噬菌体分离纯化技术研究进展<sup>*</sup>

秦旭颖; 杨洪江

doi:10.13523/j.cb.1912002

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中国生物工程杂志 ›› 2020, Vol. 40 ›› Issue (5) : 78-83. DOI: 10.13523/j.cb.1912002

综述

噬菌体分离纯化技术研究进展^*

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Research Progress on Techniques for Separation, Purification of Bacteriophages

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摘要

噬菌体应用领域十分广泛,因此在制备噬菌体过程中,需采用不同的技术或几种技术相结合的方法来获得具有不同纯度的噬菌体制剂。常用的技术主要包括沉淀、过滤和离心。近年来,色谱技术、场流分流技术和电泳技术等的应用,为制备噬菌体制剂提供了新的方向。

Abstract

Bacteriophage is widely used in many fields, so in the process of preparing phage, the different techniques or several techniques to obtain phage preparations with different purity to be used. The techniques commonly used to separate and purify phage are precipitation, filtration and centrifugation. In recent years, the application of chromatographic, field-flow fractionation techniques and electrophoresis techniques provides a new direction for obtaining phage preparations.

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秦旭颖, 杨洪江. 噬菌体分离纯化技术研究进展^*[J]. 中国生物工程杂志, 2020, 40(5): 78-83 https://doi.org/10.13523/j.cb.1912002

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中图分类号： Q815

1 概述

噬菌体是地球上数量最多的生物,其总数量约为10^{31 [1,2]}。噬菌体对全球各种生态系统的微生物菌群结构具有巨大的影响,在推动地球生物化学元素循环过程中发挥重要作用^[3,4,5]。在医疗领域,噬菌体在抗感染治疗中的作用非常显著。噬菌体的研究历史较早,1896年英国科学家Ernest Hankin在印度恒河水中发现了一种神秘物质,能够杀死导致霍乱的弧细菌,此种物质可以通过非常精细的瓷器过滤,且这种抗菌活性可以通过煮沸被破坏^[6]。1917年d'Hérelle^[7]正式提出了“噬菌体”的概念,并在1919年开始利用噬菌体制剂治疗细菌性痢疾,首次证实了噬菌体的治疗价值,开启了噬菌体在治疗细菌感染性疾病方面的应用^[8]。随着20世纪青霉素的发现,抗生素以其广谱的杀菌活性及稳定的治疗效果在世界范围内得到了广泛地应用,而噬菌体治疗只在部分东欧国家,如俄罗斯、格鲁吉亚和波兰等,保留了一定水平的应用研究。近年来,随着细菌针对抗生素的耐药性日益严重,亟须发现能够替代抗生素的新型杀菌物质,噬菌体又重新成为研究的热点。噬菌体能够特异性地杀死宿主细菌,预防和控制各种细菌性感染。另外,噬菌体还是维持人体健康的重要参与者。研究发现,健康人类肠道中存在着核心噬菌体组,在维持肠道菌群结构和多样性方面发挥重要作用^[9,10,11]。粪菌移植被认为是治疗肠道微生态紊乱有效手段之一,而噬菌体在粪菌移植治疗肠道疾病中也发挥着重要作用^[12,13,14]。

噬菌体颗粒是由蛋白质衣壳和其包裹的核酸组成的,蛋白质外壳通常是由多种蛋白质分子聚合而成,分子量巨大。依据这一性质,纯化噬菌体颗粒主要采用沉淀法和离心法,但这些方法存在明显的缺陷,如纯化的数量有限和产品的纯度不足,不能形成规模化生产造成经济效益不佳等。如果噬菌体制剂用于临床治疗则需要更高的监管要求。例如,医药产品中静脉注射产品中最高允许的内毒素含量不得超过5.0内毒素单位(EU)/(kg·h),鞘内用注射剂不得超过0.2EU/(kg·h)^[15]。此外,在分离纯化过程中可能用到的有机溶剂氯仿、氯化铯等化合物,在医疗产品中也需要严格控制^[16]。这些因素的存在,制约了噬菌体制剂在不同领域的应用,需要研发新的技术来纯化噬菌体颗粒。本文就目前已有的噬菌体分离纯化技术进行概述。

2 噬菌体分离纯化技术

2.1 沉淀、过滤和密度梯度超速离心法

沉淀、过滤和密度梯度超速离心法是噬菌体分离纯化中最常用的方法^[17,18]。沉淀法是使用不同的化学试剂,如硫酸铵和聚乙二醇(PEG)^[19,20],添加到噬菌体悬液中达到饱和状态沉淀噬菌体颗粒,该法易受温度、pH、蛋白质浓度和沉淀剂等因素的影响,不适用于规模化噬菌体纯化,一般需要结合其他技术共同使用。

过滤法主要基于膜分离技术,通过使用不同孔径的滤膜,实现产品浓缩、缓冲液交换和无菌过滤等过程。(1)微滤法:操作中使用孔径为0.02~10μm的滤膜,悬液中的细菌细胞和细胞碎片被滤膜截留,噬菌体颗粒透过滤膜被回收。(2)超滤法:是一种基于目标化合物和杂质之间分子量差异的过滤方法,使小分子溶质和溶剂穿过一定孔径的特制薄膜,而使大分子溶质不能透过,留在膜的一边,从而使大分子物质得到部分纯化。(3)纳滤法:是一种纳米级的新型分离膜,是介于超滤膜和反渗透膜之间的一种滤膜,能够选择性地纯化或者去除不同的物质。各种过滤技术在纯化、浓缩噬菌体方面具有重要作用,且易于扩大规模^[21]。但是,滤膜孔径存在均一性等问题,在纯化噬菌体过程中可能导致噬菌体的损失,或影响噬菌体制剂的纯度。

离心技术是分离异质混合物成分或纯化物质的主要技术。在超速离心中根据混合物颗粒的大小、沉降系数、浮力密度等来实现噬菌体颗粒的纯化。此外,还可以利用不同密度梯度超速离心技术,如氯化铯^[22]、蔗糖^[23]、碘克沙醇^[24,25]等。密度梯度离心技术可以进一步有效地纯化和浓缩噬菌体颗粒,但纯化设备一般比较昂贵,且需要较长的处理时间才能达到所需的样品纯度^[22,26]。某些密度梯度方法不适用于一些病毒的纯化。例如,蔗糖的高黏度和高渗透性会对不稳定的病毒造成一定的损害^[26],在梯度超速离心过程中造成病毒颗粒的广泛聚集等^[24]。

2.2 色谱分离

色谱技术是一种常用的生物工程下游分离技术,有助于获得高纯度、高回收率的产品,且易于扩展,可为大规模生产提供良好的平台^[27]。色谱纯化噬菌体颗粒使用的色谱系统需要考虑噬菌体颗粒的大小。在选择树脂时,由于表面吸附和孔隙的排斥效应等因素,需要克服低结合效率和低容量等问题^[28]。以前,基于颗粒填充柱通过使用多孔颗粒灌注来获得较大的表面积。颗粒虽然可以以低流速获得足够的扩散时间和扩散出填充柱的时间,但是相对较小的孔径仍然阻止病毒颗粒进入和阻止病毒颗粒到达填充物所提供的有效表面积^[29,30],从而导致填充物对颗粒的动态黏合能力降低^[31]。PL-SAX 4000A是珠状树脂中具有最宽可用孔的树脂,孔直径为400nm,有研究利用这种珠状树脂来纯化直径为80nm的5型腺病毒(Ad5)。虽然填充料孔径相对较大,但不允许Ad5的大量渗透,从而限制了宽孔树脂内表面的使用^[32]。

开发不同的膜和基于整体介质的填料,可作为多孔填料的替代品。整体介质的填料是由单块高度多孔材料组成的连续介质,其特征是通道之间相互连接,可以利用相对简单的化学方法制备成各种形状和尺寸,并可以通过衍生化方法,合成传统色谱的配体^[33]。由于这些材料的大孔结构,克服了传统多孔填料遇到的扩散问题,在高流速情况下也不会损失任何动态结合量和分辨率,且分离时间较短,使色谱分离的生产效率提高^[34]。吸附膜类似整体填料色谱柱,具有良好的流体力学,通过色谱柱对流体系中目标分子与膜上的活性位点相互作用,确保大分子以高流速低扩散方式通过,使分离过程保持高效率。

触角载体可增加噬菌体结合能力,触角载体具有空间上可触及的配体,由于存在将配体与树脂表面分开的惰性且灵活的间隔臂,可用于捕获噬菌体,大颗粒物质可以获得在空间上无法接近的结合位点^[35]。

排阻色谱法(size exclusion chromatography, SEC)是液相色谱的一种,是一种根据样品的分子尺寸进行分离的色谱技术。该方法已用于噬菌体λ的制备与纯化^[36]。另外,利用填料Sephacryl S-500,能够有效地去除PEG纯化的丝状噬菌体制剂中的污染物^[37]。

色谱法已广泛应用于生物科学各领域。大多数相互作用模式的色谱法均适用于噬菌体的分离与纯化,如离子交换色谱、固定化金属亲和色谱、疏水相互作用色谱等。

2.3 非对称流场流分馏

非对称流场流分馏技术从场流分馏技术发展而来,是一种与色谱相关的技术,通过通道流和交叉流产生的作用力将样品成分在细窄的通道中进行分离。通道流具有抛物线轮廓,它将样品成分输送到检测器和馏分收集器。样品组分的分离是通过施加外场,即横流来实现的(图1)。横流垂直于通道流,它将样品组分推向积累壁,作用力通过分子从积累壁的扩散而抵消。结果,每个样品成分在距累积壁一定距离处达到平衡,该距离则取决于它们的扩散系数和流体动力学尺寸^[38,39]。在正常分离模式下,适用于分离直径小于0.5μm的样本组分^[40],具有较低扩散系数的较大样本组分比具有较高扩散系数的较小颗粒组分更易接近积累壁,所以较小的颗粒在经过通道中心区域时先被洗脱下来。最佳情况下,只要样本组分之间具有足够不同的扩散系数,非对称流场流分馏技术就可以在一次实验中分离较大尺寸范围的样品组分^[41]。

图1 非对称流场流分馏技术原理示意图

Fig.1 Principle of asymmetrical flow field-flow fractionation

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非对称流场流分馏技术可将噬菌体与其他成分分离,为噬菌体生产提供实时监控。通过对培养上清液进行分级分离,非对称流场流分馏技术已成功用于监测噬菌体PRD1和古生菌噬菌体His1在感染过程中的释放及纯化^[42,43,44]。与MALS检测器偶合的非对称流场流分馏技术已广泛用于分析噬菌体制剂中存在的片段、寡聚物和聚集物的大小及分布,以及用于分析源于不同宿主或者纯化条件的噬菌体颗粒质量^[45,46],也可用于噬菌体的定性和定量研究^[47]。

此外,非对称流场流分馏技术可用于分析噬菌体颗粒的组成及各组成成分的功能。噬菌体通过封闭的蛋白质衣壳来保护其基因组,噬菌体的受控解离过程可以提供有关噬菌体组成的相关重要信息,对获得大量优质的噬菌体颗粒及对噬菌体进行详细的生化和生物物理研究具有重要价值。近期一项研究将非对称流场流分馏技术用于噬菌体φ6的受控解离、分离纯化,发现非对称流场流分馏技术是一种温和的方法用于具有生物活性物质的分离纯化过程^[48]。非对称流场流分馏技术也用于方法开发中,通过将常规透析方法更改为简单的基于稀释的方法促进病毒颗粒的自组装,并使由纯化的衣壳异构体组装的病毒制剂的回收率和均质性提高了约20%^[49]。在用于治疗应用病毒颗粒生产中,通过使用非对称流场流分馏技术可防止病毒颗粒的重组,可有效分离病毒颗粒的组件成分^[50]。非对称场流分馏技术可分离大小从nm到μm的物质,具有快速、温和、可以兼容任何溶剂和缓冲液的特点,再结合自动进样和分级分离的可能性,非对称流场流分馏技术可成为噬菌体研究中广泛使用的工具。

2.4 介电电泳技术

微流体技术改变了许多生物分子的分析方式,为获得高分辨率和高灵敏度的纯化方式打开了大门^[51]。电泳技术是电场驱动的技术,由于其巨大的灵活性和应用简单性,是微流体技术的主要支撑技术之一。其中,介电电泳被证明是分离、富集各种生物颗粒的强有力技术平台^[52,53]。其原理为,在微通道中添加金属介质来产生非均匀电场和电场梯度,在非均匀电场的影响下使生物颗粒进行迁移,与电泳技术不同介电电泳可以同时处理直流电和交流电,具有更大的灵活性,利用粒子极化效应而非电荷效应来达到颗粒分离效果^[54]。其中基于绝缘体介电电泳技术是一种利用绝缘结构产生不均匀电场的技术,绝缘结构通常嵌入微通道中(图2),在流体中挤压电场,产生高的电场强度梯度,产生真正的三维介电电泳效应^[55]。绝缘体介电电泳不需要复杂的金属电极,电场强度值和电场强度梯度不会随着微通道的深度而变化,因电解有气泡析出的现象也不易出现。其中利用介电电泳技术分离噬菌体颗粒时,由于噬菌体颗粒尺寸较小,对其分离纯化时需要施加更大的电势以产生足够的介电电泳力^[56]。

图2 基于绝缘体的介电电泳通道示意图

Fig.2 Schematic representation of insulator-based dielectrophoresis channel

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介电电泳技术已被证明具有精确分离大小从10μm(哺乳动物细胞)到1μm的单个细胞(细菌)的能力^[57],但在分离纯化噬菌体颗粒方面仍然存在困难,由于噬菌体颗粒尺寸较小。有研究探索基于由垂直排列的碳纳米纤维制成的纳米电极阵列的简单介电电泳设备从高速流体中捕获噬菌体T4r和噬菌体T1。当噬菌体颗粒以低浓度(8.9×10⁴pfu/ml)流过设备时,可以捕获60%的噬菌体颗粒,当在高浓度(约1×10⁹pfu/ml)情况下,研究发现介电电泳捕获颗粒根据流速不同表现出两种可能的机制,在低流速(<0.73mm/s)下噬菌体颗粒得到分离,而在高流速下(≥0.73mm/s),噬菌体颗粒在流动方向上形成利希滕贝格图形^[58]。有研究利用介电电泳技术从全血中分离检测T7噬菌体,成功地从20μl含有5×10⁸virus/ml的血液中分离出约5×10⁵ virus/ml^[59]。另外,绝缘介电电泳技术也应用于对尺寸较大的沙门氏菌噬菌体SPN3US、假单胞菌噬菌体φKZ和201φ2-1的富集分离,结果表明绝缘介电电泳技术有助于分析、纯化或富集已知噬菌体和未知噬菌体^[60]。

3 小结

噬菌体在农业、畜牧水产养殖、食品防腐、医疗以及环境等领域,具有日益突出的应用价值,而如何获得单一、纯度高、符合应用标准和符合监管条例的噬菌体制剂是目前需要解决的关键问题。目前各种噬菌体分离纯化方法有了长足进步,但是仍存在一些难题需要解决。例如,色谱法难以完全去除噬菌体制剂中的脂多糖,从而在治疗应用中受到限制。分离纯化噬菌体过程中,多种技术结合应用,或改进不同的分离纯化方法以及发现新的分离纯化方法是今后研究的重点。本实验室先后分离鉴定了多株铜绿假单胞菌噬菌体、气单胞菌噬菌体、鲍曼不动杆菌噬菌体等不同种类的噬菌体,主要进行噬菌体与宿主菌相互作用机制的研究。在噬菌体分离纯化方面,我们分别应用PEG沉淀法、Sepharose 4B凝胶过滤层析法和DEAE-52离子交换层析法分析了对鲍曼不动杆菌噬菌体的分离纯化效果和去除内毒素的效果。结果发现PEG沉淀和Sepharose 4B凝胶过滤层析结合使用分离纯化噬菌体效果更好,噬菌体纯度由原来的6.1×10¹⁰pfu/mg提高到7.3×10¹¹pfu/mg,纯度提高了12倍。Sepharose 4B凝胶过滤层析法纯化噬菌体效果明显,且去除内毒素的效果也好于DEAE-52离子交换层析法^[61]。随着噬菌体技术的不断创新与进步,噬菌体制剂的纯度将不断提高,能够满足各种应用的需求,特别是能够满足临床治疗对噬菌体制剂的纯度要求,从而实现噬菌体替代抗生素这一宏伟设想。

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* 国家自然科学基金(31970150)

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关键词
Key words
引用本文
1 概述
2 噬菌体分离纯化技术
2.1 沉淀、过滤和密度梯度超速离心法
2.2 色谱分离
2.3 非对称流场流分馏
图1 非对称流场流分馏技术原理示意图
2.4 介电电泳技术
图2 基于绝缘体的介电电泳通道示意图
3 小结
参考文献
基金
版权

收稿日期	修回日期	出版日期
2019-12-01	2020-02-10	2020-05-20
发布日期
2020-06-02

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