党的十八大以来，习近平总书记多次深入科研院所、企业、高新技术园区，调研考察创新驱动发展战略实施情况，并发表一系列重要讲话。
目的：表达制备重组Ⅱ型登革病毒非结构蛋白NS1，检测该重组表达蛋白的免疫原性，为检测试剂盒的研制提供基础。方法：根据Ⅱ型登革病毒NS1蛋白基因序列（GenBank 登录号：NC_001474），对基因序列进行编码密码子优化后进行全基因合成，随后，经双酶切将目的片段克隆到表达载体pET28a上，通过IPTG诱导表达；表达产物经Western blot鉴定后，进一步进行蛋白纯化和透析复性，制备获得重组Ⅱ型登革病毒NS1蛋白。收获的NS1蛋白免疫小鼠，制备多克隆抗体，通过间接酶联免疫学方法测定其效价，检测其免疫原性。结果：成功构建了Ⅱ型登革病毒NS1蛋白的表达载体。Western blot显示表达的重组蛋白能够被NS1单抗特异性的结合，纯化复性后的重组蛋白在小鼠体内表现出良好的免疫原性。结论：重组表达的NS1蛋白有良好的免疫原性，为以后的NS1单克隆抗体的制备和登革病毒检测试剂盒的研制提供了良好的基础。
目的：观察sonic hedgehog（Shh）信号通路在骨形态发生蛋白9（BMP9）诱导的小鼠间充质干细胞（MSCs）C3H10T1/2和C2C12成骨分化中的作用，并初步探讨其作用机制。方法：Shh信号通路抑制剂Cyclopamine和激活剂Purmorphamine以及过表达Shh腺病毒分别作用于BMP9处理的C3H10T1/2和C2C12细胞，碱性磷酸酶（ALP）检测早期成骨指标ALP，茜素红S染色检测晚期成骨指标钙盐沉积，RT-PCR检测Shh信号相关基因以及成骨关键转录因子的表达，Western blot检测Shh的表达，荧光素酶报告基因检测Smad1/5/8的转录调控活性。结果：BMP9促进Shh信号相关基因的表达，激活Shh信号可增强BMP9诱导的C3H10T1/2和C2C12细胞早晚期成骨分化并促进了BMP9诱导的Smad荧光素酶活性，抑制Shh信号后作用相反。结论：激活Shh信号通路可促进BMP9诱导的小鼠MSCs成骨分化，抑制其活性后作用相反。
目的：构建RAB27A基因慢病毒表达载体，并研究RAB27A 对人HepG2肝癌细胞增殖能力的影响。方法：以pEGFP-C1-RAB27A质粒为模板，PCR扩增出融合绿色荧光蛋白的RAB27A基因全长，酶切后插入穿梭载体pENTR/U6，再应用Gateway技术，基因重组到表达载体pHAGE-EF1α-puro-DEST上，构建得到重组慢病毒表达载体pHAGE-GFP-RAB27A-puro。测序鉴定序列正确后，将其与包装质粒psPAX2和包膜质粒pMD2.G共转HEK-293T细胞进行慢病毒包装。收集并浓缩培养上清以获得慢病毒颗粒感染HepG2细胞。荧光显微镜下观察HEK-293T细胞和慢病毒感染HepG2细胞绿色荧光强度；Western blot检测稳定感染HepG2细胞株RAB27A 蛋白表达水平；CCK8和平皿克隆形成实验检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞增殖活力的变化；流式细胞术检测稳定过表达RAB27A的HepG2细胞周期分布情况。结果：经双酶切及测序结果证实重组慢病毒表达载体构建正确；浓缩后病毒滴度较高；重组慢病毒感染HepG2细胞后，细胞外源RAB27A的蛋白表达水平显著上调，HepG2细胞的增殖活力和克隆形成能力受到明显抑制（P<0.01），S期细胞分布比例明显降低（P<0.01）。结论： RAB27A 基因重组慢病毒表达载体构建成功，外源过表达RAB27A 基因可显著抑制HepG2细胞增殖能力。RAB27A在肝细胞癌发生发展和迁移中扮演了重要角色。
目的：研究IQGAP1基因干扰对人食管癌细胞同质粘附能力的影响。方法：体外培养人食管癌KYSE150和 EC9706细胞，利用Western blot方法检测两株细胞IQGAP1蛋白的表达，利用缓慢聚集和细胞分离实验比较两株细胞同质粘附能力的差异；进一步在KYSE150和EC9706细胞中构建IQGAP1基因干扰的稳定细胞系，观察IQGAP1基因干扰后细胞同质粘附能力的改变。结果：KYSE150细胞IQGAP1蛋白表达量低于EC9706细胞，而同质粘附能力高于EC9706细胞；IQGAP1基因干扰后，其蛋白表达量明显降低，而细胞同质粘附能力明显增强。结论：IQGAP1 基因干扰能够显著增强食管癌细胞的同质粘附能力，从而降低肿瘤细胞的恶性表型。
目的： 构建重组慢病毒介导的NUP88-shRNA载体，通过RNAi技术分别观察沉默NUP88后对MCF-7增殖，粘附，侵袭和转移情况的影响，为乳腺癌的临床基因治疗寻找新的靶点。方法： 构建NUP88重组慢病毒表达载体，包装后检测滴度，以最佳复感染指数转染乳腺癌MCF-7细胞，利用RT-PCR和Western blot检测各组MCF-7细胞中mRNA和蛋白的表达效率；MTT法和流式细胞仪检测法，检测NUP88基因被干扰后对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响；细胞侵袭实验检测NUP88基因被干扰后对MCF-7侵袭力的影响。结果 四组病毒及一组阴性对照均构建成功，滴度均为4E+8TU/ml；RT-PCR和Western blot检测，结果表明：经NUP88-shRNA转染的MCF-7细胞组NUP88 mRNA和蛋白质的表达与经阴性转染组和空白MCF-7细胞组相比，差异明显具有统计学意义（P<0.01）；测定NUP88-shRNA1组沉默效率最高，沉默率可达到86%；MTT法结果表明：实验组经NUP88-shRNA1慢病毒转染后细胞增殖程度显著减少，与空白组和对照组相比有显著性差异（P<0.05）。流式细胞仪检测三组MCF-7细胞凋亡结果表明：实验组经慢病毒转染后细胞凋亡率显著增加，与对照组和空白组相比有显著性差异（P<0.05）；细胞侵袭实验表明：在肿瘤细胞常规培养24h后，实验组与空白组和阴性对照组比较，穿膜细胞数量明显减少，具有显著性差异（P<0.05） 结论： NUP88重组慢病毒可以通过RNAi成功抑制MCF-7中NUP88基因的表达，并能显著抑制其增殖及远处的侵袭能力。
目的： 观察双基因联合干扰MMP-9和FAK对小鼠黑色素瘤高转移细胞B16F10体外侵袭、迁移能力的影响。方法：分别构建pGV102-MMP9-siRNA，pGV102-FAK-siRNA重组质粒载体，脂质体TM2000介导转染小鼠黑色素瘤B16F10细胞，实验分为空白对照组、Anti-MMP-9组，Anti-FAK组、Anti-MMP-9 &FAK组、阴性对照组。经G418筛选GFP+克隆，流式细胞仪分析阳性率，激光共聚焦观察转染后细胞形态，半定量RT-PCR检测各组B16F10细胞MMP-9和FAK基因的mRNA转录水平，Transwell侵袭、迁移实验测定各组B16F10细胞体外侵袭、迁移能力。结果： 经G418筛选，3个转染组阳性率分别为92.41±1.64%，95.72±0.21%，91.52±0.11%，且转染后细胞形态良好；与空白对照组相比，3个转染组的MMP-9，FAK mRNA转录水平下降明显（P<0.01），迁移、侵袭能力明显降低（P<0.01），但Anti-MMP-9 &FAK组细胞侵袭迁移能力显著低于Anti-MMP-9 组和Anti-FAK组（P<0.01）。结论： 相比单独沉默MMP-9 或FAK，联合沉默MMP-9 和FAK可明显降低小鼠黑色素瘤B16F10细胞体外迁移、侵袭能力。
为探究和阻断嗜乙酰乙酸棒杆菌乙酸代谢途径，提高缺氧条件下琥珀酸的产率，减少副产物乙酸的合成，以C. acetoacidophilum ΔldhA为出发菌株，利用同源重组的方法分别敲除磷酸乙酰转移酶、乙酸激酶、CoA转移酶和丙酮酸脱氢酶复合体的相关基因pta，ackA，ctfA与aceE，研究突变菌产琥珀酸过程中相关参数的变化。结果表明：敲除pta与ackA基因后，对乙酸浓度，糖耗速率和糖酸转化率影响不大；pta，ackA与ctfA基因的同时失活使得乙酸的浓度和摩尔转化率分别降低81.4%和77.2%，葡萄糖消耗速率下降28.3%，琥珀酸对葡萄糖摩尔转化率提高25.3%；而单独敲除aceE基因后，乙酸几乎不产生，葡萄糖消耗速率下降35.6%，琥珀酸对葡萄糖摩尔转化率提高34.7%。因此，缺氧条件下，嗜乙酰乙酸棒杆菌的乙酸合成几乎全部走乙酰CoA途径，pta，ackA与ctfA是由乙酰CoA合成乙酸途径中最主要的基因；敲除基因aceE， 可以完全阻断乙酸生成，有效提高琥珀酸产率。
采用RT-PCR法扩增马铃薯夏波蒂的α-淀粉酶成熟肽基因，将其亚克隆至毕赤酵母表达载体pPIC9k上，Sac II 线性化重组表达载体，电击转化毕赤酵母GS115感受态细胞，构建重组酵母GS115/pPIC9k-amy，利用锥虫蓝法筛选获得高活性转化子（GSamyA5），以终浓度为0.5%甲醇诱导该重组菌表达α-淀粉酶，通过Ni2+-NTA agarose亲和层析纯化，并对其酶学性质进行研究。结果表明：该酶的最适反应温度为45℃，40~50℃酶活较稳定，保温50 min，残留相对活力达92.6%；最适反应pH值为6.0，并在pH 6.0~7.0范围内酶活保持稳定。Ca2+、K+可促进酶反应，以Ca2+影响为最，相对酶活力提高到125%；Cu2+，Fe2+，Fe3+，Zn2+对该酶有显著抑制作用；Mn2+，Mg2+对酶有微弱抑制作用，Li+、Na+对酶活影响不大。
粘细菌作为第三大类次级代谢产物产生菌，是挖掘抗肿瘤新药物的重要资源。将本实验室保藏的粘细菌菌株Myxococcus macrosporus STXZ54进行发酵培养后，通过对发酵液进行硫酸铵沉淀、丙酮沉淀等，分析了该菌株发酵液中抗肿瘤活性物质的性质，采用高效液相色谱技术对发酵液中的抗肿瘤活性物质进行了分离，并对该物质进行了肿瘤细胞毒性的测定，利用激光共聚焦显微镜观察该物质作用B16后的亚细胞结构变化。实验结果表明该物质可能为常温下性质较稳定的蛋白质类化合物，纯化到的单一组分WGF5对B16，Hela，MCF-7，Hep-3B肿瘤细胞均具有较强的抑制作用，其作用48 h的 IC50（最低半抑制浓度）分别为2.767 μg/ml、2.204 μg/ml、3.758 μg/ml、3.073 μg/ml。MTT实验以及激光共聚焦显微镜下观察分析发现，蛋白WGF5能够明显改变细胞形态并最终导致肿瘤细胞死亡。从粘细菌Myxococcus macrosporus STXZ54分离到的活性物质具有广谱高效的抗肿瘤效果，有开发成抗肿瘤新药物的潜在价值。
目的：通过携带绿色荧光蛋白（EGFP）和转录因子Lmx1A（LIM homeobox transcription factor 1-alpha）的双顺反子重组腺病毒的构建和包装，评价双顺反子构建方法的可行性，为进一步探讨转录因子Lmx1A在间充质干细胞分化为神经元细胞的潜能提供实验基础。方法： 通过PCR方法获得增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和转录因子Lmx1A的CDS区序列，将其构建到双顺反子表达质粒pcDNA3.0BA，通过PCR的方法获得双顺反子表达盒，并插入到腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV中，经过与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1的同源重组，获得阳性重组质粒pAd-EGFP-Lmx1A，并进一步在HEK293细胞中包装为腺病毒。用携带EGFP和Lmx1A基因的重组腺病毒感染人脐带间充质干细（human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUC-MSCs），通过RT-PCR、免疫荧光及Western blot的方法检测EGFP和Lmx1A的表达及产物定位。结果： 透射电镜检查包装好的重组腺病毒为典型的腺病毒颗粒形态，大小约为75nm。Ad-EGFP-Lmx1A感染hUC-MSCs后检测到EGFP和Lmx1A的转录产物，表达产物互不影响，表达强弱无明显差异。结论： 利用双顺反子真核表达质粒pcDNA3.0BA能够构建同时表达两个基因的重组腺病毒，腺病毒感染细胞后能够将两个基因传递至间充质干细胞中并表达。通过EGFP的观察可对腺病毒的表达效率进行实时观察，这些研究结果为任意组合的双基因表达建立了快速有效的构建方法，重组腺病毒Ad-EGFP-Lmx1A的成功构建也为将来研究Lmx1A在间充质干细胞分化为神经元过程中的作用提供了实验基础。
作为研究基因表达调控的重要方法，近年来染色质免疫共沉淀（ChIP）得到了越来越广泛的应用，但有关将乳腺组织作为ChIP材料的研究及其方法尚未见报道。采用传统的组织ChIP试剂盒处理乳腺组织时，存在样品回收率低、乳脂/乳蛋白影响杂交效率和超声积热等问题，针对以上问题对乳腺组织ChIP方法进行改进。新方法省略组织均一化步骤、用酶切-超声法代替超声法进行染色质片段化、在细胞裂解和酶切步骤间增加洗涤步骤。结果显示，与脾脏组织相比，乳腺组织不适合进行组织均一化处理。酶切-超声法比超声法更适于对乳腺组织进行染色质片段化。采用改进后的ChIP方法获得的DNA样品中，靶序列得到显著的富集，所得的DNA样品能够满足测序（ChIP-Seq）要求。结果说明，改进后的方法适用于乳腺组织染色质免疫共沉淀，并为研究乳腺组织基因表达调控奠定了基础。
克隆绵羊肌肉生长抑制素（myostatin，MSTN）基因并在大肠杆菌中诱导表达，纯化重组蛋白免疫健康的双峰驼（Bactrian camel），分离其外周血淋巴细胞提取总RNA，利用RT-PCR扩增骆驼重链抗体IgG2、IgG3的可变区（VHH）基因片段，将VHH片段与pCANTAB5E连接后电转入大肠杆菌TG1构建纳米抗体文库。结果显示，纳米抗体文库容量为9.5×105，挑取部分克隆进行测序分析，所获得的纳米抗体文库具有良好的多态性，为进一步筛选绵羊MSTN的高特异性纳米抗体片段奠定了基础。
对一株从腐烂海带中筛选得到的产褐藻胶裂解酶的菌株进行鉴定，并对其产酶条件进行发酵优化。经形态学、生理生化特征和分子生物学鉴定，将其鉴定为盐单胞菌属，并命名为Halomonas sp. WF6。通过在摇瓶培养水平上进行单因素和多因素正交试验，确定褐藻胶裂解酶产生菌WF6的最适产酶培养基为：褐藻酸钠6.0 g/L，蛋白胨5.0 g/L，酵母粉2.5 g/L，NaCl 30 g/L，K+ 5 mmol/L。进而采用最适培养基进行产酶条件的优化，优化后的发酵产酶条件为：初始pH 8.0，培养温度25℃，接种量为2%，摇瓶装液量30 ml/250 ml，培养时间39 h。优化后的褐藻胶裂解酶酶活达117.66 U/ml，是优化前的2.1倍。该酶对褐藻酸钠的酶解产物主要由聚合度为二和三的褐藻寡糖组成。
乙型肝炎作为一种发病率高、死亡率高的传染性疾病，已严重威胁人类健康，乙肝病毒（hepatitis B virus，HBV）是诱发乙型肝炎的重要病因。目前，最主要的治疗方法是运用抗病毒药物控制病情，但这些药物都不能完全治愈乙型肝炎且复发率高。近年来，RNA干扰技术（RNA interference， RNAi）逐渐成为有效、快速治疗乙型肝炎的新疗法。利用RNA干扰技术体外合成针对HBV基因的siRNA，选择适当的载体将其运送至靶细胞，使HBV基因沉默，从而抑制病毒复制，可有效达到治疗乙肝的效果。本文围绕siRNA沉默HBV基因的设计原理、递送载体、靶向策略、以及治疗效果与应用前景等方面进行了系统综述，为今后siRNA治疗乙肝的临床应用提供参考。
细菌菌影（bacterial ghost，BG）是革兰阴性菌在噬菌体PhiX174的裂解基因E的作用下形成不含核酸、核糖体等胞质内容物的细菌空壳。这种细菌空壳保留了与天然细菌一样的完整外膜结构，且不具有活菌样的致病作用，可作为疫苗无需佐剂就能诱导机体产生体液免疫应答和细胞免疫应答。菌影内部及外膜上可装载DNA、抗原和药物等异源物质，易被机体免疫细胞识别捕获，使其成为一种新型的生物递送载体。另外，菌影具有制备简单，易于保存等优点。细菌菌影在疾病预防和治疗方面具有广阔的应用前景。
生物催化是指将酶或生物有机体用于有用的化学转化的过程，在人们对传统化学催化的环境影响抱有忧虑的情况下，生物催化提供了一种有吸引力的选择。在过去的几十年里，对生物催化剂的研究每出现一次大的进步，生物催化的发展就会出现一次高潮。因此，生物催化剂的发现与改造已成为当今研究的热点。宏基因组文库技术的出现克服了许多微生物不可培养的障碍，人们能够从自然资源中获得丰富的潜在的生物催化剂。而基于理性设计的分子改造技术的发展，可以使得人们对潜在的生物催化剂进行快速而有效的改造以满足工业化生产的需求。随着生物催化剂发现与改造的手段不断进步，更多的优良生物催化剂得到了广泛的应用，生物催化在工业生产中也得到了更深入的应用。结合作者的研究工作，总结了生物催化剂发现与改良的一些研究进展，以为获得更多优良的、能够实现工业应用的生物催化剂奠定理论基础。
生物印迹技术是一个简单、直接的酶修饰技术，已应用到有机合成、生物传感器制备和生物分离等领域，在推动化学品绿色合成方面具有潜在的应用价值。本文在生物印迹概念的提出与发展、分类、应用以及印迹技术策略的发展等方面综述近期研究成果，针对生物印迹研究过程的现实问题，展望其未来的发展趋势，为生物印迹相关研究提供有益的借鉴。
