“一带一路”贯穿亚欧非大陆,联结活跃的东亚经济圈和发达的欧洲经济圈,以及中间经济发展潜力巨大的广大腹地国家与地区,“一带一路”战略将对中国未来国内外的政治、经济、文化、科技发展产生重大深远影响。本报告分析了“一带一路”沿线国家的科技发展基础条件,研究了“一带一路”沿线国家在生物技术领域取得的基础研究进展和专利技术研发进展的总体情况,综述了“一带一路”沿线国家生物技术产业发展现状和国际专利布局情况,并针对中国与“一带一路”沿线国家在生物技术领域进一步深化合作互利共赢提出了发展建议。
探讨地塞米松降解代谢新基因,为构建高效、稳定的地塞米松降解基因工程菌提供思路。
根据新发现的地塞米松降解菌Burkholderia sp.CQ001(B.CQ001)全基因组测序和生物信息学分析,筛选疑似与地塞米松代谢相关的基因。提取B.CQ001总RNA逆转录为cDNA,以cDNA为模板,利用PCR技术快速克隆经实时荧光定量PCR技术(RT-qPCR)验证筛选出的新基因,测序鉴定后连接原核表达载体pET-28a-c(+),构建重组质粒pET-28a-Ivd。将pET-28a-Ivd转化感受态B.CQ001,高效液相色谱(HPLC)验证表达菌降解能力的提升。
从B.CQ001基因组中筛选出3个未知基因,分别为ORF05499、ORF05827、ORF06535,其表达产物分别为过氧化物还原酶、甾酮异构酶、异戊酰辅酶A脱氢酶;RT-qPCR分析显示,3个目的基因在地塞米松诱导后均有不同程度表达上调,基因ORF06535表达上调明显;在B.CQ001中过表达基因ORF06535,HPLC检测显示,表达菌对地塞米松磷酸钠和地塞米松的降解率可达到89.0%和80.0%,相比原菌B.CQ001有明显提升。
在B.CQ001中发现新的地塞米松降解相关基因ORF06535,并完成基因克隆和功能验证,为制备地塞米松及甾体激素污染的生物修复剂提供了新的基因信息。
基因工程是改良百合性状的重要手段,建立高效稳定的遗传转化体系是百合转基因研究的基础。以百合地下茎鳞片为外植体,筛选并优化百合的直接和间接再生体系;把含枸杞GR(Glutathione reductase)基因和筛选基因NPTII的载体,利用农杆菌转化法对鳞片和愈伤组织进行转基因操作,采用正交试验,优化转化条件以建立适合不同受体的遗传转化体系。结果表明,各阶段最优培养条件分别为:鳞片诱导和膨大MS+2mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)+0.1mg/L NAA(萘乙酸)+ 90g/L蔗糖;鳞片直接分化MS+1.0mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤)+0.2mg/L NAA+ 30g/L蔗糖,间接分化MS+2.5mg/L 2,4-D +0.4mg/L TDZ(噻重氮苯基脲)+60g/L蔗糖;百合鳞片的Kana(卡那霉素)选择压为100mg/L,愈伤组织75mg/L。遗传转化体系条件为:鳞片,农杆菌OD600=0.6,预培养3d,侵染40min,As(乙酰丁香酮)200μmol/L,阳性植株转化率为17.50%;鳞片分化愈伤组织,农杆菌OD600,预培养5d,侵染40min,As 200μmol/L,阳性植株转化率为12.60%。
基于液质联用的串联质谱技术,建立基于完整糖肽水平的抗体药糖型定性定量分析方法,并用于生物仿制药糖型研究。
基于液相色谱质谱技术,从完整糖肽水平对糖型进行定性定量分析,同时与传统超高效液相荧光检测(ultra performance liquid chromatography_fluorescence detection,UPLC-FLR)结果比较,获得最优分析策略,并用于曲妥珠单抗仿制药批次间糖型定性定量分析。
UPLC-FLR方法定量分析了贝伐单抗7种糖型;液质联用方法定量19种糖型;经亲水相互作用色谱(hydrophilic interaction liquid chromatography,HILIC)富集后,定量22种糖型。曲妥珠单抗仿制药批次间糖型定量结果显示良好的一致性。
基于液质联用的方法,具有速度快、灵敏度高、检测糖型种类多等优势,有望作为一种稳定的抗体药物糖蛋白位点特异性定量分析策略。
针对目前检测领域缺乏诺如病毒(Norovirus, NoV)核酸标准样品这一瓶颈,基于Qbeta噬菌体装甲RNA技术构建内含GII型NoV检测靶标RNA的病毒样颗粒(virus like particles, VLPs)标准参考样品。
人工合成包含Qbeta噬菌体成熟酶编码基因、衣壳蛋白编码基因、包装位点、ISO/T15216-2 2012中规定的GII型NoV检测靶标对应的cDNA序列及辅助多克隆位点的DNA片段QINVGII,将其克隆到pET-28a(+)载体中,构建重组质粒pET-QINVGII。将pET-QINVGII转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞并诱导表达。表达产物经SDS-PAGE和透射电镜分析后,利用氯化铯密度梯度离心,制备纯化VLPs,并对纯化后的VLPs开展均匀性、稳定性及定值研究。
SDS-PAGE结果证实重组大肠杆菌在14.1kDa左右有目的条带表达;透射电镜下可观察到大量结构完整、直径约为25nm的VLPs。定值结果显示,制备的VLPs样品中GII型NoV检测靶标RNA的含量为(1.06±0.06)×107 copies/μl;均匀性分析结果表明样品均匀性良好,即F=2.24<F0.05(9,20);稳定性结果表明,制备的VLPs在37℃可保存12天、室温(20~25℃)可保存24天、4℃至少可保存90天、-20℃至少可保存200天、-80℃至少可保存300天。
基于Qbeta噬菌体制备的NoV装甲RNA均匀性和稳定性良好,拷贝数高,为NoV分子检测提供了良好的标准参考样品。
埃博拉病毒被列为A类病原体,感染后可引起埃博拉出血热,具有高传染率和高致死率。研发安全有效的抗病毒疫苗迫在眉睫。目前正在研发的埃博拉病毒疫苗包括病毒载体疫苗、蛋白疫苗、DNA疫苗等,其中最有希望的是重组水疱性口炎病毒载体疫苗rVSV-ZEBOV。该疫苗在预防和治疗埃博拉出血热方面具有较高的安全性和有效性,有望在2018年上市。为了深入了解rVSV-ZEBOV疫苗,现主要从制备方法、药理学研究和作用机制等方面对该疫苗进行介绍。
抗菌肽因其具有广谱抗菌活性、不容易引起抵抗性,被认为是先天免疫系统对抗微生物感染的多功能工具。然而,天然抗菌肽存在抗菌活性低、稳定性低、溶血性高等问题,使其较难应用于临床,所以研究人员对抗菌肽进行改良设计以期获得更高抗菌活性、更低溶血活性的新型抗菌肽。另外,天然抗菌肽作为一类免疫效应因子而被发现,其表现出的抑菌、免疫调节、内毒素中和等作用,使得研究人员对抗菌肽在抗炎作用的研究表现出极大的兴趣。就抗菌肽的药物设计方法及抗炎作用机制进行综述。
垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP)是近年新发现的神经多肽,属于促胰液素/胰高血糖素/血管活性肽(VIP)家族中的新成员,广泛分布于脑和外周组织器官,尤其在内分泌胰腺、性腺、呼吸和生殖系统,在能量代谢、神经保护、免疫系统等发挥重要生理学功能。糖尿病是一种常见的主要以高血糖为特征的慢性代谢性疾病,糖尿病并发症日益严重威胁着人们的身体健康,已成为导致糖尿病患者致死、致残的主要原因。主要对PACAP治疗糖尿病及其并发症国内外研究的最新进展进行论述。
细胞代谢过程中多样的生化修饰反应能够精细调控细胞的活力与功能。其中,酶促糖基化是细胞代谢调控过程中普遍存在的一种分子修饰,对维持和调节细胞功能具有重要影响。糖基转移酶通过将糖基供体的糖基转移至相应的受体分子来实现糖基化修饰。受体分子经过糖基化修饰会改变其在细胞内的稳定性、溶解性和区域定位等特性,并在调节细胞周期、信号转导、蛋白质表达调控、应答反应和清除细胞异物等诸多生物过程中起着重要作用。简要介绍了细胞代谢过程中糖基转移酶超家族的分类、命名和催化机制。重点阐述细胞中蛋白质类生物大分子和小分子化合物的糖基化反应及其在细胞代谢过程中的功能。展望了细胞中糖基化反应及糖基转移酶在人类健康、医药产品、工业催化、食品和农业等领域的应用前景。
雄性不育技术在作物杂种优势利用和杂交种生产中发挥着重要作用。基于核质互作雄性不育的“三系法”与光温敏核不育的“两系法”已经在水稻等主要作物的杂交制种中获得了广泛应用,但是存在着资源利用效率低、育性不稳定、易受外界环境影响等诸多问题。近三十年来,利用生物技术创建不同类型的植物雄性不育系取得了一系列突破性进展。主要针对玉米、水稻、小麦三大作物的基因工程雄性不育技术的最新进展进行总结,特别详细地描述了本实验室最近研究创制的玉米多控不育技术体系,以期为相关研究和产业化应用提供技术参考。
雄性不育技术在玉米杂种优势利用和杂交种生产中发挥着重要作用,玉米花药发育和雄性不育的细胞生物学与分子遗传学研究是雄性不育技术利用的前提和基础。玉米花药发育是一个复杂的生物学过程,需要孢子体基因与配子体基因的协同表达调控。从玉米花药的形态结构、花药发育时期的划分、花药败育类型、花药发育的细胞学研究方法、花药发育的组学研究方法、花药发育分子遗传学研究方法等方面进行综述,以期为玉米核不育机制研究与雄性不育技术产业化应用提供方法学指导。
玉米细胞核雄性不育突变体是研究花粉发育和减数分裂的理想材料,也是杂种优势利用的重要种质资源。随着分子生物技术的快速发展,部分玉米细胞核雄性不育基因陆续被成功克隆,为其在工程不育化杂交种生产中的应用奠定了基础。综述了近年来对玉米细胞核雄性不育的细胞学鉴定、基因克隆和分子机制的研究进展,并对其应用途径和前景进行了分析。
玉米是杂种优势利用最成功的作物之一,采用细胞质雄性不育(CMS)进行玉米杂交种生产已成为杂种优势利用的有力工具。CMS是由于细胞质和细胞核的基因表达产物的不协调而产生的不育性,可被核基因组中的恢复基因恢复。根据育性恢复专效性,玉米CMS材料主要分为T、C和S三种类型。综述了这三种类型不育及其恢复基因的研究进展,分析了在不育化制种中的应用情况。
光温敏核雄性不育系在不同的生态环境条件下可以实现一系两用,简化制种程序,是农作物杂交种子生产的一种重要资源。简要介绍了主要作物杂交种子生产方式,综述了水稻、小麦、玉米、谷子等作物光温敏核雄性不育系的研究进展以及在两系杂交种子生产上的应用,并探讨了光温敏核雄性不育系的应用前景。
雄性不育是植物雄性细胞或生殖器官丧失生理机能的现象,该现象的利用大大提高了杂交种生产的效率。植物雄性不育包含细胞质雄性不育、不受环境影响的核雄性不育、光温敏型雄性不育及化学诱导的雄性不育。这些不育类型也已经被以三系或二系的方式应用于很多作物的杂交种生产中。综述了雄性不育各个途径的研究进展及其在作物杂种优势中的应用。
