目的: 研究猪Mx1和牛Mx1蛋白在PK-15细胞中的表达并检测其是否对伪狂犬病病毒 (PRV)具有抑制作用.方法:从IBRS-2细胞和MDBK细胞中分别调取猪 Mx1和牛Mx1 基因,并克隆到pcDNA3.1/myc-His(-)B,构建得到真核重组表达质粒,以脂质体转染的方法将其分别导入到PK-15细胞,从mRNA水平和蛋白质水平鉴定重组质粒在细胞内的表达情况,然后用细胞毒性试剂盒检测这两种蛋白是否对PK-15细胞具有毒性.之后,通过荧光定量PCR检测猪 Mx1和牛Mx1 在攻毒后不同时间、不同攻毒剂量的条件下对PRV的抑制情况,并观察100TCID50病毒攻击细胞72h后的病变程度.结果: 成功克隆了猪 Mx1和牛Mx1 基因,经mRNA水平和蛋白质水平证实,两种重组质粒在PK-15细胞内能够正常表达.从荧光定量PCR和细胞病变的角度来看,细胞内表达的Mx1蛋白对PRV具有显著性的抑制(P <0.001).结论: 猪 Mx1和牛Mx1 基因在PK-15细胞中表达的Mx1 蛋白能够抑制PRV在胞内的复制.
目的:探讨血清淀粉样蛋白A转录激活因子(serum amyloid A-activating transcription factor,SAF)编码区外显子e4A和e4B区域的组蛋白表观遗传学信息,为进一步研究SAF自身的转录调控机制和该基因转录与前体mRNA剪接的关系奠定基础.方法:利用染色体免疫共沉淀实验(ChIP)分析SAF基因编码区组蛋白修饰的变化.首先收集LPS刺激不同时间的THP-1细胞,终浓度为1％甲醛交联蛋白质和DNA,利用超声波将其染色体随机断裂成适当大小的片段,选用ChIP级别兔多克隆抗组蛋白H3抗体、兔多克隆抗组蛋白H3K36三甲基化抗体、兔多克隆抗组蛋白H3K9单甲基化抗体和兔多克隆抗RNA聚合酶II CTD重复区5号丝氨酸磷酸化抗体实验,以富集得到的DNA样品为模板进行半定量PCR和定量qPCR分析.结果: LPS刺激作用下SAF基因编码区组蛋白H3富集信号减弱、外显子e4A区域单个核小体上H3K9单甲基化(H3K9me1)水平减弱、H3K36三甲基化(H3K36me3)修饰富集水平增加、RNA polII CTD重复序列第5号丝氨酸磷酸化水平降低.结论: LPS刺激导致SAF基因编码区组蛋白H3离散,该区域核小体解散、凝聚的染色体重塑呈开放构象;含SAF编码区基因信息的DNA暴露,利于RNA polII转录延伸.
目的:利用构建的增强子样序列筛选载体,筛选在大肠杆菌中增强外源蛋白质表达的序列,并利用删除突变体初步鉴定其功能区域.方法:以氯霉素乙酰转移酶(CAT)基因序列与人乳头瘤病毒(HPV)主要衣壳蛋白基因 L1 的截短序列L11连接作为报告基因,从采集的样品中筛选增强子样序列,通过蛋白质表达来检测其增强活性,并通过构建删除突变体来初步鉴定其功能区域.结果: 成功筛选到一条增强子样序列,可使检测载体氯霉素抗体提高11倍,融合蛋白表达水平提高2.26倍,其功能区域主要集中在1~265bp.结论:从收集的样品中成功筛选出一个增强子序列,能提高外源基因在大肠杆菌中的表达.
考察了外源添加中间代谢产物、维生素B1和硫酸镁对大肠杆菌发酵产L-苯丙氨酸的影响,结果表明,添加1g/L柠檬酸三钠、1g/L α-酮戊二酸、150mg/L维生素B1及3g/L硫酸镁均对L-苯丙氨酸的合成有利.根据构建的大肠杆菌合成L-苯丙氨酸的生化反应网络,利用代谢通量分析其原因.结果表明,这些物质的添加均可以调节G6P和PEP节点处的代谢通量分布,为L-苯丙氨酸的合成提供更多的前体物质赤藓糖四磷酸(E4P)、磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和还原力NADPH.通过补料分批发酵实验得出,优化后菌体对总葡萄糖的消耗提高了24.49%,菌体终浓度提高了23.50%,L-苯丙氨酸的终浓度提高了62.87%,L-苯丙氨酸的收率提高了30.88%,乙酸的合成降低了56.51%.
目的:制备Photosan脂质立方液晶纳米光敏剂,通过体外实验探讨其介导的光动力疗法(photodynamic therapy, PDT)特异性杀伤肿瘤细胞效果.方法:以单油酸甘油酯(glyceryl monooleate, GMO)和泊洛沙姆407(poloxamer 407, P407)为液晶材料,以光敏剂Photosan为模型药物,制备Photosan立方液晶纳米粒,通过Malvern粒径仪和扫描电子显微镜等考察其理化性质;通过MTS法考察Photosan立方液晶纳米粒对正常肝细胞株和肝癌细胞株的暗毒性及光动力杀伤效果.结果:成功制备Photosan脂质立方液晶纳米粒,该纳米粒对人肝L-02细胞和人肝癌HepG2细胞均没有暗毒性,其介导的PDT对人肝L-02细胞增殖有一定抑制作用[细胞抑制率为(32.9±1.19)%],而对肝癌HepG2细胞增殖具有更显著的抑制作用[细胞抑制率为(77.9±2.06)%];Photosan立方液晶介导的光动力作用对人正常肝细胞的增殖抑制作用低于Photosan,但对肝癌细胞的增殖抑制作用高于Photosan.结论:Photosan脂质立方液晶纳米粒对人正常肝细胞安全性较好,对肝癌细胞的光动力杀伤效应明显优于Photosan,为光动力治疗癌症提供了创新性方法.
在5L发酵罐上研究了溶解氧(DO)对地衣芽孢杆菌分批发酵生产γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的影响并考察在8h、32h、56h时,葡萄糖激酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、丙酮酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶和谷氨酸脱氢酶的活性及对应时间点上γ-PGA的生产速率.通过溶解氧电极和搅拌转速的串联控制发酵过程中溶解氧水平,发现高溶解氧(60%)水平和低溶解氧(10%)水平均不能高效积累γ-PGA.6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的提高对产物的积累有抑制作用,葡萄糖激酶和谷氨酸脱氢酶的酶活提高对产物积累有促进作用,过高的丙酮酸脱氢酶和异柠檬酸脱氢酶的活性在一定程度上可以促进菌体生长但不利于产物的积累.此外,通过对三种不同DO水平下γ-PGA生物合成途径中相关代谢流量的计算表明,在pH 6.5的条件下,对于谷氨酸依赖型生产菌株,提高外源谷氨酸利用率可以促进γ-PGA的生物合成.
钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)SYPA5-5是诱变选育的一株高产精氨酸菌株.柠檬酸合酶作为TCA途径的关键酶,对细胞胞内氨基酸代谢流调节有重要作用.在钝齿棒杆菌SYPA5-5中过量表达同源的柠檬酸合酶(citrate synthase)基因 prpC2 ,研究其对精氨酸及副产物合成的影响.重组菌C. crenatum SYPA5-5/pDXW-10-prpC2 胞内柠檬酸合酶比酶活提高了5.37倍,使L-精氨酸产量在5L发酵罐中达到44.7g/L,与对照相比提高了23.1%.同时,有机酸测定分析TCA循环的精氨酸前体柠檬酸及异柠檬酸的量有所提高,且赖氨酸合成前体草酰乙酸量减少,氨基酸测定分析L-精氨酸发酵中最主要的副产物L-赖氨酸浓度由原来的5.96g/L降到1.21g/L,降低了80%.
目的:构建表达4-羟基苯乙酸-3-羟化酶A(4-hydroxyphenylacetate-3-hydroxylase A,HHA)的重组菌株,进而以酪醇为底物,利用重组菌株转化生产羟基酪醇.方法:选择大肠杆菌BL21(DE3)为模板来扩增HHA基因,经酶切后连接到表达载体pET-28a中,获得重组表达载体pET28a-HHA,将重组载体转化到感受态细胞BL21(DE3),在重组菌液中加入适量酪醇,利用胞内的重组酶对酪醇加羟基合成羟基酪醇,细胞离心后,分别采用薄层层析法和气质联用法检测上清液中羟基酪醇的转化结果.结果:IPTG诱导表达后,经SDS-PAGE分析获得分子质量分别为58.8kDa和18.5kDa的两条蛋白质条带.薄层层析法和气质联用法均检测到催化产物羟基酪醇的生成.结论:成功构建了表达HHA的重组菌株,该菌株可有效将酪醇转化为羟基酪醇.
利用基因工程技术高效制备具有促进角膜上皮细胞增殖功能的垂体腺苷酸环化酶激活肽(PACAP 27)衍生多肽RP2,在细胞水平初步研究其生物学作用,为其用于角膜损伤治疗提供实验基础.采用基因重组技术表达重组肽RP2,经Chitin-Beads和HPLC纯化、SDS-PAGE 和质谱鉴定后,研究其对小鼠角膜上皮细胞增殖的影响.实验结果表明:利用基因重组技术制备的PACAP 27衍生多肽RP2的分子量为3.3 kDa,纯度达96%;分别用重组肽RP2、PACAP 27及PBS作用于小鼠角膜上皮细胞,处理24 h及48 h时,RP2处理组角膜上皮细胞增殖率分别为(49.6±3.1)%、(93.0±1.7)%,PACAP 27处理组细胞增殖率分别为(29.0±2.4)%、(78.8±2.6)%,PBS对照组细胞增殖率为(20.2±1.1)%,(40.9±3.3)%.利用建立的重组多肽制备技术条件,可实现PACAP衍生多肽RP2高效制备,制备的RP2可有效促进角膜上皮细胞的增殖,从而有望成为一种新型角膜损伤治疗候选药物.
目的:构建及筛选高效表达原创性全人源抗人IgE单克隆抗体的重组工程细胞株.方法:将采用核糖体展示技术筛选到的原创性全人源抗人IgE单链抗体(scFv)基因改构设计为IgG1κ型全长抗体,构建重组真核表达质粒并电转染CHO-S细胞,Dot-blot法选取多株高表达克隆进行40ml摇瓶批次培养,再据细胞生长特征及抗体表达量选取高表达克隆进行40ml摇瓶及3L摇瓶流加培养研究,选取候选细胞株并对改构前后抗体的生物学活性进行比较研究.结果:成功构建了pMH3-H、pMH3-L、pCApuro-H、pCApuro-L四种重组真核表达质粒并成功共转染CHO-S细胞.完成了4次电转染8轮细胞克隆筛选,获得两株表达量较高的候选克隆Mab和Mab,在3L摇瓶流加培养中抗体表达量分别达到470mg/L及499mg/L.生物膜光干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)亲和力结果显示Mab1#及Mab2#两株单抗亲和力均达到nmol/L级(10-9),与现有唯一上市的抗人IgE单抗药物奥马珠单抗(Omalizumab)的亲和力相当.选取Mab1#全长抗体与其改构前的母本单链抗体的表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)中和活性比较结果显示Mab1#抑制hIgE与FcεRI结合的EC50为3nmol/L,EC90为9nmol/L,较改造前亲和力提高了4.3倍,中和活性(EC50)提高了23.7倍,中和活性(EC90)提高了41.3倍.结论:成功将表达原创性全人源抗人IgE的单链抗体(约25kDa)改造为亲和力及中和活性均大幅提升的全长抗体(约150kDa),获得2个候选细胞株.
以提高酿酒酵母耐热性、降低乙醇发酵过程控温能耗成本为目的,通过分析嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)HB8热激蛋白基因,设计并构建了5个热激蛋白元器件,并导入酿酒酵母.通过梯度升温培养筛选出性能较好的耐热元器件FBA1p-groes-SLM5t,并利用恒定高温培养进一步验证了含有该元器件的酿酒酵母工程菌S. c-GroES具有良好的耐热性,研究表明在42℃培养48h的存活率是对照的3倍.此外,FBA1p-groes-SLM5t还能提高酵母的抗氧化性,42 ℃下菌株S. c-GroES的ROS水平比对照低37.6%,H2O2处理1 h后存活率是对照的1.62倍,说明耐热元器件在缓解热胁迫的同时对细胞的抗氧化性也有帮助.耐热工程酿酒酵母S. c-GroES,其40℃发酵乙醇产量相对于30 ℃对照和40℃对照分别提高了25%和13.8%.嗜热菌热激蛋白的引入可以明显提高酿酒酵母的耐热性及其乙醇合成效率.
蛋白质复性工艺的研究一直是重组蛋白药物研发领域的热点.稀释复性法和透析复性法的蛋白损失较大、复性得率不理想,而层析柱可以完成复性同时纯化,并能在高蛋白浓度条件下得到较高的复性率,有利于规模放大,是近年来最受关注的复性工艺.就层析柱复性工艺进行了归纳,包括凝胶过滤层析、离子交换层析、亲和层析、疏水相互作用层析的复性,并对其复性原理及各自的优缺点进行了比较分析,最后从复性工艺的有效性、优越性以及对于规模化生产的适用性三个角度论述复性工艺的评价方法.
氨基酸作为一类营养物质在维持机体正常的生理生化反应方面具有重要的功能,常用作食品、药品和化妆品等的添加剂.氨基酸的生产主要依靠微生物发酵,产氨基酸菌的选育却是制约大规模工业生产氨基酸的重要因素.随着微生物分子育种技术的发展和运用,利用代谢工程改造细胞本身固有的代谢网络,指导氨基酸高产菌的选育已成为当前研究的热点.以谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)为例,就该菌株代谢网络的特征以及高产氨基酸的代谢工程策略和应用进行综述.
对我国生物医药园区中的108个园区进行了调研,对我国生物医药园区的发展现状有了初步的认识.经过调研发现,部分地区生物医药园区布局合理,带动区域经济健康发展.全国初步形成三大生物医药产业集群.园区成为生物医药产业发展的重要依托.最后,对我国生物医药园区发展的提出了五条建议.
