天然氨基酸引入特定位置从而获得新功能蛋白。同时,通过化学合成微生物基因组开展的密码子重编码工作将释放更多的密码子与tRNA用于更加广泛的密码子扩展研究。对微生物tRNA与密码子系统在合成生物学中的最新应用研究进展进行了综述,并讨论其未来的发展趋势。
卤化物是通过卤化酶催化卤族元素在有机化合物上特定位置发生取代形成的一类化合物,具有独特的生理生化作用。黄素依赖型卤化酶具有良好的区域选择性,虽然有相似的黄素分子的结合位点,但在底物结合方面略有不同,对其结构和合成途径及结合蛋白质工程的随机诱变和定向改造的研究在工业应用中至关重要。讨论了具有高区域选择性的黄素依赖型卤化酶的结构特点及工程改造,以及经过工程改造后黄素依赖型卤化酶在工业生产中的应用。
生物活性物质在食品、饵料、化妆品、保健品和医药等行业具有广阔的应用前景,其研究早已受到广泛关注。鉴于海洋硅藻具有生长速度快、生物活性物质含量高、易于规模培养、便于提取等诸多优势,为理想的生物活性物质生产者。尽管国内外已进行了大量利用海洋硅藻生产生物活性物质的研究,但是受限于培养工艺老旧、生产成本过高等缺陷,商业化利用海洋硅藻开发生物活性物质依然停滞不前。阐述海洋硅藻五种常见生物活性物质的应用价值,进一步探讨海洋硅藻高产生物活性物质的策略,就如何低成本、高效开发利用硅藻源生物活性物质提出建议,为海洋硅藻商业化开发利用提供参考。
特殊酵母作为区别于传统酵母之外的一类生物资源,具有广泛的工业应用前景。基于incoPat数据库收录的专利数据,以特殊酵母工业应用领域的专利为研究对象,从专利分析的角度,揭示了全球特殊酵母工业应用领域技术创新的发展态势、技术分布、主要申请机构、研究热点以及各类特殊酵母的应用优势等。结果表明:全球特殊酵母工业应用领域的专利公开数量在2001~2020年期间整体呈不断增长的趋势,并在2019年达到峰值;专利保护区域主要为美、中、韩、日、欧等国家或地区,其中国内外申请机构的研发侧重点各有不同,以帝斯曼、纳幕尔杜邦、诺维信等为代表的国外工业生物技术公司注重特殊酵母基础技术的知识产权保护,以江南大学为代表的国内科研院校比较注重毕赤酵母应用技术的开发。重点分析了特殊酵母工业应用领域近年来各类特殊酵母在不同技术分支和创新程度上的差异,旨在为我国特殊酵母工业应用领域科研决策和科研工作提供参考。
生物技术产业是各大经济体在21世纪优先发展的战略性产业,逐步成为世界经济的主导产业。英国生物技术产业规模在欧洲排名第一,创新创业文化浓厚。通过孵化器运营案例详细阐述英国生物技术产业发展的生态系统构建。针对我国生物技术产业创新环境提出相应建议,以期对我国生物医药产业的创新创业发展提供借鉴。
