2017年, 第37卷, 第8期　
刊出日期：2017-08-25

  

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研究报告
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  卤地菊乙醇提取物W40单体诱导GLC-82细胞凋亡的分子机制研究

  代立婷, 吴忠南, 黄翔, 杨杰, 曾慧兰, 王国才, 蒋建伟

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 1-7. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170801

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  目的：探讨卤地菊Wedelia prostrate（Hook.et Arn.） Hemsl.的乙醇提取物W40单体对非小细胞肺癌GLC-82细胞的抗肿瘤作用分子机制。方法：通过MTT和克隆形成抑制实验检测W40对非小细胞肺癌GLC-82细胞增殖的影响；通过细胞划痕实验检测W40对细胞迁移的影响；通过Annexin V-FITC/PI双染法检测W40对细胞凋亡的诱导；通过Western blotting分析细胞增殖和凋亡相关蛋白的水平。结果：MTT实验表明，W40对GLC-82细胞有较为明显的细胞毒作用；克隆形成抑制实验表明，W40可以显著抑制GLC-82细胞增殖，且抑制程度呈现浓度依赖效应；细胞划痕实验表明，W40能够在一定程度上抑制GLC-82细胞的迁移能力；Annexin V-FITC/PI双染的结果显示，随着药物浓度的增加，细胞凋亡率逐渐增加；Western blotting结果表明，随着药物浓度的增加，p-Stat3蛋白的表达水平下降，Stat3下游蛋白Bcl-2、Mcl-1的表达减少。同时，促凋亡蛋白Bax的表达增多，并伴随Caspase-9、Caspase-3活化及多聚ADP-核糖聚合酶PARP酶切失活；p-BRAF蛋白的表达水平下降，p-BRAF下游蛋白p-MEK、p-ERK表达减少。结论：W40通过抑制BRAF/MAPK/ERK及Stat3信号通路来诱导细胞凋亡。
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  3D水凝胶压应力模型建立及压应力对成骨细胞的影响

  张玲莉, 仝晓阳, 郭健民, 雷乐, 邹军

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 8-14. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170802

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  目的：通过建立3D水凝胶细胞模型，采用不同强度、频率、时间对MC3T3-E1细胞进行机械加压干预，进而探讨促进成骨细胞生长的适宜压应力方案。方法：设计不同强度、频率、时间的压应力梯度方案对成骨细胞MC3T3-E1进行干预。加压干预结束后即刻收集细胞，对样本中的ATF4、ALP、Runx2、Osteocalcin、RANKL和RANK mRNA进行定量检测。结果：经统计学分析后发现不同强度和频率对ALP（P<0.05）、Runx2（P<0.01）交互作用显著。此外，4h加压Runx2的表达量比12h加压的高（P<0.05）；4h加压RANKL的表达量比12h加压的低（P<0.05）。结论：确定了压力强度和频率后，对3D细胞水凝胶模型施加一段时间的压应力发现，以1%强度、0.5Hz频率、4h的压应力干预方案能够促进成骨细胞系的生长。
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  介导两种半纤维素酶分泌表达的信号肽比较

  杨青, 汪斌, 王亚伟, 张华山, 熊海容, 张莉

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 15-22. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170803

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  木聚糖酶和甘露聚糖酶是两种主要的半纤维素酶，广泛应用于诸多领域。选择了3种毕赤酵母内源信号肽Scw11、Dse4和Exg1，以α-factor为参照，分别在毕赤酵母X33中用于表达实验室前期获得的耐热木聚糖酶DSB和耐热甘露聚糖酶ManA，选择适合DSB和ManA表达的信号肽以提高胞外酶活水平。结果表明不同信号肽引导的两种半纤维素酶的酶活水平相差较大：对DSB（分子量为23kDa），α-factor介导的表达效率明显优于其它3种信号肽；但对ManA（分子量为30kDa），Dse4和α-factor介导的表达效率相当且明显优于Scw11和Exg1。因此在X33中表达DSB时应选用α-factor，而表达ManA时应选用Dse4或α-factor。此外胞内酶活的结果显示α-factor介导的DSB和ManA重组菌胞内滞留酶活明显高于其它信号肽，而分子量为30kDa的ManA的滞留酶活又明显高于分子量为23kDa的DSB，因此在表达ManA蛋白时，选用其它的信号肽，如Dse4，会减少外源蛋白在胞内的滞留从而在一定程度上提高外源蛋白的分泌量。因此为毕赤酵母表达系统鉴定更多可用的信号肽并筛选到针对目的蛋白的最优信号肽奠定了一定的基础。
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  分枝杆菌细胞裂解液催化甾体激素C_1,2位脱氢反应的研究

  秦梦菲, 孙鸿, 宋浩

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 23-30. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170804

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  9β，11β-环氧-17α，21-二羟基-16β-甲基孕-1，4-二烯-3，20-二酮（Ⅳ）是生产9-氟甾体激素的关键前体，以9β，11β-环氧-17α，21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3，20-二酮-21-醋酸酯（Ⅰ）为底物合成Ⅳ是工业化生产Ⅳ的重要方法。通过比较分枝杆菌全细胞转化法与细胞裂解液转化法，发现分枝杆菌全细胞只能将Ⅰ转化为9β，11β-环氧-17α，21-二羟基-16β-甲基孕-4-烯-3，20-二酮（Ⅱ），而细胞裂解液可以有效地将Ⅰ转化为Ⅳ，其反应机制为底物Ⅰ自发水解为中间体Ⅱ，Ⅱ在C_1，2位脱氢酶（KSTD）的催化作用下发生C_1，2位脱氢反应生成产物Ⅳ。为进一步提高产物Ⅳ的转化率，利用基因工程手段在分枝杆菌中分别过表达编码KSTD的关键基因：kstD、kstD3和kstD_M，提高脱氢反应效率，结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH7.0的重组菌株MS136-kstD_M细胞裂解液中反应45 h，Ⅳ的转化率为78.4%，比出发菌株提高了38.9%；并优化缓冲液pH，提高反应速率，结果表明1 g/L底物Ⅰ在pH7.5的重组菌株MS136-kstD_M细胞裂解液中反应45 h，Ⅳ的转化率为92.8%，比出发菌株提高了63.4%。

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  Arthrobacter sp.2PR降解2-羟基吡啶动力学及降解特性研究

  胡春辉, 徐青, 于浩

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 31-38. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170805

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  从辽河口石油污染土壤中筛选到一株能够以2-羟基吡啶作为唯一碳源、氮源和能源进行生长的菌株2PR，基于形态学观察、16S rRNA基因序列分析鉴定菌株2PR属于节杆菌属（Arthrobacter）。菌株2PR生长和降解2-羟基吡啶的最适条件是30℃，pH为7.0。当2-羟基吡啶初始浓度为6.0mg/ml时，120h菌株2PR对2-羟基吡啶的降解效率为94.48%，初始2-羟基吡啶浓度为8.0mg/ml时，156h的降解效率为89.21%。对2-羟基吡啶降解动力学过程进行模拟，结果显示菌株2PR生长和降解过程符合logisitic模型，该模型为环境中2-羟基吡啶的生物降解提供了理论参考。休止细胞反应和中间代谢产物检测表明，菌株2PR在降解2-羟基吡啶的过程中生成了蓝色化合物4，5，4'，5'-tetrahydroxy-3，3'-diazadiphenoquinone-（2，2'）。推测该菌株降解2-羟基吡啶的途径可能是首先由双加氧酶催化生成2，3，6-三羟基吡啶，后者会自发形成蓝色中间代谢产物，2，3，6-三羟基吡啶发生开环反应，最终被完全降解。菌株2PR是已报道菌株中2-羟基吡啶耐受能力和降解能力最强的菌株，在污染物生物修复方面具有广阔的应用前景。
技术与方法
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  SHBG基因敲除小鼠模型的建立及其表型分析

  孙一平, 王越, 金镇, 王晓岩, 孙磊, 张璇, 冯冲, 周效华

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 39-45. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170806

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  目的：建立性激素结合球蛋白（SHBG）基因条件敲除小鼠模型，为探讨胎盘组织中SHBG在体内的生理功能及其与妊娠期糖尿病发病关系提供实验手段。方法：首先运用生物信息学手段确定小鼠SHBG基因组序列，构建SHBG打靶载体，以电穿孔方法将其导入小鼠ES细胞，筛选培养阳性ES细胞并行PCR鉴定，并将正确同源重组的ES细胞注射进小鼠囊胚，移入受体小鼠子宫；将获得的嵌合体小鼠与C57BL/6J小鼠交配，筛选后获得Flox小鼠，该小鼠与EⅡa-Cre转基因小鼠杂交，子代多次自交获得SHBG全身基因敲除（SHBG^-/-）的小鼠。结果：运用同源重组及ES细胞技术建立了SHBG基因的Flox小鼠，并利用Cre/Loxp重组酶系统建立了SHBG基因全身敲除小鼠模型，PCR方法从基因水平证明了SHBG基因Flox小鼠及SHBG基因全身敲除小鼠模型建立成功。对基因敲除鼠进行初步表型分析发现：SHBG基因全身敲除小鼠的生长发育与野生型小鼠相比无明显肉眼所见异常，SHBG基因全身敲除雌雄小鼠均具有生殖能力。结论：成功建立SHBG基因全身敲除小鼠模型，通过对基因敲除鼠进行初步表型分析，发现SHBG基因全身敲除小鼠外观上发育正常，为进一步研究SHBG在妊娠期糖尿病中的作用奠定了基础。
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  细菌内毒素电化学生物传感器的构建及性能表征

  易喻, 王敏君, 梅建凤, 陈建澍, 张彦璐, 应国清

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 46-50. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170807

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  细菌内毒素为外源性致热源，内毒素的检测在生物制品生产过程中至关重要。构建了一种用于检测细菌内毒素的电化学核酸适体生物传感器，以氨基修饰的内毒素核酸适体EAQ2为配体，通过3-巯基丙酸（MPA）中间连接物，固定修饰在金电极表面，并通过循环伏安（CV）和电化学交流阻抗谱（EIS）两种方式共同表征了生物传感器的构建过程。结果发现MPA组装时间在6 h时能在金电极表面形成稳定的自组装单分子层。构建的生物传感器检测限达0.001 EU/ml，低于目前报道的其他内毒素检测方法的检测限，在0.001~0.1 EU/ml内毒素浓度范围内具有较好的线性关系，相关系数R²=0.9878，在实际生物样品的检测上具有一定的应用前景。
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  利用CpG DNA甲基化酶M.Sss I共表达载体制备限制性内切酶Not I

  王佩, 陈凯, 高嵩

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 51-58. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170808

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  限制性核酸内切酶是DNA重组的重要分子生物学工具。由于其本身对DNA有切割作用导致其重组表达在技术上十分困难，产率低、提纯程序复杂。而商业化生产所采用的利用专一型甲基化酶保护宿主DNA的限制酶表达技术流程繁琐、实用性有限。为表达Not I限制酶，采用来源于Spiroplasma sp.MQ1的DNA甲基化酶M.Sss I特异性甲基化CpG序列，甲基化后的DNA会免受识别位点中包含CpG序列的限制酶Not I的切割。将甲基化酶M.Sss I导入大肠杆菌表达宿主ER2566后，M.Sss I基因在宿主中持续表达并甲基化宿主DNA成CpG甲基化样式；利用此表达体系制备限制性内切酶Not I获得成功。并借助引入纯化标签经过简便的Ni亲和层析和阴离子交换层析2步层析洗脱纯化，制备了高活力高纯度的重组限制酶Not I。此表达体系可应用于一系列识别位点中包含CpG序列的限制酶的表达。
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  谷氨酸依赖型氨基转移酶的高通量筛选方法及其应用

  贺霖伟, 刘璋敏, 冯雁, 崔莉

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 59-65. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170809

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  目的：建立谷氨酸依赖型氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应的96孔板高通量筛选方法，并用于大肠杆菌氨基转移酶WecE突变库的筛选。方法：通过优化偶联指示酶-谷氨酸脱氢酶、信号分子NADH浓度及双酶偶联反应时间，建立了光学法测定氨基转移酶活性的氨基转移酶-谷氨酸脱氢酶偶联反应方法；通过定点饱和突变技术构建了大肠杆菌氨基转移酶WecE的突变库；采用96孔板高通量初筛、摇瓶复筛获得了高活性的转氨酶突变体，并对纯化的突变体进行催化活力分析。结果：建立了谷氨酸依赖型氨基转移酶目标反应与0.5 U/ml L-谷氨酸脱氢酶和0.4 mmol/L NADH信号指示反应相偶联的筛选方法；构建了氨基转移酶WecE Tyr 321饱和突变库，通过96孔板高通量筛选，获得了催化活性比野生型提高3.4倍的突变体Y321F。结论：所建立高通量筛选方法背景干扰小，准确性高，为谷氨酸依赖型氨基转移酶分子进化提供了可行性方案。
综述
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  细菌lux荧光报告系统的研究进展

  崔庆宇, 王明钰, 徐海

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 66-71. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170810

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  lux报告系统以其灵敏、快速、便捷等特性，在分子生物学、临床微生物和生化检测等领域中占据了一席之地。从lux报告系统的组成、类型及特性出发，介绍该报告系统在环境监测、食品安全、新药发现、肿瘤定位等方面的应用。
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  基因工程技术优化透明质酸生产的研究进展

  郜娇娇, 杨树林

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 72-77. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170811

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  透明质酸是由葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺组成的双糖单位聚合而成的直链酸性粘多糖，在医药、化妆品、食品等领域拥有庞大的市场。传统研究通过优化发酵参数改善透明质酸的生产虽然取得了显著成效，但也趋于上限，加之天然生产菌株固有的发酵培养基成本高、具有一定致病性等等的劣势也日益显著。随着分子生物学技术的迅速发展以及对透明质酸合成相关基因研究的不断深入，研究重点逐渐转向利用基因工程技术构建高产、安全、具有特定分子量的透明质酸工程菌株。以下就有关透明质酸生产菌株基因工程改造的策略及研究进展进行概述和展望。
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  石墨烯及其衍生物在骨科的应用

  焦洋, 刘恒, 拉提百克·买买提居马, 曹永平

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 78-83. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170812

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  石墨烯及其衍生物具有独特的物理、化学及生物学特性，如具有抗菌性，促进成骨，增加复合材料的耐磨损等，在生物医学及组织工程领域具有极大的应用前景。主要介绍了石墨烯及其衍生物在骨科的应用及研究进展，从而为未来它们在基础及临床研究提供理论依据。
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  纳米抗体异源表达的研究进展

  李丹, 黄鹤

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 84-95. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170813

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  羊驼体内存在天然缺失轻链的重链抗体（HcAb），其单域抗原结合片段也称为VHH或纳米抗体（nanobody，Nb），是目前已知的最小抗原结合片段。与传统抗体相比，纳米抗体具有分子量小（12~15kDa）、稳定性好和免疫原性低等特点，这些特点使得VHH在基础研究、诊断及治疗上具有极大的应用价值，目前已有多种纳米抗体进入了临床研究阶段。综述了近年来VHH在革兰氏阴性菌（大肠杆菌）、革兰氏阳性菌（芽孢杆菌和乳酸杆菌）、酵母、丝状真菌、昆虫细胞、哺乳动物细胞和植物细胞中异源表达的研究现状，包括表达系统、宿主、载体特点、载体构建方式及产量等；从分子水平、表达水平和理性设计三个层面探讨了纳米抗体产量提高的策略，以期为纳米抗体研究者提供借鉴和思路。
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  巴氏芽孢八叠球菌及相关微生物的生物矿化的分子机理与应用

  吴洋, 练继建, 闫玥, 齐浩

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 96-103. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170814

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  巴氏芽孢八叠球菌是迄今为止所知的利用尿素降解进行生物矿化的最为高效的微生物系统之一，基于其碳酸钙生物矿化形成的"超强能力"，巴氏芽孢八叠球菌已经被成功地应用于沙石、土壤等生物固化中，成为一种全新的、具有极大潜力的生物建筑辅助技术，被称为"生物水泥"。由于巴氏芽孢八叠球菌分离自土壤，没有病原性并具有极好的环境友好性。近年来，其应用领域被拓展到环境治理乃至健康医疗领域，成为全新的研究热点。然而，与应用研究相比，人们对巴氏芽孢八叠球菌生物矿化背后的分子机理还知之甚少。因此，这里针对迄今为止国内外对于巴氏芽孢八叠球菌生物矿化相关的分子机理的研究进行分析介绍，在此基础上综述了包括建工、环境、及医疗健康领域在内的巴氏芽孢八叠球菌的应用，希望能够促进对于该球菌矿化的研究。
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  苯并恶唑嗪酮类化合物功能与生物合成研究进展

  高洪江, 李圣彦, 汪海, 林凤, 张春宇, 郎志宏

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 104-109. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170815

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  苯并恶唑嗪酮（benzoxazinoids，BXs）是植物体内一种重要的次生代谢物，因其具有防御作用和化感作用得到了广泛的关注和研究。随着基因组学及分子生物学的发展，苯并恶唑嗪酮的生物合成在分子领域的研究取得了很大的进展。介绍了苯并恶唑嗪酮概况、苯并恶唑嗪酮的功能以及苯并恶唑嗪酮生物合成参与基因及表达调控。
医药生物技术专栏
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  我国生物制品通用名命名原则的修订

  郭中平, 徐莉

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 110-118. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170816

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  对我国生物制品通用名命名原则进行了立题研究，旨在建立和完善我国生物制品通用名称命名原则。通过分析我国生物制品通用名现状、存在的问题及新型生物药发展趋势，研究比较了国际上具有主导性的药品通用名命名体系，并参照世界卫生组织国际非专利名称（WHO INN）命名原则，在中文语言识别的基础上，对我国生物制品通用名称命名原则提出了具体的增修订意见。
农业生物技术专栏
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  中美转基因作物种植管理制度比较

  刘旭霞, 张楠

  中国生物工程杂志. 2017, 37(8): 119-127. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170817

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  十三五国家科技创新规划提出的"推进新型抗虫棉、抗虫玉米、抗除草剂大豆等重大产品产业化"，给转基因作物的种植管理提出了考验。由于商业化种植的转基因作物种类少，且不包括粮食作物，我国在转基因种植管理上经验不足。选取美国这一转基因作物种植大国作为比较对象，对比两国转基因作物种植前审批程序、种植者的管理义务、减少转基因作物与非转基因作物混杂的管理手段三个方面的差异，认为转基因作物的法律定性，知识产权制度和标识制度，各方主体实施隔离措施、承担损害的能力是差异生成的主要原因。我国宜结合国内的农业环境，在转基因生物安全管理布局上着眼于实质性的风险，并由农业主管部门、转基因作物研发主体、转基因作物种子经营主体合力对种植者进行指导，以避免混杂带来经济纠纷，并降低对生态环境的影响。