2013年, 第33卷, 第11期　
刊出日期：2013-11-25

  

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研究报告
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  N-乙酰半胱氨酸通过激活PI3K-Akt信号途径抑制过氧化氢诱导骨髓间充质干细胞凋亡

  谢荣辉, 殷嫦嫦, 殷明, 陈伟才, 邬亚华, 何丁文, 林思文, 耿书国

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 1-7.

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  目的：研究N-乙酰半胱氨酸（NAC）对H₂O₂诱导骨髓间充质干细胞（BMSCs）凋亡的影响，并探讨N-乙酰半胱氨酸对骨髓间充质干细胞的PI3K-Akt信号通路的影响。方法：采用全骨髓贴壁培养法培养SD大鼠BMSCs，随机分成5组：正常对照组、H₂O₂处理组、NAC组、NAC+H₂O₂组和LY294002干预组。倒置相差显微镜观察各组细胞形态变化；MTT法检测不同浓度H₂O₂、NAC刺激组细胞存活率；流式细胞术检测各组的细胞凋亡率；Western blot检测各组rBMSCs中Akt，p-Akt的表达。结果：H₂O₂可诱导BMSCs发生凋亡，其存活率与H₂O₂浓度呈依赖性改变，其形态呈典型的凋亡样改变；与H₂O₂组相比，正常对照组、NAC+H₂O₂组的凋亡率均降低；与LY294002干预组相比，NAC+H₂O₂组的凋亡率降低，H₂O₂组与之没有统计学差异；与正常组相比，NAC能刺激磷酸化Akt水平升高，并与作用时间长短有关；与H₂O₂组相比，NAC+H₂O₂组的p-Akt表达量升高，而LY294002干预组与H₂O₂组的p-Akt表达量未见明显差异。结论：N-乙酰半胱氨酸可通过激活PI3K-Akt信号通路对过氧化氢诱导的骨髓间充质干细胞凋亡起到保护作用。
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  重组半胱氨酸脱巯基酶AtLCD的表达、纯化及酶学性质

  袁慧虹, 梁雅丽, 沈洁洁, 张丽萍, 刘志强, 裴雁曦

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 8-13.

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  目的：在重组大肠杆菌中表达重组拟南芥L-半胱氨酸脱巯基酶AtLCD（H₂S内源产生关键酶），确定最佳诱导表达和纯化条件，并研究重组酶的酶学性质。方法：对大肠杆菌BL21 （DE3）/pET28a-LCD进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 （IPTG）诱导培养，将纯化的目的蛋白AtLCD进行酶学性质的研究。结果：重组蛋白的最佳诱导表达条件为0.1 mmol/L IPTG，30℃诱导3 h。500 mmol/L的咪唑洗脱Ni柱可得较纯的目的蛋白。重组酶性质研究结果表明，酶的最适pH为9.5，最适作用温度为37℃，最适条件下的以L-Cys为底物的米氏常数（Km）为1.572 mmol/L，Vmax为1.52 nmol/mg·min。金属离子Mg²⁺，Fe³⁺和EDTA对重组酶的活性有一定的抑制作用，Ba²⁺、Ca²⁺和Co²⁺在一定程度上提高了酶的活性，其中Co²⁺效果更强。蛋白变性剂SDS和酶抑制剂羟胺也不同程度地抑制了酶的活性。结论：明确了重组AtLCD的酶学性质和最佳诱导表达及纯化条件，为该LCD的深入研究和气体信号分子H₂S在植物应答逆境胁迫机制的研究奠定了基础。
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  miR-30a抑制BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化

  李宝林, 白慧丽, 张汝益, 严树涓, 何方, 杨丹丹, 刘晨, 施琼

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 14-20.

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  目的：确认miR-30a在BMP9诱导间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化中的作用。方法：首先用Ad-BMP9处理间充质干细胞C3H10T1/2，通过碱性磷酸酶（ALP）检测试剂盒检测早期成骨指标ALP、Western blot 和PCR检测晚期成骨指标OPN，茜素红S染色检测钙盐沉积了解BMP9对C3H10T1/2细胞的成骨分化作用，同时用Real-time PCR检测miR-30a在该成骨分化中的变化。然后用BMP9条件培养基分别作用Ad-mmu-miR-30a和Ad-RFP预处理10h的C3H10T1/2细胞，检测早期成骨指标ALP、晚期成骨指标钙盐沉积和骨钙素OPN的表达。最后探讨miR-30a在BMP9诱导C3H10T1/2细胞成骨分化中的可能作用机制。结果：Ad-BMP9处理C3H10T1/2细胞5d，7d后，ALP的活性的表达增高；第9d后，OPN的表达增加；第14d后，钙盐的沉积明显增多。而miR-30a过表达后，抑制了这一现象。同时发现过表达miR-30a后，Runx2蛋白水平较对照组下降而mRNA水平基本没有变化。结论：miR-30a可以抑制BMP9诱导C3H10T1/2细胞的成骨分化，其作用机理可能和Runx2相关。
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  解淀粉芽孢杆菌Q-426培养基优化及抑菌活性的预测

  周广麒, 马蓬勃, 刘俏, 权春善, 范圣第

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 21-26.

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  为了提高解淀粉芽孢杆菌Q-426发酵生产的抑菌活性，运用响应面法优化解淀粉芽孢杆菌Q-426发酵培养基组分，并利用BP神经网络对抑菌活性进行了预测。优化后培养基配方（g/L）为：葡萄糖3.92、氯化铵0.19、氯化镁3.83、牛肉膏5.00，并以此作为输入数据，将抑菌活性即抑菌圈直径作为输出数据，建立了BP神经网络预测模型。结果表明：优化后抑菌圈直径由24 mm提高到29mm。训练BP神经网络的抑菌圈直径的拟合值与实际值之间的相对误差为-2.962 9%~2.857 1%，相对误差的绝对值的平均值为1.197 9%；测试BP神经网络的抑菌圈直径的预测值与实际值的相对误差为-1.111 1%~1.153 8%，相对误差的绝对值的平均值为0.993 1%，说明建立的基于4个培养基成份的抑菌圈直径BP神经网络预测模型是可行的。
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  抗狂犬病病毒单链抗体的筛选及鉴定

  陈继军, 毛晓燕, 乔玉玲, 毕司英

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 27-31.

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  目的：利用噬菌体展示技术构建的噬菌体抗体库，筛选、表达及鉴定具有体外中和活性的抗狂犬病病毒单链抗体。方法：以21份接受狂犬病病毒疫苗免疫的健康人外周血构建的抗狂犬病病毒scFv噬菌体免疫库为基础，免疫管包被纯化狂犬病病毒颗粒，通过三轮筛选，ELISA检测单克隆噬菌体抗体颗粒的阳性率，DNAStar和Vbase2对阳性克隆进行序列分析。序列正确的单链抗体构建原核表达质粒，转化大肠杆菌 BL21（DE3）菌株，IPTG诱导表达单链抗体。经压力破碎、镍亲和层析对表达的蛋白进行纯化。RFFIT检测纯化蛋白对狂犬病病毒的体外中和活性。同时使用间接ELSIA检测获得的scFv对3aG，CVS，CTN及PV株的交叉反应性。结果：共获得40个阳性、基因测序结果正确的单链抗体。其中7个获得原核表达菌株，但只有3个获得较高的可溶性表达。RFFIT结果表明有4个scFv比活大于500 IU/mg。7个scFv对4种病毒株均有一定的交叉反应。结论：成功从该scFv噬菌体免疫库中筛选出特异性scFv；RFFIT结果表明获得的scFv具有体外中和狂犬病病毒的活性。
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  碳源和氮源对木蹄层孔菌产漆酶的影响及酶学性质研究

  尚洁, 吴秋霞, 练小龙, 王秋玉

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 32-37.

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  对不同碳源和氮源及碳氮比对木蹄层孔菌产漆酶的影响进行了研究，以提高漆酶产量，同时分析了该漆酶的酶学性质。漆酶合成的最适碳源是麦麸，最适氮源是蛋白胨，C：N为10.4，优化后漆酶产量增加了约7.88倍；反应最适pH为3.0，最适反应温度为50℃，K_m为0.20 mmol/L，V_max为2.58 mmol/L·min；DTT 0.1mmol/L和NaN₃ 10mmol/L几乎能抑制漆酶全部活性，终浓度为10mmol/L的Ba²⁺，Ca²⁺，Co²⁺和Fe²⁺也几乎能抑制该酶的全部活性。该研究将为木蹄层孔菌漆酶的生产及在环境工程领域的应用提供基础信息。
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  产生物膜菌株的分离鉴定及其产膜特性分析

  李龙杰, 周刚, 施庆珊, 欧阳友生, 陈仪本, 胡文锋

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 38-43.

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  目的：在含异噻唑啉酮类杀菌剂的腐败变质样品中分离筛选能够产细菌生物膜的菌株，并对其产膜特性进行初步研究。方法：采用平板划线法分离纯化菌株；采用微孔板结晶紫染色法筛选产生物膜菌株；通过生理生化特征和16S rDNA分子进化分析鉴定菌株种属；运用激光共聚焦电子显微镜观察分离得到的菌株在玻璃片表面形成生物膜情况，包括胞外多糖及生物膜内部活、死细菌分布；最后再次采用微孔板结晶紫染色法研究培养时间、pH值和不同碳源对该菌产生物膜的影响。结果：分离筛选出一株产生物膜菌株BF-17，并且该菌株被鉴定为阴沟肠杆菌（Enterobacter cloacae）；BF-17分别在96 h和pH为5时产生物膜量最高；静置培养4 d后，BF-17在玻璃片表面能产生典型的生物膜形态和结构；同时该菌株利用α-乳糖和D-果糖产生物膜能力最高，而利用柠檬酸产生物膜能力最低。结论：菌株BF-17产生物膜能力稳定，可以作为生物膜深入研究的材料；同时，BF-17的产膜能力易受外界环境条件的影响。
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  纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)发酵生产γ-聚谷氨酸过程中培养基组分的优化

  张文, 张树清, 马晓彤, 何翠翠

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 44-50.

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  通过摇瓶培养的方法，对纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）ZW-2发酵生产γ-聚谷氨酸过程中的培养基组分进行优化，从而提高γ-聚谷氨酸的产量。在单因素试验优化的基础上，利用Design-Export软件，采用Plackett-Burman试验设计筛选培养基组分中对产γ-聚谷氨酸影响最显著的因子，然后通过爬坡实验逼近γ-聚谷氨酸产量的最大区域，最后运用三因素三水平的Box-Behnken Design实验设计对关键因子进一步优化求得产γ-聚谷氨酸的最佳条件.结果表明，获得最佳产量时关键因子的最优组合为：谷氨酸钠（68.76g/L）、氯化铵（1.16g/L）和磷酸氢（二钾（2.16g/L），在此条件下，6组验证试验的平均产量为36.421g/L，是优化前的1.54倍。纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）ZW-2发酵生产γ-聚谷氨酸培养基组分的优化过程中，采用Plackett-Burman Design和Box-Behnken Design相结合的方法，效果显著，经济有效。
技术与方法
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  一种新型的通过免疫富集纯化溶酶体方法

  张磊, 阳宇, 吴传芳

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 51-55.

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  用传统的密度浓度梯度法分离溶酶体具有耗时长，样品需求量大，而且无法得到纯度较高的溶酶体等不足，因此有必要开发一种简便分离溶酶体的方法。依据溶酶体膜蛋白LAMP2的特性，开创性地尝试用免疫富集溶酶体膜蛋白的方式纯化溶酶体：首先构建了带Flag标签的LAMP2真核表达载体，并转染Hela细胞，用免疫荧光鉴定其亚细胞定位情况，发现重组蛋白LAMP2-Flag特异性定位于溶酶体。在Hela细胞中筛选得到了稳定表达LAMP2-Flag的细胞系。大规模培养该细胞系，在非变性条件下分离细胞质提取物，利用anti-Flag抗体做免疫沉淀，用蛋白质免疫印迹检测，发现沉淀产物中特异性富集了溶酶体标识蛋白LAMP1。用糖苷酶活性检测，发现沉淀产物中酸化蛋白酶活性很高，表明富集到较纯的溶酶体。这种改良的新型方法步骤简捷，样品需求量少，获得的溶酶体纯度高，为从少量细胞中分离溶酶体提供了一个种优化方案。
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  四环素核酸适配体电化学生物传感器的研制

  陈丹, 姚冬生, 谢春芳, 刘大岭

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 56-62.

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  农产品抗生素残留是目前动物性食品安全中的突出问题。四环素的简便、快速检测方法是食品安全控制中十分重要的技术。本研究利用等温滴定量热法筛选到的四环素核酸适配体做识别分子制作生物传感器，用电化学方法研究了该生物传感器检测四环素的电化学行为。结果：等温滴定量热法筛选出一条对四环素有高亲和力的适配体，解离平衡常数Kd=51.8μmol/L。差分脉冲伏安分析，在5.0~5.0×10³μg/L 浓度范围内，峰电流值的变化△Ip与四环素浓度的对数呈现良好的线性关系，相关系数R²=0.987 6，检测限为1.0 μg/L，反应时间为15min。该检测限明显低于目前国家限定的四环素残留量（6.0×10²μg/L），也低于目前其他报道的四环素适配体传感器的检测限。
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  基于胞内cAMP浓度测定融合蛋白GGH活性的改良方法

  耿燕, 任怡琳, 许正宏, 窦文芳

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 63-67.

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  目的：改良一种基于胞内cAMP浓度变化，用于融合蛋白GGH生物学活性测定的方法。方法：根据融合蛋白GGH是GLP-1类似物，能促进胰岛β细胞增殖，产生胞内第二信使cAMP的原理，利用酶联免疫法测定胞内cAMP的含量。结果：Exenatide或融合蛋白GGH刺激大鼠β胰岛素瘤细胞RIN m5f后，选用100nmol/L IBMX作为cAMP保护剂，用DPBS为药物稀释剂，采用液氮-100℃反复冻融2次裂解细胞，最后用酶联免疫法可稳定的测定上清液中cAMP含量。结论：成功改良了融合蛋白GGH体外高通量生物学活性测定方法。运用此方法可快速鉴定融合蛋白GGH及其它GLP-1类似物的生物活性。
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  HβD-3在大肠杆菌中的融合表达与纯化

  朱钧萍, 李改瑞, 杜启科, 郭中敏, 陆家海

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 68-74.

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  抗菌肽是生物体内合成的一种具有抗菌活性的多肽类物质，对多种病原体乃至耐药性菌株具有明显的杀伤作用，是固有免疫及适应性免疫的重要参与物质。HβD-3是人体内一类内源性多肽，与其它β-防御素相比，耐高盐，具有灭活多种耐药性菌株的能力。针对如何高效表达和快速纯化这个问题，研究选用pET-EI质粒载体在E. coli BLR（DE3）表达原始序列HβD-3及密码子优化序列 HβD-3i。经密码子改造后的重组抗菌肽HβD-3i的表达量是原始序列HβD-3表达量的约12倍之多。对融合表达产物进行 “ITC法”纯化蛋白，纯化后的HβD-3i具有与天然HβD-3相似的生物学活性，对金黄色葡萄球菌的活性强于伤寒沙门菌。表明利用pET-EI原核表达系统表达HβD-3是可行的，且因该纯化方法经济简便，为实现HβD-3大规模生产奠定基础。
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  产肠毒性大肠杆菌DPO-PCR检测方法的建立与应用

  徐义刚, 李丹丹, 刘忠梅, 崔丽春, 李苏龙

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 75-80.

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  双启动寡核苷酸引物（dual-priming oligonucleotide，DPO）是一种新型的引物设计方法，具有设计简易、特异性强以及退火温度范围宽的特点。以产肠毒性大肠杆菌LT基因为靶基因，设计了一对DPO引物，经过对Taq DNA 聚合酶、Mg²⁺、dNTP反应体系因子的优化，建立了产肠毒性大肠杆菌DPO-PCR检测方法，测定了该方法的灵敏度、特异性以及退火温度不敏感性。结果显示，该方法检测灵敏度为1.24×10²CFU/ml，在45℃~65℃退火温度范围内，均可实现靶基因的高效扩增。该方法特异性强，测试菌株中4株产肠毒性大肠杆菌均为阳性结果，其余菌株为阴性结果，且无非特异性扩增发生。与常规PCR方法相比，DPO-PCR方法不需要对引物参数特别是退火温度反复优化，同时DPO引物的特殊结构又增强了检测特异性，为致病性微生物的快速准确检测提供了新方法。
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  酸胁迫在提升富硒/GSH产朊假丝酵母性能中的作用

  王大慧, 许宏庆, 汪成富, 卫功元

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 81-85.

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  为了提高富硒产朊假丝酵母胞内有机硒和谷胱甘肽（GSH）的含量，考察了不同pH环境对富硒过程中的酵母细胞生长、GSH合成以及有机硒转化的影响。结果发现弱酸胁迫有利于富硒/GSH产朊假丝酵母性能的提升，其中pH 3.5时最大胞内有机硒和GSH含量分别为1.13 mg/g和12.3 mg/g。通过对酵母胞外蛋氨酸浓度、胞内pH值以及NADH/NAD⁺、ATP/ADP比率进行分析，部分解释了弱酸胁迫提升富硒/GSH产朊假丝酵母性能的原因。为进一步提高产朊假丝酵母的营养功能提供了可行的思路。
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  酸碱处理纯化玉米秸秆纤维素及还原糖酶解实验研究

  武崇辉, 寇巍, 邵丽杰, 张欢, 曹焱鑫, 张大雷

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 86-91.

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  为提高玉米秸秆酶解还原糖产率，采用稀酸和稀碱对玉米秸秆进行预处理。通过分析发现，处理后秸秆中纤维素含量由原来的39.15%增加到91.34%，半纤维素和木质素大部分被除去，而纤维素质量损失仅为2.01%；X射线衍射分析发现处理后秸秆纤维素结晶度升高了124.13%；红外光谱分析表明，经酸碱处理后秸秆中大部分半纤维素和木质素结构被破坏；扫描电镜观察发现，处理后纤维束表面缝隙和孔洞明显增多；进一步纤维素酶解实验发现，未处理秸秆酶解还原糖产率仅为13.66%，酸碱处理后秸秆酶解还原糖产率可达65.17%，较处理前提高了377.09%，且酶解时间缩短了24h左右。结果表明，稀酸稀碱预处理可以明显提高玉米秸秆纤维素的转化利用效率。
综述
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  利用大肠杆菌生产N-糖蛋白和糖蛋白疫苗的研究进展

  马中瑞, 韩东雷, 赵骏菲, 陈梦琳, 陈敏

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 92-98.

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  近年来，随着对空肠弯曲杆菌蛋白N-糖基化修饰系统的研究不断深入，通过关键酶PglB和外源载体蛋白的导入等，此系统在大肠杆菌中的重建成功完成。目前，已能初步利用大肠杆菌生产多种N-糖蛋白。此技术为糖蛋白疫苗的生产开辟了新的途径。此外，通过关键酶表达量的提高和糖基化位点和序列的选择等措施，大肠杆菌蛋白N-糖基化系统的糖基化效率有了进一步提高，同时改善N-糖蛋白的免疫效果的研究亦取得较大进展。这些都为大规模生产糖蛋白疫苗提供了保障。
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  蛋白片段互补分析技术研究进展

  黄欣媛, 范红波, 邹礼平

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 99-105.

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  基于报告蛋白功能重建的蛋白片段互补分析（protein fragment complementation assay，PCA）技术是研究体内蛋白质相互作用重要方法，可检测和分析蛋白相互作用及其时空变化和调节因素。目前已开发出多种不同报告蛋白的PCA系统，具有灵敏度高、信噪比高、可定量和高通量化、适用范围广等特点。主要对PCA的原理、不同类型及其应用领域等方面进行阐述，并展望其发展前景。
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  富含二硫键多肽毒素的表达与纯化

  张科军, 李力, 戴秋云

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 106-111.

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  富含二硫键的多肽毒素一般分子量小，二硫键密集，体外折叠效率较低，多于40个氨基酸的序列较难用化学合成方法得到目标产物。简要综述富含二硫键的多肽毒素（如芋螺毒素、蝎毒和蜘蛛毒素等）基因工程表达研究进展，着重阐述其在大肠杆菌、酵母表达体系中表达及纯化技术特点。
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  渔用菌蜕疫苗的研究进展

  姜娜, 邢薇, 马志宏, 李铁梁, 罗琳

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 112-117.

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  菌蜕是革兰氏阴性菌被噬菌体PhiX174的裂解基因E裂解后形成的完整细菌空壳，以此菌蜕制备的疫苗为菌蜕疫苗，在最近几年刚开始用于鱼类细菌疫苗研究。由于菌蜕疫苗不仅具有很高的生物安全性，能诱导机体产生体液免疫和细胞免疫，而且能够在鱼类采用口服免疫的方式，因此在鱼类疫苗中有着得天独厚的优势。目前，菌蜕作为重组疫苗或药物递送体系也开始受到关注。文中综述了渔用菌蜕疫苗的国内外研究最新进展，探讨了采用不同策略免疫所产生免疫反应和保护性作用的强弱。
专稿
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  2013年诺贝尔生理学和医学奖——囊泡运输分子机制的阐明

  俞立, 陈晔光

  中国生物工程杂志. 2013, 33(11): 118-120.

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