人淀粉样前体蛋白氨基端切割片段(a cleaved amino-terminal fragment of amyloid precursor protein,N-APP)结合死亡受体6(Death receptor-6,DR6),会触发神经元和轴突依赖天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶的自我毁灭过程,从而导致阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)的发生。为了在分子水平上研究N-APP-DR6诱导神经元退化途径,制备大量纯化的重组DR6胞外结构域以及鉴定NAPP和DR6胞外结构域的结合位点是关键。从甲醇毕赤酵母中成功表达并纯化了重组DR6胞外域(aa42-349),得率高达90 mg/L。为了验证DR6和NAPP的相互作用关系,构建谷胱甘肽转移酶-死亡受体6(GST-DR6)(aa42-349)融合蛋白原核表达质粒,转化大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)BL21,表达融合蛋白GST-DR6(aa42-349),同时纯化得到DR6的配体NAPP,GST pull-down结果显示DR6与NAPP能够在细胞外发生相互作用。
目的:构建以HBc为载体的甲型流感病毒HA和M2e流感通用疫苗(Flu@uV),利用大肠杆菌BL21(DE3)表达系统,进行初步的蛋白表达及纯化。在此基础上,构建DNA流感通用疫苗。方法:利用全基因合成的序列为模板,成功构建HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc、3M2e-HBc和3HA-3M2e-HBc基因的重组质粒,并在大肠杆菌中表达,经SDS-PAGE、Western blot和电镜检测其表达。将纯化的蛋白与弗氏佐剂共同免疫小鼠,取小鼠外周血进行流式细胞分析。通过荧光分析和Western blot初步验证DNA流感通用疫苗在人源胚胎肾细胞(HEK293T)中的表达情况。结果:成功表达纯化了HA-M2e-HBc、M2e-HBc、HBc和3M2e-HBc四种蛋白,经电镜观察到30nm左右的蛋白纳米颗粒样结构。小鼠外周血流式细胞分析显示HBc和3M2e-HBc可以增加小鼠的免疫力,而HA-M2e-HBc和M2e-HBc对小鼠免疫力的提高没有影响。通过荧光检测和Western blot检测说明DNA流感通用疫苗在真核细胞中成功表达。结论:成功构建HBc与甲型流感病毒HA和M2e的病毒样颗粒,为流感通用疫苗的研制奠定了重要基础。
目的:构建Survivin启动子调控的表达载体,并检测在启动子调控下HSV-TK自杀基因对肝癌细胞HepG2和正常肝细胞HL-7702凋亡的影响。方法:合成含TK基因的质粒PBI-SUR-TK,利用脂质体Lipofectamine 2000将其导入肝癌细胞和肝细胞。然后分别运用RT-PCR和Western blot特异性检测基因和蛋白的表达情况;利用CCK8方法检测细胞增殖情况,流式细胞仪上机检测细胞凋亡情况。结果:肝癌细胞转染组有更多的TK基因表达产物,增殖情况减弱,凋亡情况明显。结论:Survivin启动子驱动的HSV-TK/GCV自杀基因系统对肝癌可能有一定的治疗作用。
目的:探讨miR-21与BMP9之间的关系,明确miR-21在BMP9诱导间充质干细胞成骨分化中的作用。方法:(1)Ad-BMP9感染C3H10T1/2细胞,Real-time-PCR检测miR-21表达。RT-PCR检测ALP的表达。(2)MiR-21转染C3H10T1/2细胞,Real-time-PCR检测miR-21和BMP9表达。(3)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10 T1/2细胞,ALP活性和染色实验检测C3H10 T1/2细胞早期成骨能力。茜素红S染色实验检测钙盐沉积情况。(4)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10 T1/2细胞,Real-time-PCR检测成骨分化相关因子ALP,OCN的表达。(5)MiR-21和BMP9-CM处理C3H10T1/2细胞,Western blot检测p-Smad1/5蛋白水平的表达。结果:(1)BMP9暂时降低miR-21的表达。MiR-21也可以暂时降低BMP9的表达。(2)MiR-21可以协同BMP9增强ALP和钙盐沉积。(3)MiR-21协同BMP9增加了p-Smad1/5蛋白水平的表达。结论:MiR-21与BMP9存在相互关系,两者可以互相调节表达。MiR-21可以协同BMP9促进间充质干细胞C3H10T1/2细胞成骨分化,这一过程与增强BMP9/Smad信号的激活程度有关。
作为泌尿系统常见的肿瘤之一,肾肿瘤发病率在逐年上升。针对Affymetrix hgu133b的基因芯片数据进行差异表达基因筛选,应用加权基因共表达网络分析算法构建肾肿瘤差异表达基因的共表达网络。分析肾部正常组织和肿瘤组织差异表达基因之间的关联模式;选取与肿瘤发生关联程度最高的模块,筛选枢纽基因。最后,针对枢纽基因进行基因本体富集分析。细胞衰老是抑制肿瘤发生的主要机制之一,分析结果显示枢纽基因PLA2R1和TBX3与细胞衰老有关,可能对肾肿瘤的形成具有重要影响。该结果与基因PLA2R1通过促进细胞衰老抑制肾部肿瘤发生的研究结论一致。
家蚕双性基因dsx通过雌雄特异选择性剪接并表达影响体细胞性别发育。在对Bmdsx的表达情况进行深入分析时发现了一个新的雄特异剪接体dsxM3,但其功能未知。为揭示BmdsxM3的生物学功能,首次通过转基因在雌蚕中异位表达BmdsxM3,成功获得两个转基因品系T1和T2。在T1和T2中虽未出现发育异常和性反转事件,但在转基因雌性个体中,SP1和Vg的表达量都出现明显下调,而PBP的表达量也出现明显上调,表明新剪接体BmdsxM3能够调控Bmdsx下游靶基因的表达,暗示BmdsxM3同样参与家蚕体细胞性别发育。
细菌血红蛋白可增加细胞在低氧条件下的氧气利用率,提高细胞的增长速率。为提高E. coli在现有发酵水平下的生物量,获得新型的基因工程底盘细胞,基于空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)血红蛋白基因,比较分析了组成型和诱导型启动子对血红蛋白在E. coli基因工程菌中的表达状况及对E. coli生长的影响。首先合成了空肠弯曲杆菌血红蛋白基因chb,并让chb基因在诱导型启动子(PT7和Pvgh)和组成型启动子(P2和PspoI-Ⅱ)控制下表达;随后,测定了由四种类型启动子控制的血红蛋白工程菌在摇瓶和蓝盖瓶中的生长状况。结果表明四种重组菌可以表达出有活性的血红蛋白,并可显著提高大肠杆菌的生长;在发酵罐中的试验也表明四种工程菌同样对细胞生长具有出促进作用;进一步比较分析了菌体密度、细胞鲜重和CO差式光谱值间的相互关系,讨论了四种类型启动子控制的基因工程菌在诱导表达和生长调控等方面的特点,并为在微氧和好氧等不同发酵条件下选用基因工程底盘细胞提供了参考。
江西是柑橘类水果的主要产区之一,青绿霉菌是导致柑橘采后腐烂的主要病害,化学杀菌剂可产生病原抗药性和残留,一株具有拮抗此病菌的祼脚菇属菌株0612-9被发现。为了探索其产活性物质的代谢培养和活性作用,采用菌丝生长速率法和显微观察法测定了其抗菌活性,单因素试验、Plackett-Burman、最陡爬坡试验和Box-Behnken试验响应面设计等优化出液体培养基组成和培养条件。结果显示:液体培养基组成和培养条件为:马铃薯279.94g/L,葡萄糖30g/L,麸皮8.87g/L,MgSO4·7H2O 0.47g/L,KH2PO4 2g/L,发酵周期10d,接种量5 ml/100 ml,转速180 r/min,摇床温度26℃,装液量100ml/250ml,发酵液抗病菌活性从42.26%提高到55.77%。对意大利青霉和指状青霉的EC50分别为69.25g/L和56.70g/L,最小杀菌浓度250μg/ml低于阳性对照物抑霉唑的500μg/ml,并且对病原菌菌丝体有一定的毒害作用。该祼脚属菌株有潜在开发成柑橘采后保鲜剂的价值。
来源于链霉菌的赖氨酸酰化酶Sm-ELA能催化赖氨酸和月桂酸在水相中合成月桂酰赖氨酸,避免了采用化学合成法所必需的高温和有机溶剂条件,是一种节能、环境友好的替代方法。构建了过表达链霉菌赖氨酸酰化酶基因的重组质粒pET28a-SmELA和pTrcOmpXK122SmELA,分别实现了该酶在大肠杆菌胞内和细胞表面的活性表达。比较两种不同表达方式的效果后,将重组酶应用于催化合成月桂酰赖氨酸的反应中,结果显示,在赖氨酸浓度为50 mmol/L,月桂酸浓度为10 mmol/L时,反应24 h,月桂酸转化率最高达到31.1%。
目的:探讨新型材料poly(ethylene argininylaspartate diglyceride)(PEAD)结合肝素包裹神经生长因子组成的三元复合体比单纯运用NGF治疗大鼠坐骨神经损伤效果明显,为临床治疗外周神经损伤提供实验依据。方法:24只200g左右Wistar大鼠,分成生理盐水组,NGF组,NGF凝聚体三组,每组各8只,距梨状肌下缘远侧约1.5cm处运用静脉夹夹紧坐骨神经2min,采用无创细线(5/0)缝合肌肉和皮肤,并用碘伏进行消毒,NGF组每天沿坐骨切迹肌注80ngNGF,持续30天;NGF凝聚体组仅在造模时肌注复合体(内含2.4μg的NGF);生理盐水组给予等体积的生理盐水。术后每周运用脚步印迹法评价动物的行为学,并于30天后灌流、收集各组损伤侧坐骨神经,运用HE染色及投射电镜观察坐骨神经结构恢复情况,免疫荧光标记MBP,观察其蛋白的表达。结果:NGF组,NGF凝聚体组在行为学、病理结构及蛋白的表达远高于生理盐水组,并且NGF凝聚组的治疗效果优于NGF组。结论:新型凝聚体包载NGF具有明显的促进周围神经损伤后的修复与再生作用,能够在一定程度上提高单纯运用NGF治疗大鼠坐骨神经损伤的不足,达到更加理想和显著的促恢复效果。
海藻糖合酶能够利用麦芽糖一步法转化生产海藻糖,其底物专一性较高,该酶体系生产工艺简单,不受底物麦芽糖浓度的影响,是工业生产海藻糖的首选。为获得具有生产海藻糖合酶能力的毕赤酵母表面展示载体,实验以筛选的Pseudomonas putide P06海藻糖合酶基因为模板,PCR扩增得到海藻糖合酶基因(tres,2064 bp),连接至pPICZαA质粒中,获得重组质粒pPICZαA-tres。以来自酿酒酵母的共价连接细胞壁的Pir系列蛋白的Pir1p成熟肽蛋白作为毕赤酵母表面展示的锚定蛋白,利用PCR技术扩增得到pir1p(847 bp),连接至重组质粒pPICZαA-tres中,获得重组质粒pPICZαA-tres-pir1p。将重组质粒电击转入毕赤酵母GS115中,利用α-factor信号肽将蛋白引导分泌至细胞壁展示于毕赤酵母表面。通过Zeocin抗性筛选,挑选出阳性克隆子并摇瓶发酵。发酵产物经离心、破碎并使用昆布多糖酶水解,洗脱,结果显示,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析可见明显融合蛋白条带,表明海藻糖合酶已成功地锚定在毕赤酵母。将重组毕赤酵母使用pH 7.5的缓冲液清洗并重悬,与底物浓度为30%的麦芽糖在30℃~60℃水浴条件下作用2 h,反应产物利用HPLC检测,能够检测到酶学活性。在优化后的条件pH 7.5,50℃,表面展示海藻糖合酶酶活达到300.65 U/g。40℃~50℃酶活较稳定,保温60 min,残留酶活相对活力达75%以上;最适反应pH值为7.5,并在碱性环境下稳定。
为获得溶血活性低、抗菌活性高的杂合抗菌肽,以家蝇抗菌肽Cec Md和中国林蛙抗菌肽Chensirin为母体肽,并结合毕赤酵母偏爱密码子的原则,设计出6条具有抗菌潜力的新型杂合抗菌肽,将其命名为CC22、CC28、CC29、CC30和CC34(1),CC34,利用SOE-PCR技术合成所需的目的基因,并将其克隆至毕赤酵母表达载体pGAPZαA,通过电击转化技术,将其转化至毕赤酵母SMD1168中,经含有Zeocin的抗性平板筛选阳性转化子,YPD液体培养72h后,经Tricine-SDS-PAGE检测出目的蛋白,然后采用高效液相色谱法对其进行纯化。检测结果显示,表达产物CC29对大肠杆菌、鸡沙门氏菌的最小抑菌浓度(MIC)均为25μg/ml;CC34(1)对大肠杆菌表现相对较弱的抑制作用,最小抑菌浓度为100μg/ml;CC34对鸡沙门氏菌和金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为50μg/ml;且杂合抗菌肽对有益菌均没有表现出抑制作用。6条杂合肽的溶血活性均呈现较低水平,其中表现出抗菌活性的3条抗菌肽中,以CC29的溶血活性最低,CC34(1)和CC34相对次之。结合抑菌活性,CC29和CC34的抑菌效果较为明显,从而确定溶血活性低且抗菌活性较高的CC29和CC34为新型杂合抗菌肽。
同抗体药物相比,非免疫球蛋白配体药物(Non-immunoglobulin scaffolds,非免蛋白配体药物)具有分子量小,不需要翻译后修饰,通常缺乏二硫键,并可进行直接的多聚化修饰等优点。最近几年,研发的非免蛋白配体药物种类就达到了二十余种,如Adhirons,Alphabodies,Centyrins,Pronectins,Repebodies,Affimers,和Obodies等,其中的139个非免疫球蛋白配体,可以特异靶向结合102种蛋白。这些非免疫球蛋白配体多用于癌症和炎症性疾病的治疗和诊断,其中有10多种非免疫球蛋白配体已经进入临床试验研究。最近,非免蛋白配体也被用于伴侣蛋白作结构解析研究,翻译后修饰的细胞内监控,或作为显微镜,流式细胞仪,Western印迹法等检测方法中抗体的替代品。
天蚕素是一类由31~39个氨基酸残基组成的阳离子型线性α螺旋抗菌肽,具有抗细菌、抗真菌、抗病毒以及抑制肿瘤细胞等生物活性。天蚕素与传统抗生素作用机制不同,具有不易产生耐药性的特点,因此成为解决传统抗生素多重耐药性问题的一个新突破口。然而,天蚕素在抗菌活性、选择性、毒性以及稳定性等方面还存在诸多问题,并且天然天蚕素提取工艺复杂,成本较高,不适合大规模生产,其对细菌的高毒性也限制了原核工程菌的使用。近年来多肽分子设计的研究方法颇受青睐,为解决多肽物质诸多问题开辟了新的途径。针对天蚕素类抗菌肽研究过程中面临的主要问题综述了其分子设计的研究进展。
植物寄生线虫在侵染寄主过程中分泌许多与寄生相关的蛋白,这一类蛋白称为效应蛋白,这些效应蛋白在植物细胞内发挥各种作用,从而有利于线虫侵染、寄生和生长发育。研究这些效应蛋白的功能对于掌握线虫侵染植物的分子机理非常重要,也是寻找新的植物线虫病害防治方法的理论基础。对目前应用于研究植物寄生线虫效应蛋白功能的主要方法进行了概述。
L-乳酸是一种重要的有机化合物,具有广泛的应用价值。微生物发酵法生产是当前L-乳酸的主要来源,但受限于精确的发酵条件、菌体产物耐受能力低及底物要求高等因素,导致L-乳酸供给不足且价格偏高。鉴于酿酒酵母利用廉价底物生产有价值物质方面的诸多优势,并随着分子生物学技术的发展,利用代谢工程改造酿酒酵母本身固有的代谢网络,使其高产L-乳酸已成为当前研究的热点。从L-乳酸的异源生产、关键途径改造及菌体生长能力恢复三个方面归纳了关于代谢工程改造酿酒酵母生产L-乳酸的研究进展。最后,指出了酿酒酵母异源生产L-乳酸存在的不足和今后研究的方向。
纤维素丁醇作为一种新型可再生能源,具有与汽油配伍性好、蒸汽压较低、安全系数高、能量密度高及抗爆性好等优势,在替代化石燃料方面极具发展前景,已受到广泛关注。虽然纤维素丁醇工业化生产仍存在一定的技术瓶颈,生产技术经济性也较差,产业化发展受到限制,但未来通过政策支持,在丰富的农林剩余物资源及巨大市场需求的条件下,纤维素丁醇作为新型能源仍具有非常广阔的发展前景。为了更好地促进纤维素丁醇产业发展,以纤维素丁醇的产业化发展为研究对象,总结了纤维素丁醇产业发展现状,分析了纤维素丁醇产业发展过程中存在的问题,从政策、资源及市场等方面对未来纤维素丁醇产业发展的前景进行了预测,并对如何促进其产业化发展提出了建议。
