抗体药物以其独特的作用机制和靶向性强、特异性好等优点,在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、感染类疾病的诊断和治疗中发挥着越来越重要的作用,成为国际创新药物研发的热点。新冠肺炎(COVID-19)疫情发生以来,国内外多家研究机构和企业正在加快推进新冠病毒(SARS-CoV-2)抗体药物的开发。在此情势下,认真分析抗体药物现状和趋势,梳理国内外新冠病毒抗体药物研究进展,明确我国当前抗体药物创新的机遇、挑战和建议,对加快我国药物自主创新研发具有重要意义。
目的:探讨S100A6经由巨噬细胞介导的促血管生成作用及机制。方法:(1)用重组蛋白 GST-hS100A6处理巨噬细胞后:①收集上清制备条件培养基(简称A6-Mφ-CM),并用之重悬人脐静脉内皮细胞(HUVEC),用体外血管形成试验检测各处理因素对血管形成的影响;②分别用实时荧光定量PCR和Western blot检测巨噬细胞的M2型标志物CD163及促血管形成因子CCL2、IL-6、VEGFA的mRNA和蛋白质水平,以及JAK2和STAT3的蛋白质及其磷酸化水平;③用Transwell迁移试验检测巨噬细胞迁移能力的变化。(2)使用JAK2抑制剂(XL019)预处理巨噬细胞后再加GST-hS100A6处理,检测S100A6促巨噬细胞迁移作用的变化。以重组蛋白GST为实验对照。 结果:(1)A6-Mφ-CM组的血管分支数和血管分支长度既明显高于GST-Mφ-CM组(P值均小于0.05),也明显高于GST-hS100A6直接处理的HUVEC组(P<0.001,P<0.01),提示S100A6处理后的巨噬细胞具有促进血管形成的作用;(2)GST-hS100A6处理后的巨噬细胞中,CD163、CCL2、IL-6、VEGFA的mRNA和蛋白质水平明显高于GST组(P值均小于0.05),提示S100A6诱导巨噬细胞向促血管表型(pro-angiogenic phenotype)转化;(3)GST-hS100A6处理后,巨噬细胞的迁移数是GST组的1.4倍(P<0.01),提示S100A6具有招募巨噬细胞的作用;(4)GST-hS100A6处理组巨噬细胞的JAK2和STAT3的蛋白质及其磷酸化水平都明显高于GST组(P值均小于0.05),而JAK2抑制剂XL019可部分抑制S100A6促进巨噬细胞迁移的作用(P<0.01),提示S100A6促进巨噬细胞迁移作用机制涉及JAK2/STAT3信号通路的激活。 结论:微环境中的S100A6可通过招募巨噬细胞并进一步诱导其向促血管表型转化,进而促进新生血管形成;其招募巨噬细胞的机制涉及JAK2/STAT3信号通路的激活。
目的:利用酿酒酵母表面展示技术筛选幽门螺杆菌候选疫苗,并分析其免疫原性。方法:以幽门螺杆菌的空泡型细胞毒素A(vacA)基因作为研究对象,构建重组S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA,通过Western blot、免疫荧光标记和流式细胞仪对S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA进行体外表达分析。以PBS和S.cerevisiae EBY100/pYD1为对照组,S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA为实验组,口服免疫SPF级BALB/c小鼠。通过ELISA分析检测口服免疫后小鼠抗VacA特异性IgG及分泌型IgA效价。结果:VacA抗原蛋白被成功地展示在S.cerevisiae EBY100表面。小鼠经口服免疫S.cerevisiae EBY100/pYD1-VacA后可诱导产生较高的VacA特异性抗体。结论:表面展示型酿酒酵母可以作为幽门螺杆菌候选疫苗的递送载体,与此同时,这也为开发其他细菌或病毒疫苗提供新思路。
Tau是一种微管相关蛋白,其生理功能是与微管蛋白结合促进其聚合形成微管并维持微管的稳定。由于Tau蛋白异常聚集沉淀而导致的疾病被称为Tau蛋白病,其中阿尔茨海默病是最常见的一种类型。全序列Tau含有441个氨基酸残基,其中306~378肽段(Tau306-378)为驱动其聚集的核心区域。Tau306-378包含R3和R4微管结合序列以及从R4序列C端向后延伸的10个氨基酸残基。首先利用pET22b载体在大肠杆菌中表达获得了Tau306-378,然后用镍亲和层析进行纯化,终产量约为10.35mg/L。利用SDS-PAGE、Western blot和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱依次对Tau306-378进行了鉴定。其中SDS-PAGE和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱的研究结果表明,表达的Tau306-378主要以单体形式存在,但同时含有部分二聚体。最后,硫黄素T荧光染色实验显示该重组蛋白具有良好的聚集特性,可用于体外Tau蛋白的聚集特性、毒性及相关抑制剂开发的研究。
麦芽糖和葡萄糖对粪产碱杆菌发酵合成凝胶多糖有着显著的影响,为了详细分析两种底物对凝胶多糖合成的影响机制,利用恒化培养实验及稳态碳平衡代谢分析,研究发现在稀释速率为0.1h-1时,利用麦芽糖和葡萄糖为碳源底物的条件下粪产碱杆菌的微观代谢途径通量有较大的差异。以麦芽糖为底物时凝胶多糖的摩尔得率为53.8%,比葡萄糖为碳源时的摩尔得率(36.9%)高出了45.8%以上。同时以麦芽糖为碳源时HMP途径的绝对代谢通量比葡萄糖时的通量提升了40%以上。这条途径通量的增加,提升了NADPH还原力供给速率,促进了依赖于还原力NADPH的凝胶多糖合成途径通量,提升了碳源底物向产物的摩尔转化速率。而且代谢流分析结果显示ED途径通量和能量提供也是影响粪产碱杆菌凝胶多糖合成效率的关键因素。麦芽糖作为碳源底物过程中维持的较低的残留葡萄糖浓度解除了高葡萄糖浓度条件下对凝胶多糖合成的抑制,能够实现更高通量的ATP能量提供效率,更加促进了凝胶多糖合成通量。
目的:探索针对易发生聚集的重组HBcAg病毒样颗粒(VLP)的有效纯化方案。方法:培养的大肠杆菌经IPTG诱导重组HBcAg蛋白的表达,菌体超声破碎后的离心沉淀用含有不同浓度尿素的PBS缓冲液重悬溶解,经密度梯度离心并结合电镜观察对VLPs行为进行分析鉴定。以Sepharose 4 FF凝胶过滤层析在选定的尿素条件下纯化沉淀溶解液,纯化获得的目的蛋白进一步在含30%山梨醇的PBS中脱盐去除尿素。整个过程以SDS-PAGE及电镜进行各步骤样品中目的蛋白的分析。结果:含有1mol/L尿素的PBS缓冲溶液重悬超声沉淀,可有效溶解聚集的VLPs,在蔗糖密度梯度离心中显示典型HBcAg VLPs的行为,且电镜观察颗粒形态结构完整。经1mol/L尿素下凝胶过滤,VLPs进一步获得纯化。在脱尿素过程中流动相采用含30%山梨醇的PBS,有效避免了VLPs在尿素去除后重新聚集。结论:尿素与山梨醇的联合应用,为具有聚集现象的VLPs纯化制备提供了一种有效解决方案。
目的:构建一株表达TNF-α Fab'抗体的大肠杆菌工程菌,并设计一种高效实用的策略以促进大肠杆菌周质空间的可溶性Fab'抗体表达。方法:首先,通过更换不同表达载体,改变轻链和重链顺序,更换信号肽,共表达分子伴侣(Skp)、二硫键合成酶(Dsbc)、肽基辅氨酰顺反异构酶(PPIB)、二硫键异构酶(hPDI)、核酸酶(Nuclease),以评估对Fab'抗体表达量的改善。其次,纯化表达的Fab'抗体。通过周质提取、Q阴离子交换柱净化、苯基柱捕获、Protein L柱亲和三步纯化方案得到高纯度的Fab'抗体。最终将纯化后的Fab'抗体进行亲和力测定。结果:提高正确组装的Fab'抗体表达量的策略有——将目的蛋白构建至pET-30a载体;重链在前、轻链在后;轻、重链采用相异的信号肽;共表达hPDI。周质提取液中的Fab'抗体浓度达到588.0mg/L提取液,纯化后产量可达28.2mg/L发酵液,总回收率为32.0%,纯度为90.9%。Fab'抗体亲和力为(5.8±3.0)×10-9mol/L,体外细胞学活性IC50为(5.2±2.4)×10-11mol/L。结论:通过大肠杆菌工程菌分子构建方式的优化,得到了一株高效表达可溶性Fab'抗体的工程菌株,为可溶性小分子抗体的规模化生产奠定了研究基础。
游离酶经过固定化后,稳定性和环境耐受性得到提高,在食品、医药、化工、环境和皮革等领域可以很好的提高酶的利用率并降低生产成本,具有极大的应用潜力。新型交联剂在固定化酶工艺的应用极大推进了固定化酶研究的深入。借助新型交联剂聚乙二醇二缩水甘油醚(PEGDGE),利用氨基载体LX-1000HA固定化海洋假丝酵母脂肪酶,结合单因素和正交试验优化得到交联及固定化条件为:交联温度30℃,交联2h,交联剂浓度0.75%,pH7.0,加酶量800U,载体量0.5g,固定化2h,固定化温度45℃。根据上述最佳固定化工艺,制备得到固定化酶LX-1000HA-PEGDGE-CRL在最适条件下测得酶活达到160.81U/g,约为此前制备的固定化酶LX-1000HA-GA-CRL(由LX-1000HA和戊二醛交联脂肪酶得到)和LX-1000EA-PEGDGE-CRL(由短链氨基载体LX-1000EA和PEGDGE交联脂肪酶得到)酶活的2倍,发现固定化酶LX-1000HA-PEGDGE-CRL的最适反应温度相比于游离酶提高15℃;在70℃的环境中3h后酶活仍存留70%;循环使用6次后残留65%左右的酶活;酸碱耐受性和储存稳定性也表现良好,4℃保存30天后剩余约70%的初始酶活。同时,将制备的固定化酶LX-1000HA-PEGDGE-CRL与游离酶、固定化酶LX-1000HA-GA-CRL、固定化酶LX-1000EA-PEGDGE-CRL进行了比较,发现固定化酶LX-1000HA-PEGDGE-CRL在温度耐受性和重复使用性等方面具有更好的使用效果。
天然水凝胶是指原材料来自于天然生物材料的水凝胶。由于这种天然的聚合物含有构成生物体的天然成分,与天然组织具有生物学和化学相似性,而受到特别关注。天然水凝胶由于其与细胞外基质高度的相似性被认为是骨组织工程中优良的仿生基质材料。而针对天然水凝胶机械性能差、成骨诱导性能弱等缺陷,通常需要对天然水凝胶进行改性、引入其他材料或生物活性因子,以此来获得更适用于骨组织工程支架材料。对近年来基于天然水凝胶的生物材料在骨组织工程的应用,与其不同的应用形式(可注射水凝胶、多孔水凝胶支架、3D生物打印水凝胶支架等)进行了概述,以期对这类基于天然水凝胶的生物材料在未来骨组织工程中的应用提供参考。
噬菌体应用领域十分广泛,因此在制备噬菌体过程中,需采用不同的技术或几种技术相结合的方法来获得具有不同纯度的噬菌体制剂。常用的技术主要包括沉淀、过滤和离心。近年来,色谱技术、场流分流技术和电泳技术等的应用,为制备噬菌体制剂提供了新的方向。
鱼类已经被用作黑色素瘤研究的重要模型。近年来,因其病理特征均一的黑色素瘤模型及易于繁殖等优点,鱼类黑色素研究取得了较大进展。黑色素细胞(melanocytes)是鱼类最重要的色素细胞,其合成的真黑色素(eumelanin)对鱼类体表着色及生命活动具有重要影响,合成过程主要涉及酪氨酸基因家族的催化作用;褐黑色素(pheomelanin)以往被认为在鱼类中不能合成,而近年来的研究结果为此提供了新的见解。随着鱼类黑色素合成的广泛研究,其合成调控机制也相应被深入探索。在黑色素合成调控网路中,小眼畸形相关转录因子(microphthalmia-associated transcription factor,Mitf)是各信号通路的关键调控因子,受到上游α-Msh/Mc1r、Wnt/β-Catenin及Scf/c-Kit等信号途径,介导下游酪氨酸基因家族,调控黑色素的合成。对鱼类黑色素的合成及相关信号通路进行综述,以期为鱼类黑色素合成的基础理论及水产养殖提供参考,同时也为了解人类黑色素合成的起源和调控,以及攻克黑色素瘤提供帮助。
丝状真菌以其优秀的表达分泌能力和良好的环境适应能力,使得其在蛋白质表达领域应用越来越广泛。近几十年来,通过诱变、培养优化及遗传改造等手段,使得包含曲霉属、木霉属、青霉属等在内的丝状真菌被开发成高效表达宿主。为促进丝状真菌蛋白表达系统的开发,结合作者的研究工作,对工业上丝状真菌表达宿主、蛋白质表达元件及其改造策略进行综述,并探讨了当前丝状真菌表达系统开发过程中的不足之处,为新型丝状真菌表达系统的研究提供参考和启示。
表面活性素(surfactin)是一种环脂肽型生物表面活性剂,具有卓越的表/界面活性,能够显著降低水的表面张力,表现出良好的抗真菌、抗病毒、抗肿瘤、杀虫和抗支原体等生物活性,在医药、农业、食品、日化、石油开采等领域具有很大的应用潜力,但高昂的成本和缺乏竞争力的应用领域使其难以真正地实际应用起来。多年来,大量的研究工作在于促进其工业化应用。综述了surfactin的结构、特性及发酵生产,同时系统的比较和总结了surfactin在抑菌方面的应用研究。
作为现代生物产业的核心,生物制造涵盖了从生物资源到生物技术,再到生物产业的价值链,集中体现了现代生物技术在医药、农业、能源、材料、化工、环保等多个工业领域的应用,对经济社会可持续发展进程有重要推动作用。当前,生物制造已成为世界主要发达经济体科技产业布局的重点领域之一,吸引了大量公共投资和社会资本,形成了价值数十亿美元级别的投资风口。调研统计2018~2019年全球150家生物制造相关企业201次融资事件,梳理生物制造产业的国内外发展环境和融资现状,为我国生物制造产业发展提出建议,以期引导领域科技成果转移转化、技术资本对接和行业繁荣发展,为我国经济社会可持续发展做出贡献。
