2014年, 第34卷, 第3期　
刊出日期：2014-03-25

  

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研究报告
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  稳定高表达和干扰Nodal基因黑色素瘤细胞株构建及EMT表型鉴定

  权美玉, 郭强, 张坤水, 方瑞, 李翠琳, 杜军

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 1-8. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140301

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  目的：构建稳定过表达及稳定干扰Nodal的黑色素瘤细胞B16细胞株，并鉴定其EMT表型，用于研究Nodal诱导黑色素瘤EMT的现象及机理。方法：将过表达小鼠Nodal基因的质粒pL-tdTomato-mNodal，及携带有干扰Nodal基因序列的shRNA质粒pGFP-V-RS-Nodal，分别转染B16细胞。通过抗性筛选富集，阳性克隆挑选及扩大培养，获得稳定转染细胞株B16/dT-mNodal及B16/sh-Nodal。通过实时荧光定量PCR和Western blot技术检测胞内Nodal的过表达及敲除情况和EMT标记物的表达情况。结果：两株细胞均构建成功，B16/dT-mNodal细胞株发出强烈红色荧光，胞内Nodal水平上调明显，并呈现间质细胞特性；B16/sh-Nodal细胞株发出强烈绿色荧光，胞内Nodal水平下调明显，并呈现上皮细胞特性。结论：成功构建稳定过表达Nodal及稳定干扰Nodal的B16细胞株，并构建Nodal影响B16细胞EMT过程的模型，为研究Nodal在黑色素瘤EMT过程中的作用提供了重要的实验工具。
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  Ad.RGD-ING4-PTEN对MEG01人白血病细胞的抑制作用

  黄晨, 王家融, 杨吉成, 盛伟华, 缪竞诚

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 9-17. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140302

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  目的：构建RGD修饰的 ING4和PTEN 双基因共表达重组腺病毒载体（Ad.RGD-ING4-PTEN），研究其对人白血病细胞MEG01的抑制作用。方法：采用AdEasyTM腺病毒重组系统，在本科室已成功构建的pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter、pAdTrack-CMV-polyA-promoter腺病毒转移质粒的基础上，在多克隆酶切位点的Not I、Xho I间插入PTEN片段，得到pAdTrack-CMV-ING4-polyA-promoter-PTEN重组转移载体，与RGD-4C修饰的腺病毒骨架质粒pAdEasy-1（RGD）同源重组后，经包装和扩增获得ING4和PTEN双基因共表达重组腺病毒Ad.RGD-ING4-PTEN。将Ad.RGD-ING4-PTEN体外感染人白血病细胞MEG01，检测腺病毒对MEG01细胞的感染效率，Western blot法检测外源基因 ING4和PTEN 在MEG01细胞中的表达，CCK8法检测外源基因的导入对MEG01细胞的生长抑制作用，流式细胞仪检测外源基因导入对MEG01细胞的凋亡和周期的影响。结果：鉴定结果显示，成功构建了Ad.RGD-ING4-PTEN双基因共表达腺病毒，其能有效地感染MEG01细胞。Western blot检测到 ING4和PTEN 在MEG01细胞中的表达； ING4和PTEN 基因能明显抑制MEG01细胞的生长，诱导其凋亡并产生G2/M期阻滞作用，且双基因联合作用较单基因作用更明显。结论：成功构建了RGD-4C修饰的ING4和PTEN双基因共表达腺病毒载体Ad.RGD-ING4-PTEN。收获的腺病毒能有效感染人白血病MEG01细胞。Ad.RGD-ING4-PTEN具有抑制MEG01细胞的生长、诱导其凋亡及G2/M期阻滞的作用。
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  转基因细胞片复合PLGA支架修复兔软骨缺损的研究

  姚梅, 崔颖, 胡晶, 李俊霞, 王宇

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 18-25. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140303

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  细胞片技术是应用组织工程方法使培养细胞从培养表面分离而形成含有细胞外基质的一层完整片状结构，弥补了传统组织工程技术的不足，是获取种子细胞以及对种子细胞进行转移的一项新技术。为探讨体外生长分化因子-5（ GDF5 ）基因转染修饰的BMSCs细胞片与 GDF5 转基因BMSCs负载的PLGA支架形成的共聚物修复兔甲状软骨缺损的效果，实验通过腺病毒转染 GDF5 基因至四代兔BMSCs，温度敏感性培养皿制备 GDF5 转基因细胞片并与负载有转染 GDF5 基因 BMSCs的PLGA支架复合，移植至同种兔甲状软骨缺损处，分别于术后4、8周行大体观察和组织学检测其修复效果。实验分3组：（A）转基因细胞片包裹负载有转基因BMSCs的PLGA支架组；（B）负载有转基因BMSCs的PLGA支架组；（C）负载BMSCs的PLGA支架组。结果显示，体外成功收获了完整的 GDF5 转基因细胞片，Real time PCR检测到GDF5 mRNA的表达，行大体组织的Ⅱ型胶原免疫组化和阿利新蓝染色显示：A组和B组均表达Ⅱ型胶原和糖胺聚糖（GAG），但A组表达高于B组，有统计学意义（P<0.05）。由此可得，转基因细胞片包裹负载转基因BMSCs PLGA支架较传统转基因BMSCs负载PLGA支架方法具有更加优越的成软骨能力，能更有效地促进软骨缺损的修复。
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  中断BMSCs向神经细胞诱导分化的细胞的恶变研究

  黄小娟, 王鸣刚, 廖世奇, 张虹, 王炯蓉, 马瑾, 杨楠, 马宁

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 26-33. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140304

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  目的：通过中断BMSCs的正常分化过程，探索肿瘤发生与干细胞分化受阻的关系。方法：全骨髓贴壁培养法获取BMSCs，β-巯基乙醇法诱导BMSCs分化为神经细胞，同时，在加入诱导培养基后的不同时间中断诱导，正常培养至第四代及之后。通过免疫组化检测、软琼脂克隆形成实验和CTX免疫抑制小鼠成瘤实验等鉴定和分析中断神经诱导细胞的分化特性和恶性转变趋势。结果：通过免疫组化检测中断神经诱导细胞逐渐表达了神经丝蛋白（NF）；通过软琼脂集成形成实验，中断神经诱导40h组的细胞表现了比其他组较强的克隆形成能力，并在细胞病理学HE染色实验和细胞CTX免疫抑制小鼠成瘤实验证明中断神经诱导40h组的细胞发生了病理性恶变和获得致瘤性。结论：中断BMSCs的正常分化的培养，细胞有转化为肿瘤细胞的趋势。
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  AdEasy重组腺病毒系统对Ad-HIF1α的构建和鉴定

  周年, 胡宁, 龚璇, 汪长东, 廖军义, 梁熙, 黄伟

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 34-40. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140305

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  目的：采用AdEasy重组腺病毒系统构建重组腺病毒Ad-HIF1α并进行鉴定。方法：使用高保真PCR从EST克隆中扩增 HIF1α 基因编码区，并用限制性内切酶BamH I和Xba I对PCR片段限制性酶切，用T4 DNA连接酶将其连接至同样经BamH I和Xba I限制性酶切的穿梭载体pAdtrace-TO4，构建穿梭载体pAdtrace-HIF1α；将pAdtrace-HIF1α与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1在细菌BJ5183中同源重组，得到重组腺病毒质粒pAd-HIF1α；pAd-HIF1α经Pac I酶切后转染至E1表达包装细胞系HEK293中进行 HIF1α 基因表达腺病毒包装，重复扩增，氯化铯密度梯度离心法纯化，获得高滴度Ad-HIF1α；感染干细胞株C3H10T1/2，通过荧光蛋白的表达了解其感染效率，并应用PCR及Western blot验证目的基因的表达，并通过检测下游靶基因VEGF的表达，了解该载体表达的目的蛋白的生物活性。结果：重组腺病毒质粒pAd-HIF1α，经PCR及酶切分析验证构建正确；在HEK293中进行HIF1α基因表达腺病毒包装，经反复冻融4次使细胞裂解，获得高滴度重组腺病毒载体；通过红色荧光蛋白（Red fluorescence protein，RFP）表达，观察到Ad-HIF1α能够高效感染C3H10T1/2细胞，并通过PCR证实了HIF1α在C3H10T1/2细胞较对照组明显高表达；在感染Ad-HIF1α的C3H10T1/2细胞中，HIF-1α下游靶基因血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表达明显增高，证实表达的目的蛋白具有生物活性。结论：应用AdEasy重组腺病毒系统成功构建Ad-HIF1α，并证实其具有生物活性，为后续研究奠定了基础。
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  黄瓜(Cucumis stavius L.) CSEBF1基因的克隆及其表达特性分析

  金晓霞, 董延龙, 秦智伟, 于丽杰, 吴姝菊, 宋健

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 41-47. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140306

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  通过对乙烯利诱导黄瓜茎尖SSH文库的筛选，采用RT-PCR和电子克隆技术，从黄瓜中克隆到一个 EIN3-Binding F box protein 1 基因，命名为 CSEBF1 基因（GenBank登录号为KF366911）。结果表明： CSEBF1 基因的cDNA全长1 964bp，编码640个氨基酸，含有F-box蛋白保守区域和蛋白质泛素化作用底物识别必需结构—LRRs （leucine-rich repeats），氨基酸序列与拟南芥的同源性为60.47%。实时荧光定量RT-PCR法分析了 CSEBF1 基因在乙烯利诱导后植株不同部位的表达情况，表明该基因在叶片和根部处理8 h达到最高值，而在茎部16 h达到最高值。同时通过RT-PCR方法检测茎、叶部乙烯信号转导相关基因的表达情况发现， CSEIN3 基因于处理4 h在茎、叶诱导表达； CSCTR1 基因在处理后8 h的茎和16 h的叶片有表达量； CSACS2 基因在处理后2 h的叶片被诱导表达，并且表达量随后增加。 CSACS1G 基因（即F基因）于处理后4 h的叶片增强表达，随后持续较微弱的水平。
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  钝齿棒杆菌丙酮酸激酶的克隆表达及其对精氨酸合成的扰动影响

  卢妍, 饶志明, 徐美娟, 满在伟, 张显, 耿燕, 许正宏

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 48-55. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140307

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  钝齿棒杆菌（Corynebacterium crenatum）SYPA 5-5是诱变选育的一株高产精氨酸菌株。丙酮酸激酶（pyruvate kinase）是EMP途径的限速酶，对胞内能量产生和代谢流调节方面都有重要作用。为提高葡萄糖消耗速率以缩短发酵周期，以钝齿棒杆菌基因组为模板，克隆得到pyk基因并将其在C.crenatum SYPA 5-5中成功表达，葡萄糖平均消耗速率为1.71 g/L/h较C.crenatum SYPA 5-5提高33.5%，精氨酸产量和最大产率分别为43.32 g/L和0.55 g/L/h较C.crenatum SYPA 5-5分别提高20%和19.5%。结果表明，加强表达丙酮酸激酶能增强EMP途径，提高精氨酸产量。
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  bmy基因敲除对解淀粉芽孢杆菌Q-426溶血性及抗菌活性的影响

  陶思美, 郑维, 赵朋超, 周伟, 权春善, 范圣第

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 56-60. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140308

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  Iturin家族环脂肽对于红色毛癣菌等病原真菌具有较强的抑菌活性，有潜力成为治疗皮肤疾病的新型抗真菌药物。解淀粉芽孢杆菌Q-426菌株能够产生环脂肽fengycins和iturin家族的bacillomycin D，但该菌株发酵液具有溶血活性。为确定bacillomycin D是否为引发溶血作用的主要物质，本文利用同源重组基因敲除技术，构建解淀粉芽孢杆菌bmy基因缺失菌株，抑制bacillomycin D的合成，研究对其溶血性及抗菌活性的影响。突变菌株发酵液中未检测到bacillomycin D产生，且发酵液的溶血性及抗菌活性明显减小，表明bacillomycin D与该菌的溶血活性及抑菌活性密切相关。
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  雷公根叶斑病菌SJTU59纤维素酶液的性质研究及纤维素酶基因保守区域的分析

  吴琼, 王猛, 李雅乾, 高士刚, 余传金, 孙佳楠, 张泰龙, 陈捷

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 61-67. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140309

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  将雷公根叶斑病菌SJTU59（Leptosphaerulina chartarum SJTU59）于玉米秸秆粉为唯一碳源的培养液中诱导培养，通过DNS（3，5-二硝基水杨酸）法检测，首次发现其可以产生纤维素酶。该纤维素酶液最佳反应温度为50℃，最佳反应pH为4.8，对低温，酸碱及部分金属离子具有一定的耐受能力。在50℃，pH 4.8条件下，其最大酶活力为6.383 ± 0.196 U/ml。利用纤维素酶基因简并引物，通过PCR技术扩增得到了2个新的纤维素酶基因的保守区域，即 glu-l1 （1 512 bp）和 glu-l2（429 bp）。通过氨基酸序列比对及系统进化分析发现，glu-l1编码的氨基酸序列GLU-L1与Thermoascus aurantiacus var. levisporus来源的β-1，4-葡聚糖酶（ABX79553）有62%的同源性，属于第3水解家族；glu-l2编码的氨基酸序列GLU-L2与Aspergillus fumigatus Af293来源的内切-β-1，3（4）-葡聚糖酶（XP_755769）有49%的同源性，属于第16水解家族。
技术与方法
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  重组HSV-Ⅱ病毒疫苗的微载体悬浮培养生产工艺研究

  林美玲, 唐寅, 张明, 易小萍, 黄明志

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 68-78. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140310

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  经过重组减毒的Ⅱ型溶瘤单纯疱疹病毒（rHSV-Ⅱ）在体外具有良好的溶瘤效果，并对小鼠体内B16R黑色素瘤内注射具有较高的疗效。重组HSV-Ⅱ病毒作为高效的新型溶瘤病毒疫苗有望用于肿瘤的临床治疗。Vero细胞是广泛应用于病毒疫苗生产的细胞基质，该细胞系对多种病毒敏感且产量高，其微载体培养安全，开发重组HSV-Ⅱ溶瘤病毒肿瘤疫苗的Vero细胞微载体反应器悬浮培养生产工艺具有重要的意义。以自主开发的低血清培养基为基础，对Vero细胞的反应器微载体球转球转移放大工艺及在位消化放大培养工艺进行了研究和比较，以新老微载体比3：1的比例成功实现了微载体球转球转移放大，建立了可实现至少四次/级连续放大的球转球转移放大培养工艺，可用于工业化生产过程。在此基础上，初步建立了以Vero细胞为基质的重组HSV-Ⅱ病毒疫苗反应器微载体无血清悬浮培养生产工艺，最大病毒滴度可达到6.62 lgTCID50/ml以上。为以Vero细胞为基质的无血清病毒疫苗规模化培养提供了一种简便、高效的工艺方法。
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  人心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的原核表达、纯化和冻干品的制备

  武建伟, 才蕾, 任艳娜, 钱伟, 王继华, 唐时幸

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 79-83. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140311

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  目的：获得重组人心型脂肪酸结合蛋白，分析其活性及制备冻干品。方法：从GenBank中检索人源H-FABP CDs 序列，合成基因后构建原核表达载体pET-28a（+）-H-FABP。将表达载体转入E.coli BL21（DE3），摸索pET-28a（+）-H-FABP最佳诱导条件，表达并纯化重组蛋白。使用检测试剂检测纯化后的重组H-FABP活性，研究最佳冻干方案并考察冻干品的稳定性。结果：经过优化诱导条件，重组H-FABP在BL21（DE3）中以可溶性蛋白形式表达。诱导条件为OD₆₀₀≈0.6，IPTG终浓度0.4mmol/L，30℃诱导4h。通过Ni²⁺亲和层析纯化可得到纯度大于95%的重组H-FABP蛋白。重组H-FABP冻干品可以在37℃稳定保存12d，25℃、4℃稳定保存至少4个月。结论：本项研究中的重组H-FABP表达体系成熟、蛋白活性高，冻干品稳定性好，为后续研究提供了稳定高效的生物原材料。

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  逆转录法筛选mRNA靶点设计核酶对GPA的表达干预实验研究

  付辉, 李菲菲, 马琼, 付怀秀, 崔玉芳, 毛建平

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 84-90. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140312

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  采用自行设计5’固定3’随机的文库对基因mRNA进行杂交用于逆转录反应以筛选mRNA的寡核苷酸结合靶点。对人I型跨膜糖蛋白—血型糖蛋白A （glycophorin A，GPA）的mRNA筛选了4个反义寡核苷酸可结合靶点，分别设计反义核酸（Antisense），分别加入mRNA中用RNase H验证各靶点的核酸结合和切割效率，最终确定2个高效结合和切割靶点。再设计Ribozyme，构建表达核酶（Ribozyme）质粒，利用慢病毒（Lentivirus）包装技术，感染人源红系白血病细胞株K562细胞，在细胞水平验证其下调GPA基因表达的效果，对转染细胞mRNA进行反转录和Real Time PCR分析mRNA表达水平，并在蛋白水平进行了Western Blot分析。结果表明文库结合逆转录方法筛选靶点设计的Ribozyme具有高效率下调膜受体表达的作用，GPA为I型跨膜糖蛋白，该实验为筛选mRNA靶点提供参考方法，并对膜受体表达干预有参考价值。

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  电容法在线测定发酵过程中毕赤酵母浓度的研究

  李兰, 王泽建, 金勇, 孙文华, 庄英萍, 张嗣良

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 91-95. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140313

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  活细胞量是与细胞生长、代谢、生产力相关的重要生理参数。在线活细胞测定仪能够利用电容的原理检测发酵液中的活细胞量。本文详细介绍了国产在线活细胞测定仪的检测原理，并说明了其在毕赤酵母发酵过程中的应用情况。结果表明，我们设计的在线活细胞测定仪能够直接、实时、在线获得发酵过程中可靠的活细胞量，且有效避免采样操作的干扰。这一技术符合过程分析技术（PAT）的要求，并可以与其他参数相结合进行分析，作为发酵过程开发、控制和优化的有利工具。
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  拮抗枯草芽孢杆菌KC-5的分离鉴定及其发酵优化

  柳慧丽, 李园园, 鞠瑞成, 赵宏涛, 杨清

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 96-102. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140314

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  为了筛选出对植物病原菌具有拮抗作用的生物防治细菌，采用平板对峙法从蔬菜根际土壤中分离获得一株对多种病原真菌具有抑制作用的枯草芽孢杆菌，并对抑制后的病原菌菌丝进行了观察，结果表明该菌株对尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、层出镰刀菌以及腐皮镰刀菌均具有抑菌活性。通过形态特征、生理生化特征及16S rRNA序列分析，将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），并对其发酵培养基进行了优化。
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  具有ACE抑制活性的霞水母酶解肽制备条件优化

  贾梦蛟, 刘睿, 陆杰霖, 朱蕴菡, 王令充, 王欣之, 吴皓, 鲁明明

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 103-108. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140315

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  目的：采用胰蛋白酶制备霞水母ACE抑制肽，并以响应面法优化酶解肽制备工艺，通过超滤分离获得具有ACE抑制作用的酶解肽活性部位。方法：单因素实验以ACE抑制率为指标，考察温度、酶解时间、pH、加酶量，进一步通过响应面法优化酶解工艺，以不同截留分子量的纤维膜进行分离。结果：胰蛋白酶水解霞水母制备ACE抑制肽的最佳工艺条件为：酶解温度：49.6℃，加酶量为0.69%，pH为7.8，酶解时间2.0h，酶解产物的平均ACE抑制率为56.79%，与预测值57.20%的相对误差为0.41%，经过超滤分离获得分子量<1k Da的酶解产物，ACE抑制活性最高，其IC₅₀为 66.58μg/ml。结论：确定霞水母酶解肽的制备工艺，其中分子量<1kDa的部分为主要效应物质基础。
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  多孔陶瓷吸附固定纤维堆囊菌发酵制备埃博霉素

  龚国利, 刘丽丽, 王娜

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 109-113. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140316

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  由纤维堆囊菌产生的埃博霉素具有极大药用价值，但因纤维堆囊菌液体环境中聚团非均匀生长限制了埃博霉素的大规模生产。借助多孔陶瓷的多孔结构，可为粘细菌提供固体附着生长面，提高埃博霉素产量。利用造孔剂法制备硅藻土基多孔陶瓷，在优化制备及改性条件后，当30目木屑造孔剂用量为2.5%（质量分数），7 MPa下制得的硅藻土基多孔陶瓷性能良好，孔径集中在5 μm，比表面积为23.55 m2/g，孔隙率为32%，机械强度为10.2 MPa；经1.5 mol/L FeCl3改性的多孔陶瓷对纤维堆囊菌的吸附量达36.8 mg/g。在优化固定化发酵条件后，当在300 ml三角瓶中装液量为45 ml，固液比3：5，接种量10%，温度30 ℃，转速220 r/min，最初pH 7.5，发酵时间为8 d时，埃博霉素的产量达90.2 mg/L，与游离发酵相比提高了近4倍。
综述
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  间充质干细胞分化为心肌细胞的诱导方法研究进展

  井乐刚, 乔静, 路芳, 甄鑫, 卢嫚, 艾燕

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 115-124. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140317

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  间充质干细胞作为一种取材方便、易于分离培养、体外扩增快、免疫原性低的成体干细胞，具有自我更新和多向分化潜能，可在体内外不同的诱导条件下分化为心肌细胞，是理想的心肌再生治疗的种子细胞。本文综述了间充质干细胞分化为心肌细胞的诱导方法，包括化学试剂、中药制剂、机械力和电磁刺激、心肌环境因子、损伤组织条件培养、组织工程方法等，为其在心肌损伤性疾病尤其是心肌梗死治疗中的应用提供基础。
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  微生物细胞通透性改善方法与策略

  赵伟睿, 胡升, 黄俊, 梅乐和

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 125-131. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140318

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  与酶催化相比，全细胞催化可以避免昂贵、繁琐的酶提取与纯化过程，可以进行涉及多个代谢途径和辅酶再生的生化反应。但是由于细胞膜和细胞壁对底物和产物的传质限制，常导致微生物细胞的催化效率低下。细胞透性化技术可以在不破坏细胞有机整体结构的情况下改善细胞被膜的通透性，使得小分子物质和一些较大分子物质能够自由进出细胞，从而提高细胞催化效率。目前，细胞透性化方法主要有三类方法：透性化试剂添加法、物理处理法和分子生物学法。本文将对微生物细胞的透性化方法与策略做一综述，以期为开展微生物细胞透性化研究提供一些参考。
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  工业微生物的酸胁迫响应及其抵御策略

  吕春微, 李霜, 徐晴

  中国生物工程杂志. 2014, 34(3): 132-137. https://doi.org/10.13523/j.cb.20140319

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  有机酸的积累在工业发酵过程中是一个较为普遍的现象，会导致发酵体系pH的降低，进而引起酸胁迫，限制细胞生长及目标产物的积累。针对这一问题，本文阐述了工业微生物应对酸胁迫所发生的生理变化，提出了微生物在酸性环境中可能的3种自我调节机制，概括总结了目前提高微生物酸耐受性的策略及各自的优缺点，指出了未来可能的发展方向，以期为提高工业微生物的酸耐受性提供思路。