探讨ACTL6A在人类白血病NB4细胞分化中的作用及其相关机制。我们用ATRA人为诱导NB4细胞分化,Western blotting检测ACTL6A和CD11b的表达水平变化;敲低ACTL6A,通过瑞氏染色观察NB4细胞的形态学改变,Western blotting检测ACTL6A和CD11b的表达水平变化及其相关蛋白的表达水平;敲低同时用ATRA处理NB4细胞,用流式细胞术检测分化标志物CD11b的阳性率;免疫荧光检测ACTL6A在NB4细胞中的空间定位;结果显示NB4经敲低ACTL6A后,CD11b的蛋白水平表达升高;瑞氏染色观察到分化改变;免疫荧光检测到ACTL6A主要分布于细胞核;Western blotting 检测到Notch1,Hes1,Sox2蛋白表达水平明显下调。研究表明,敲低ACTL6A可以促进人类白血病NB4细胞分化;其机制涉及Notch1信号通路的抑制。
目的下调脂肪特异性蛋白27(Fsp27)基因表达联合杨梅素干预,观察对3T3-L1细胞中脂质代谢的影响,并探究脂滴发生、发展变化的调控机制。方法 常规培养3T3-L1前脂肪细胞,采用“鸡尾酒”法诱导其分化为成熟脂肪细胞。脂质体法转染sh-Fsp27干扰载体,以杨梅素浓度为100μmol/L的完全培养基干预成熟脂肪细胞72h。油红O染色,观察脂滴形态及大小的变化;酶法测定细胞内甘油及甘油三酯的含量,观察细胞脂质代谢的变化。Western blot检测Fsp27、激素敏感性甘油三酯脂肪酶(HSL)、甘油三酯脂肪酶(ATGL)以及丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路蛋白的表达。结果 1. 3T3-L1细胞诱导分化后,形态由纤维样变成圆形,并伴随有细胞体积的增大。2. 与对照组相比,杨梅素组和转染组细胞中甘油三酯含量下降,甘油含量升高(P＜0.05)。与其他三组相比,联合干预组细胞中甘油三酯含量减少,甘油含量增加(P＜0.05)。3. 与对照组相比,其余三组细胞内Fsp27蛋白的表达量均降低,ATGL和PPARγ的表达量升高(P＜0.05)。另外,联合干预组和杨梅素组细胞内HSL的表达量和p-p38MAPK/p38MAPK的比值均大于sh-Fsp27组和对照组(P＜0.05)。结论 1. Fsp27基因沉默与杨梅素联合干预可以更大程度地促进脂肪分解代谢。2.杨梅素可通过激活MAPK信号通路,上调HSL和ATGL的蛋白表达来发挥其促脂解的作用;sh-Fsp27干扰载体通过调节PPARγ和Fsp27蛋白的表达,增加ATGL含量来加速脂肪分解。
目的构建携带金黄色葡萄球菌类肠毒素K(staphylococcal enterotoxin-like K, SElK)和绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)融合基因的工程菌,并对SElK-GFP融合蛋白进行初步生物学活性分析。方法 利用PCR和Overlap PCR克隆获得SElK-GFP融合基因,并插入pET28a表达载体中,通过菌落PCR,质粒双酶切及测序验证后,将构建成功的pET28a-SElK-GFP质粒转化到E.coli BL21菌株中进行诱导表达,通过 Ni +亲和磁珠试剂盒纯化获得SElK-GFP融合蛋白;并利用MTT法检测SElK-GFP刺激小鼠脾淋巴细胞增殖;ELISA法检测SElK-GFP尾静脉注射后小鼠血清中细胞因子IL-2和IFN-γ的分泌水平。 结果 成功构建能够表达SElK-GFP融合蛋白的工程菌,纯化获得高纯度的SElK-GFP融合蛋白可观测到明显的绿色荧光,融合蛋白生物学活性分析表明,SElK-GFP能够呈剂量依赖性地显著刺激小鼠脾淋巴细胞增殖;同时ELISA检测发现SElK-GFP可显著增加小鼠血清中细胞因子IL-2及IFN-γ的分泌水平。结论 成功克隆、表达及纯化获得高纯度的SElK-GFP融合蛋白,其不仅保留了SElK的超抗原活性,同时兼具GFP绿色荧光的可视性,为深入研究SElK生物学活性提供有利工具。
为了促进亮氨酸脱氢酶在Bacillus subtilis中高效表达,采取在质粒pMA5自带的启动子PHpaII之后分别添加诱导型和组成型启动子,考察双启动子对酶表达的影响。选取2种诱导型启动子(Pgrac、Pgl-M1)和4种组成型启动子(P43、Plaps、PHpaII、PamyQ)进行构建表达,其中组成型启动子PamyQ与PHpaII构成的双启动子效果最好,有效地将胞外活性提高到31.24U/ml,是单启动子PHpaII的3.4倍。在以上最优双启动子的基础上分别融合Sec途径和Tat途径的4种信号肽,但信号肽与双启动子共同作用并没有获得更高的酶活性。选用酶活最高的双启动子突变菌株Bacillus subtilis 168/pW6(PHpaII-PamyQ)进行7.5L发酵罐补料发酵产酶研究,LeuDH酶活达到217.96U/ml,是摇瓶水平的6.97倍,对工业上产亮氨酸脱氢酶有一定参考价值。
在原核生物中,钠/氢逆向转运蛋白具有催化细胞内的Na +、Li +或K +等碱基阳离子的排出,换取外部质子,以降低有毒碱性金属阳离子的细胞质浓度和维持细胞内pH稳态起到了至关重要的作用。为了进一步挖掘中度嗜盐菌Halobacillus Y5中具有盐碱耐受性的钠/氢逆向转运蛋白基因并对其功能进行鉴定,我们首先提取该菌的基因组DNA,然后采用Sau3AI随机酶切及功能互补的方法获得了一个新型的钠/氢逆向转运蛋白基因Ha_ydjM。生物信息学分析表明,该基因属于YdjM超家族成员,是一个未知功能的膜蛋白,系统发育分析证实,其与来自Halobacillus sp. Marseille -P 3789的YdjM(蛋白登录号WP_101846656.1)家族成员聚在一起但形成独立分支。研究发现,该基因能够恢复大肠杆菌突变株KNabc对0.2mol/L NaCl和5mmol/L LiCl 的耐受特性,并且耐受碱性pH 8.0。功能分析显示,该蛋白呈现pH依赖的钠/氢逆向转运蛋白活性,转运动力学分析表明,Na +、K +、Li +在KNabc中Km值分别是0.43 ± 0.05mmol/L、0.49 ± 0.06mmol/L、0.64 ± 0.06mmol/L,即对Na +、K +、Li +的亲和力分别是Na + > K + > Li +。综上所述,Ha_ydjM代表了一种新型的钠/氢逆向转运蛋白,这丰富了YdjM超家族成员,并为其他未知膜蛋白功能分析提供依据。
黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1,AFB1)是一种毒性强、污染广的真菌毒素,建立高效、准确、快速的AFB1检测方法具有重要意义。利用噬菌粒-辅助噬菌体展示系统构建单链抗体(single chain variable fragment,scFv)文库,应用“淘选-洗脱”的策略,是筛选高亲和配体的常用方法之一。同时结合同源建模和分子对接等计算机辅助手段,分析得到抗体与抗原的结合位点与关键氨基酸,为在基因水平改造抗体提供基础。从AFB1-BSA免疫小鼠的脾细胞内扩增重链可变区和轻链可变区,将组合成的scFv片段插入噬菌粒pCANTAB5e中,构建了噬菌体展示单链抗体文库,以不同浓度的AFB1-OVA作为抗原,从文库中筛选到一株亲和力较好的抗AFB1单链抗体scFv,其亲和常数为8×10 5L/mol;根据同源建模和分子对接发现,与抗原AFB1结合时,scFv中Tyr33、Ser52和Tyr102起关键作用,分别以π-π共轭键、氢键和范德华力与AFB1结合。
目的构建噬菌体天然纳米抗体展示库,以期用于筛选不同抗原分子的纳米抗体筛选平台,并用艰难梭菌谷氨酸脱氢酶(GDH)抗原筛选靶向GDH的纳米抗体,对所构建的噬菌体天然纳米抗体展示库进行验证。方法 采用Oligo DT提取双峰骆驼脾脏总RNA进行反转录,通过巢氏PCR获取全套重链可变区基因,将其构建到噬菌粒pCANTAB5E载体,经多次电转化至E.coil TG1构建初级噬菌体抗体库,经辅助噬菌体拯救后构成噬菌体展示库,并对噬菌体展示库的库容及多样性进行分析和鉴定。同时以GDH为靶向抗原对文库进行淘筛,计算淘筛回收率,并对第三轮淘筛后平板的单克隆进行ELISA鉴定。结果 构建的天然噬菌体纳米抗体库的插入率为95%左右,随机挑取的9个克隆氨基酸同源性为66.17%,经MEGA分析后具有较好的多样性,同时经辅助噬菌体拯救后,得到的噬菌体展示库滴度为4×10 12CFU/ml。在三轮淘筛过程中,回收率逐步升高,噬菌体得到了有效的富集,同时对阳性克隆进行测序及分析,最终得到2条抗GDH纳米抗体序列。 结论 成功构建了双峰驼源天然噬菌体纳米抗体展示文库且多样性良好,为后续筛选其他的靶向抗原奠定了基础,同时筛选获得两条抗GDH纳米抗体序列,为制备艰难梭菌谷氨酸脱氢酶诊断抗体提供技术支撑。
多叶斑叶兰,是兰科斑叶兰属濒危野生植物、国家二级保护植物,具有极高的观赏和药用价值。多叶斑叶兰由于分布种群小,传播扩散能力弱,自然繁殖受到极大限制。以野生多叶斑叶兰茎段作为外植体,建立高效直接的植株再生体系。结合高通量转录组测序技术与生物信息学分析技术,深入挖掘参与多叶斑叶兰器官发育过程的功能基因。结果表明, Morel+2.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/LKT+1.0 mg/LNAA+1g/L蛋白胨+25g/L 蔗糖+7.0 g/L Agar+1.0 g/L活性炭+30 g/L 香蕉+50 g/L土豆为最佳的芽诱导培养基;Morel+3 mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+0.5 mg/LKT+0.01 mg/L TDZ+2g/L蛋白胨+25g/L 蔗糖+7.0 g/L Agar+1.0 g/L活性炭30g/L 香蕉+50g/L 土豆为最佳芽增殖培养基;1/2 Morel+1.0 mg/L IBA+0.1 mg/L NAA+1 g/L+花宝2 号+25g/L 蔗糖+7.0g/L Agar +1.0 g/L活性炭+1g·L-1蛋白胨为最佳的生根培养基。转录组测序分析组装获得170688个Unigene,平均长度为584 bp, N50为833 bp。17352个Unigene比对注释到NR、Swiss-Prot、KOG、GO、KEGG数据库。野生苗与组培苗差异表达Unigene GO与KEGG功能富集分析显示, Unigene主要参与调控植物激素信号转导、植物形态发育、次生代谢过程以及能量代谢过程等生物学功能。进一步分析获得511个参与植物器官发育调控相关的转录因子。成功建立了多叶斑叶兰种质资源保存与高效离体再生体系,结合高通量转录组学技术,获得全面完整的多叶斑叶兰转录组信息特征,为后期多叶斑叶兰快速扩繁、遗传转化以及功能基因鉴定、遗传发育及其调控机制研究奠定基础。
近年来,以小分子化合物为半抗原的免疫分析技术在食品药品、环境保护等领域已有诸多应用,并取得了较为理想的检测效果。小分子化合物只能与载体偶联形成人工抗原后,方能借助T细胞表位间接诱导B细胞进行增殖与分化,进而产生特异性抗体。高效的人工抗原的合成是保证免疫分析的前提和关键,就近年来国内外有关人工抗原合成过程中所涉及的小分子半抗原的设计与合成方法、载体的选择、半抗原与载体的偶联方法、人工抗原的纯化及鉴定方法等进行综述。
形状记忆聚合物是由固定相和可逆相构成的具有在外界刺激条件下诱导形状改变特性的一类高分子智能材料。相较于传统的形状记忆合金与陶瓷,其具有特定的生物可降解性、更高的机械性能调控空间、更强的形变恢复能力及更优良的生物相容性。凭借材料特性,近阶段针对形状记忆聚合物在组织工程领域的应用研究愈发广泛,包括血管组织、骨骼肌组织、神经组织与骨组织等方面。综述近年来形状记忆聚合物在多种组织工程领域研究中的实验创新、技术突破与应用拓展,例如将其作为新型多孔血管支架、骨骼肌修复支架、神经修复导管与骨缺损填充物等。可预见随着技术和材料的不断发展,形状记忆聚合物在组织工程领域的应用将更加成熟。
细胞获取和培养的过程是组织工程构建的重要环节;3D生物打印技术可以支撑组织工程的发展。通过“声波”使微量流体在惯性力和流体粘性力相互作用下实现脉冲流动的压电式微喷技术应用于细胞打印领域属于新兴工艺,具有精度高、效率高、成本低等特征。在介绍压电式微喷技术系统和原理基础上,分析了压电驱动方式、压电参数、脉冲驱动电压波形、生物细胞油墨对细胞打印的影响;给出了压电式微喷技术在高存活率细胞获取、高效率构建细胞三维组织方面的应用研究案例;总结了其在细胞打印领域的应用现状,并指出研究方向及意义。
近些年来DNA测序技术发展迅速,已经从第一代生化测序发展到第三代单分子测序。作为第三代测序技术中的一种不同于当前流行的其他测序技术,纳米孔测序技术是基于电信号的一种物理方法测序。许多研究者通常将高通量测序技术应用于食品微生物的研究,但是将纳米孔测序技术应用于食品中微生物的检测却鲜有报道。Oxford Nanopore Technologies(牛津纳米孔科技公司)研发的DNA测序仪MinION,是世界首例用于商业测序的纳米孔测序仪,经过不断完善,近年来MinION在DNA测序中被广泛应用。MinION 测序一次需要的DNA量约1μg,其标准识别速度为一秒钟识别250个碱基,平均读长可至13kb~20kb,测序准确率可以达到98%。纳米孔测序的高识别速度和高准确率,完全满足快速检测的要求,将其应用于食品中微生物检测是完全可行的。
甾体药物是仅次于抗生素的全球第二大类药物,具有抗炎、抗过敏、调节内分泌等重要功效。对甾体母核特定位点进行有效的氧化修饰,是引入药效活性的关键。研究表明,P450酶是催化甾体特异性氧化的一类关键酶家族。目前,电子传递效率和催化特异性是限制P450酶催化功能的重要因素,会导致目标甾体产物产量低、副产物积累严重等问题。因此,将围绕提高P450酶的催化效率及特异性方面的研究工作,系统综述工程化P450催化甾体类物质的方法策略和相关研究进展,并对催化甾体化合物的P450酶的设计和优化的未来发展进行展望,为该方面工作的深入研究提供指导。
基因编辑技术掀起了全球研发热潮,尤其是CRISPR技术成为最有发展前景的基因组编辑技术,迅速实现了在畜禽育种、生物医药研发等领域的应用,相关临床试验已经开展,其发展带动了生物产业发展的新方向,孕育了巨大的社会经济价值,目前产业格局已初步形成。我国对基因编辑一直高度重视,在科研上也紧跟国际发展步伐,取得了一系列突破性成果。同时,在大动物模型构建、疾病治疗临床试验等基因编辑的应用领域,我国已经进入国际第一阵营。未来,我国仍需进一步推进技术源头创新,抢占在该领域的国际话语权;并优化政策环境,保证我国基因编辑技术下游应用的快速健康有序发展。
