探究了JNK通路对M2巨噬细胞极化及M2介导的促肿瘤效应的影响。构建单核细胞THP1来源M2 巨噬细胞模型(THP1-M2),将细胞分为3组: 用PMA 诱导的未活化巨噬细胞组(M0),用PMA、IL-4处理及阴性干扰(DMSO)的M2型巨噬细胞组(M2),用特异性抑制剂阻断JNK通路的M2 型巨噬细胞组(M2-JNKI)。实时荧光定量PCR检测M2 表型marker基因的表达;免疫蛋白印迹法检测M2 表型marker蛋白水平;细胞划痕试验检测巨噬细胞迁移能力;流式细胞数检测786O及OSRC2凋亡。结果与THP1-M2组相比,阻断JNK通路的M2组M2表型marker表达明显下降,同时其细胞迁移能力也呈下降趋势。且阻断JNK通路后,M2巨噬细胞抑制肾癌细胞凋亡的能力减弱。结果表明,抑制JNK通路后,M2巨噬细胞极化状态受损,其促肿瘤效应可转变为抗肿瘤效应。
植物半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物防御生物与非生物胁迫过程中发挥着重要的作用。拟南芥中的半胱氨酸蛋白酶抑制剂AtCYSa基因的表达能够受到多种胁迫的诱导,且在拟南芥中过量表达AtCYSa基因可以增强转基因拟南芥抵御盐、干旱和氧化等非生物胁迫的能力。为了进一步探究AtCYSa基因的功能以及在烟草中的应用,构建了植物表达载体pCAMBIA 1302-AtCYSa。通过PCR以及RT-PCR验证共获得4株阳性转基因烟草,选择其中3株转基因烟草进行盐胁迫处理和抗虫活性实验。在盐胁迫处理中,100mmol/L NaCl和200mmol/L NaCl处理组的丙二醛含量显著低于野生型对照组。伊文思蓝染色和细胞相对活性结果表明,转基因烟草的细胞活性比野生型烟草明显偏高。这说明在盐胁迫处理下,AtCYSa基因的表达能够起到保护转基因烟草的作用。抗虫活性研究发现,实验组的幼虫总重均呈明显的下降趋势,且幼虫死亡率显著高于对照组。这些结果表明,AtCYSa基因在烟草中的过量表达能够增强转基因烟草的耐盐以及抗虫的能力。
研究白花地胆草(Elephantopus mollis H.B.K.)的乙醇提取物EM-12抗肿瘤作用分子机制。
MTT检测EM-12对卵巢癌细胞活性影响;克隆形成抑制实验检测EM-12对卵巢癌细胞增殖能力的影响; GO功能分析(gene ontology analysis)分析EM-12对卵巢癌2774-C10细胞的影响; PI单染检测细胞周期; Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡; Western blotting检测细胞凋亡、周期相关蛋白。
MTT实验结果表明,EM-12可以显著抑制卵巢癌细胞的活性;RNA-Seq及GO功能分析表明EM-12诱导2774-C10发生G1/S期阻滞;克隆形成抑制实验结果表明,EM-12可以显著抑制卵巢癌细胞的增殖;流式细胞术结果表明,随着药物浓度的增加,凋亡率逐渐增加,并且G1期细胞比例逐渐增加,S期细胞比例减少,发生G1/S期阻滞。Western blotting结果表明,随着药物浓度的增加cyclin E2、cyclin D1、CDK2、CDK6蛋白水平下降,并伴随caspase-8、caspase-3活化及多聚ADP核糖聚合酶PARP酶切失活。
EM-12诱导卵巢癌细胞发生G1/S期阻滞,且通过死亡受体通路诱导细胞凋亡。
NAC转录因子家族是植物特有的、最大的转录因子家族之一,参与植物生物胁迫和非生物胁迫应答、激素信号转导、植物次生生长、细胞分裂和植物衰老等多种过程,在植物生长发育过程中起着重要的作用。以中间锦鸡儿CiNAC1基因的过表达拟南芥纯合体株系为材料,以野生型为对照,对CiNAC1基因功能进行分析。结果发现,乙烯处理后,CiNAC1基因过表达株系与野生型拟南芥相比,叶片衰老提前、叶绿素含量降低、离子渗透率升高。实时荧光定量PCR检测发现,乙烯处理后CiNAC1基因过表达株系中与叶绿素降解相关的基因SGR1、SGR2、PPH,以及与衰老相关的基因SAG13、SAG29、ORE1、SINA1、VNI2和乙烯信号途径中的重要转录因子EIN3的表达量均明显高于野生型拟南芥。表明CiNAC1基因在乙烯诱导的叶片衰老过程中发挥重要作用。
对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)是对虾养殖业中危害最严重的病毒之一,至今尚无规模应用的有效药物防治方法。但近年来在WSSV免疫防治上进展较大。Vp28蛋白是WSSV囊膜上的主要结构蛋白,2004年以来其编码基因已在8种宿主中表达成功,在实验室试验中对WSSV的防治疗效显著,但目前尚未见到其在对虾产业中的应用。
利用对虾的天然饵料聚球藻表达Vp28重组蛋白,这种药食同源可简化操作,降低成本,有助其在生产中应用。
用荧光定量PCR方法检测转vp28基因聚球藻7942中vp28基因的表达效率。通过氧电极的方法测得转vp28基因型聚球藻在不同温度、光照、pH和盐度下的光合活性变化,找到它的最适生长条件。
检测了vp28基因表达效率为9.52%,是在鱼腥藻7120表达效率的3倍。最适采收时间是对数生长后期(15d左右)。转基因型蓝藻7 942的最适生长条件是:温度为40℃,盐度为0~0.1mol/L NaCl,pH为7.5,光强为450μmol/(m 2·s)。
确定了vp28基因在聚球藻中的表达效率及该转基因藻的最适培养条件,这些研究结果为用转vp28基因型聚球藻7942规模制备药食同源的口服剂提供了依据。
纤维二糖可有效诱导丝状真菌产纤维素酶,前期研究表明匍枝根霉Rhizopus stolonifer TP-02具有纤维二糖合成酶(CBS),可以尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)为糖基供体合成纤维二糖,从而开启纤维素酶的自诱导合成途径。为研究R. stolonifer中纤维二糖的胞内合成途径,通过重叠PCR在GDP-葡糖焦磷酸化酶基因ggp中引入硫胺吡啶抗性基因ptrA,分别转化原菌TP-02和△ugp突变株,构建△ggp和△ugp/△ggp突变株。利用液质联用(LC-MS)检测突变株的胞内糖组分,发现ggp的缺失对胞内纤维二糖合成的影响较弱,但同时缺失ugp则将直接导致二糖合成受阻。RT-qPCR结果显示△ggp突变株中纤维素酶基因转录水平较原株TP-02下调20%左右,而△ugp/△ggp突变株中被测基因的转录水平则出现了高达80%左右的下调。同时对突变株纤维素酶表达水平进行研究,发现△ugp/△ggp突变株中几乎检测不到纤维素酶活力。结果显示,UDPG为R. stolonifer胞内合成纤维二糖的主要糖基供体,而GDPG可能是UDPG的替代物,在UDPG不足时维持胞内二糖合成。此外,利用生物信息学方法对CBS结构功能深入分析,经丙氨酸扫描确定其合成纤维二糖的关键作用残基为Asp210和Asp300,为后续进一步研究及理性改造提供方向和理论依据。
根据信号肽N端电荷数,选择Sec及Tat两种途径的信号肽构建枯草芽孢杆菌穿梭质粒,首次实现Bacillus cereus源亮氨酸脱氢酶基因在Bacillus subtilis中的分泌表达。Tat途径信号肽PhoD促进蛋白质分泌的效果最好,胞外酶活力达20.25U/ml,为不添加信号肽的2.2倍,信号肽N端较多的电荷数,可能有利于多聚体蛋白的分泌。对表达产物进行纯化和酶学性质测定。结果表明,纯酶比酶活为13U/mg;L-Leucine为底物时酶的Km为6.17mmol/L,Vmax为14.49μmol/(L·min);底物特异性研究发现,酶与天然底物L-Leucine的亲和性最好,对一些脂肪族氨基酸也有活性,对芳香族氨基酸L-Phenylalanine无活性;酶的最适pH为10.5~12.0,pH稳定范围为5.0~11.0;最适反应温度为55℃;圆二色谱变温扫描酶二级结构变化,α螺旋含量随温度升高逐渐降低;差示扫描微量热技术(DSC)测定酶的解折叠温度(Tm值)为64.13℃,表明该酶具有较好耐热性。
制备鼠抗树鼩CD3ε单克隆抗体,并对其生物学特性进行鉴定。
以GST-CD3ε蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术融合免疫后的BALB/c小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤SP2/0细胞,通过间接酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)方法检测,筛选出多株能分泌抗树鼩CD3ε的杂交瘤细胞株,经过3次亚克隆筛选后,制备小鼠腹水单克隆抗体,并纯化得到鼠抗树鼩CD3ε单克隆抗体,通过腹水单克隆抗体效价测定、单克隆抗体亲和力测定、单克隆抗体抗原表位分析、 Western blot和流式细胞荧光分选技术(fluorescence activated cell sorting, FACS)分析其生物学特性。
筛选到5株能稳定分泌抗树鼩CD3ε单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为78I、87I、92D1、75II和35C8,腹水单克隆抗体效价分别为1:10 6、1:10 6、1:10 4、1:10 6、1:10 3,亲和力解离常数(Kd)分别为1.8×10 -5、2.9×10 -5、4.9×10 -5、7.3×10 -5、3.6×10 -5。5株单克隆抗体抗原表位分析显示78I、87I和75II识别同一抗原表位,而92D1和35C8识别另一抗原表位。经Western blot检测,HRP标记后的92D1能识别GST-CD3ε蛋白和树鼩外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell, PBMC),并对大鼠、小鼠和猴的PBMC有抗体交叉反应。经FACS检测,PE-Cy5.5标记后的92D1能特异性识别树鼩PBMC。
成功制备出鼠抗树鼩CD3ε的单克隆抗体,为进一步应用于树鼩免疫检测奠定基础。
脂酰-酰基载体蛋白(fatty acyl-acyl carrier protein, acyl-ACP)是多种生物合成途径中的酰基供体。因供给限制,体外研究常用类似物acyl-CoA替代,而CoA部分和ACP有较大差异,限制了相关酶对底物识别的认识。因此稳定获得大量acyl-ACP是体外研究相关酶的催化机制及其代谢途径的关键。研究以holo-ACP和C4~C18链长脂肪酸为底物,在哈氏弧菌acyl-ACP合成酶(Vibrio harveyi acyl-ACP synthetase, VhAasS)催化下合成不同碳链长度的acyl-ACP;通过高效液相色谱(HPLC)方法,确定不同碳链长度acyl-ACP的合成产率。结果表明:碳链为C4~C14的acyl-ACP产率均高于90.0%,16:0-ACP产率为85.9%,18:1-ACP产率仅为25.7%。通过加入Li +优化反应体系,16:0-ACP、18:1-ACP的产率达90.0%。进一步优化扩大反应体系可稳定获得20mg以上acyl-ACP;最后,把合成的acyl-ACP应用到甘油-3-磷酸酰基转移酶催化的反应体系中。不同链长acyl-ACP的规模化合成研究,为体外研究相关酶的催化机制提供重要基础。
制备负载NGF的可注射壳聚糖透明质酸复合水凝胶,探讨其理化性能以及生物相容性。
首先京尼平交联制备壳聚糖透明质酸复合水凝胶材料,采用倒置法检测凝胶时间;扫描电镜观察材料形态结构;NGF释放实验、体外溶胀以及降解实验等检测凝胶材料的物理化学性能;通过MTT实验、NGF活性检测、材料与细胞共培养检测凝胶材料生物学性能。
在37℃条件下,可注射凝胶材料凝胶时间在37min左右,凝胶材料为多孔网络状结构,凝胶材料8周最多能够降解76%,缓释21天的NGF具有生物活性,凝胶材料能促进RSC96细胞的粘附、增殖、迁移以及细胞活性物质的释放。
京尼平交联的壳聚糖透明质酸水凝胶具有良好的生物相容性,能作为NGF的载体材料,具有成为神经导管内填充材料的潜能。
在免疫分析和生物芯片中,抗原-抗体特异性结合被广泛应用,其中抗体的固定化是研发高效诊断和分离工具的关键环节。生物分子工程、材料化学与交联剂化学的进步极大地促进了抗体固定化技术的发展。 抗体可以通过物理吸附、共价偶联和亲和相互作用固定到不同类型的固相表面。 抗体固定化的目标是以一种正确的空间取向将抗体固定到固相表面,在完全保留抗体构象和活性的同时最大化抗原的结合能力,这对固相化抗体的分析性能至关重要。 对固定抗体到固相载体表面的各种最新方法进行了阐述,包括物理吸附法,通过羧基、氨基、巯基、糖基和点击化学的共价结合法以及基于生物亲和作用的固定法,并对固定化抗体的表征方法进行了归纳,最后对抗体固定化方法的发展方向进行了展望。
随着分子生物学研究的进展,机体各种生物学特性的影响都在分子水平上寻求到原因。转录因子作为调节基因转录的重要蛋白质,一直在被人们进行种类发掘及功能鉴定。KLF8(Krüppel-like factor 8)是属于KLFs(Krüppel-like factors)家族中的一种转录因子,对细胞侵袭和上皮-间质转化、细胞致癌性转化和肿瘤、细胞周期循环、脂肪细胞分化等方面有着深远影响。由于其在生物学功能上的多方面影响,使其逐渐成为科研人员探究的热点。对该转录因子的结构和作用已经有了深入的了解。现就KLF8基因与蛋白质的分子结构和生物学特性研究进展进行综述,可为该基因作为遗传标记奠定基础并以期为相关研究如癌症调控、肥胖治疗及基础研究等提供参考。
从产品开发角度分析寡核苷酸类药物的发展现状和未来趋势。
检索科睿唯安(Clarivate analytics)的Cortellis数据库的数据,利用定量分析法和对比分析法对检索结果进行分析。
目前已有7种寡核苷酸类药物上市,4种寡核苷酸类药物处于预注册及16种处于临床III期,未来市场上的寡核苷酸类药物将呈现快速增长趋势。此外,寡核苷酸类药物的商业交易也越来越多,目前共发生包括药物开发及商业化许可、专利资产出售以及早期药物研发合作等10余起交易,其中药物开发及商业化许可是最主要的交易模式。
虽然寡核苷酸类药物市场尚处于起步阶段,但随着技术的不断发展改进,相信未来有更多的寡核苷酸类药物上市,为癌症及其他疾病的治疗提供新的契机。
基于嵌合抗原受体-T细胞(CAR-T)的免疫疗法已经成为了一种有效治疗恶性肿瘤的全新疗法。通过检索并分析CAR-T领域的专利申请文件,从中获得了国内外专利申请发展趋势、主要专利申请人、专利地区分布情况等信息,并重点综述了获美国FDA批准的首个CAR-T 疗法的所属公司——诺华公司CAR-T技术的研发路线,以及国内主要研究机构的专利申请情况。
