中国生物工程杂志

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林颖, 李璞, 单敬轩, 陈晓静, 施慧莉, 霍克克

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 1-8.

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RIO3为非典型激酶RIO家族的成员之一,仅在多细胞真核生物中出现,为研究RIOK3蛋白的功能,以其作为诱饵蛋白对成人肝cDNA文库进行酵母双杂交筛选,得到其相互作用蛋白PAK2,并通过细胞内免疫共沉淀和免疫荧光共定位实验验证了该相互作用。实时定量PCR和免疫印迹检测结果显示,RIOK3能够在蛋白水平上降低PAK2表达量。通过CCK-8和细胞凋亡检测,发现二者共表达可以抑制增殖并促进凋亡,并且这一促凋亡效应可以被caspase-10的无酶活最短剪切本caspase-10G所抑制。实验结果显示,RIOK3可能促进了caspase-10对PAK2的酶解,在PAK2的酶解激活途径中发挥重要作用。

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重组人载脂蛋白C-I在毕赤酵母中的分泌表达及鉴定

苏曼曼, 陈月, 王丁丁, 许天敏, 颜炜群

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 9-13.

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目的:在毕赤酵母中高效分泌表达与天然人载脂蛋白C-I具有相同结构和活性的重组人载脂蛋白C-I(rhApoC-I)。方法:RT-PCR法自人肝组织调取编码人ApoC-I的cDNA,构建真核分泌型表达载体pPICZα/hApoC-I。重组质粒线性化后转化毕赤酵母感受态细胞,甲醇诱导表达,建立rhApoC-I的毕赤酵母表达体系。对rhApoC-I进行Western blot分析和体外活性研究。结果:经PCR法克隆的hApoC-I cDNA序列与GenBank登录序列一致。SDS-PAGE和Western blot分析均在分子量约6.6kDa出现特异性条带,2L发酵条件下表达量达到80mg/L。结论:首次在毕赤酵母菌中高效分泌表达rhApoC-I,并确定其具有抑制血小板衍生生长因子诱导的平滑肌细胞增殖的抑制作用,为进一步研究其结构与功能提供物质基础。

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PES1与雌激素受体存在相互作用

李杰萍, 庄庆仁, 兰小鹏, 曾国彬, 罗小锋

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 14-18.

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雌激素(E₂)和雌激素受体(ER)在E₂诱发的肿瘤中起着极其重要的作用。ER共调节因子通过与ER相互作用调节其生物学功能。PES1主要表达于E₂的重要靶器官如乳腺、卵巢等组织中,并在乳腺癌细胞中高表达。用PCR技术构建HA标签的PES1全长以及1~322aa、312~588aa和414~588aa三个不同功能区片段的重组质粒。将不同的重组质粒与FLAG-ERα和或FLAGC-ERβ共转染293T细胞后进行免疫共沉淀,以验证PES1与ER是否有相互作用以及相互作用的区域。用含雌激素受体作用元件的荧光素酶报告基因(ERE-LUC)检测PES1对ERα和ERβ转录激活活性的影响。结果表明,PES1与ERα和ERβ均相互作用,且PES1的1~322aa区域与ERα和ERβ相结合。PES1能特异地、E₂非依赖性抑制ERβ的转录激活活性。实验结果显示,PES1是一个新的ER共调节因子,需要进一步研究其在ERβ信号通路及其在E₂诱发的肿瘤的作用。

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鼠源原蛋白转化酶2基因的构建及其表达

吴爽, 周东, 张娟辉, 唐松山

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 19-23.

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目的:蛋白转化酶PC2在神经内分泌肽的成熟过程中起到了非常重要的作用,为了研究鼠肿瘤膜型中pc2基因对乳腺癌生长转移的影响,重组并构建了鼠源pc2基因。方法:提取大鼠脑垂体总RNA,通过RT-PCR方法克隆并扩增了鼠源pc2的cDNA。将pc2基因的cDNA插入pCDNA3.1/Zeo载体构建成pCDNA3.1-pc2重组载体。通过pCDNA3.1-pc2或和它的分子伴侣基因7b2的共表达,pc2基因成功地在乳腺癌4T1细胞株中表达和活化。结论:通过测序、转染、Western blot分析和活性测定等证实pc2被插入载体并在哺乳动物细胞中成功表达。

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福氏志贺菌硫氧还过氧化物酶的表达、纯化、活性检测及晶体生长的初步研究

冯舵, 张阔, 李倩倩, 韩翠晓, 高伟

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 24-29.

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Sf2523蛋白属于硫氧还蛋白过氧化物酶(Prx)家族,在有氧代谢过程中消除活性氧,起到保护生命大分子的重要作用。通过构建原核表达体系,可溶性表达并纯化了Sf2523酶蛋白,并对蛋白进行了过氧化物酶活性检测,证明其依然具有天然活性,酶的核心结构并未发生变化。由分子排阻色谱结果发现,酶蛋白体内和体外聚集状态不同,离体蛋白聚集状态不稳定,趋于二体化。将纯化的单体蛋白即时进行了结晶实验,初筛长出了针状晶体。通过进一步切除标签蛋白进行优化处理,最终得到了均匀的三维单晶。

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金发草LEA 3 基因两个剪接体转化酿酒酵母的抗非生物胁迫功能分析

李锐, 王文国, 范林洪, 王胜华

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 30-35.

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对金发草(Pogonatherum paniceum)第3组LEA蛋白( PpLEA3 )基因两个剪接体进行分析,并利用酿酒酵母表达系统分析两个剪接体在不同非生物胁迫的响应差异。以 PpLEA3 基因两个剪接体( PpLEA3.a 和PpLEA3.b )的重组载体pMD19-T- PpLEA3.a 和pMD19-T- PpLEA3.b 为模板,PCR法构建酵母表达载体pYES2- PpLEA3.a 和pYES2- PpLEA3.b ,并转化酿酒酵母细胞得到重组菌INV- PpLEA3.a 和INV- PpLEA3.b 。通过比较重组菌和对照菌(转空载体pYES2)在NaCl、NaHCO₃、低温、干旱、UV胁迫下的恢复生长状况,结果表明两种重组菌胁迫后的生长情况明显好于对照菌,两个剪接体对非生物胁迫抵抗力的大小为: PpLEA3.a > PpLEA3.b 。两个剪接体在核酸序列上的差异导致了在蛋白亲水性和结构上的差异,最终导致了在抗逆能力方面的差异。

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农杆菌侵染玉米芽尖导入psy基因的研究

汪婷婷, 季静, 王罡, 关春峰, 张烈, 金超

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 36-40.

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以玉米自交系天塔五母、7922的芽尖为受体,用农杆菌介导法将psy基因转入玉米中。以植株的转化率为指标,研究了真空处理方式,真空处理时间及共培养时间对转化率的影响。结果表明,当在真空条件下侵染20min,共培养3天时转化率最高。用200mg/L的草胺膦溶液筛选,获得抗性植株经PCR检测有16株表现阳性,其中天塔五母有12株,7922有4株。RT-PCR及高效液相色谱(HPLC)检测结果表明psy基因已经整合进玉米基因组并能正常转录,转基因玉米中总类胡萝卜素含量比野生型玉米提高了25%。

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芪合酶基因Fm-STS在何首乌毛状根中的过量表达及dsRNA干扰

朱宽鹏, 赵树进

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 41-48.

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目的:建立一套探究植物基因功能的方法体系,验证由芪合酶基因保守序列通过RACE扩增技术在何首乌中得到的基因Fm-STS的功能。方法:由含CaMV 35S启动子驱动的gfp基因的植物转基因表达基础质粒pBIN-35S-GFP构建过表达质粒pBIN-35S-STS-GFP(阳性)和双链RNA干扰重组质粒pBIN-35S-正向-反向-GFP(阴性),并同空白表达质粒pBIN-35S-GFP(空白)均导入野生型发根农杆菌ATCC15834中,转化何首乌外植体,诱导生成毛状根并培养,对毛状根进行高效液相色谱分析以及实时荧光定量检测。结果:在过表达组、空白组和干扰组中毛状根中发根农杆菌Ri质粒中的rolB基因和外源基因gfp均有表达,高效液相色谱法分析芪合物二苯乙烯苷含量依次为4.67mg/g、2.18mg/g和0.65mg/g,在mRNA水平上测试荧光定量检测基因Fm-STS表达量:RNAi组是空白组的1/433.53,过表达组是空白组的2.41倍。结论:结果表明过量表达与双链RNA干扰相结合在植物基因功能研究中有良好的应用,何首乌中芪合酶Fm-STS是二苯乙烯苷主要的合成酶。

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芽孢杆菌β-折叠桶植酸酶的原核可溶性表达优化及包涵体复性研究

李倩倩, 李中媛, 冯舵, 黄火清, 韩翠晓, 杨培龙, 姚斌, 高伟

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 49-55.

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目的:来源于芽孢杆菌的β-折叠桶植酸酶基因PhyH,截去N端120个碱基编码的40个氨基酸后,成功构建了原核表达体系,通过两种方法分别得到有活性的目的蛋白PhyHT,并通过进一步纯化提高目的蛋白的纯度。方法:通过分子伴侣共表达系统提高目的蛋白的可溶性表达,并通过包涵体复性研究,从包涵体中制备出有活性的目的蛋白。结果:(1)目的蛋白PhyHT主要以包涵体形式存在于沉淀中;(2)通过优化表达条件,降低温度和诱导剂浓度均不能明显改善包涵体问题,通过构建分子伴侣共表达系统(即pG-KJE8、pGro7、pKJE7和 pTf16 4种分子伴侣质粒分别与重组表达质粒pET28b-PhyHT共表达),筛选能提高目的蛋白可溶性表达的分子伴侣质粒;(3)包涵体经过复性和进一步的纯化,得到了高纯度的有生物活性的目的蛋白。

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甲基营养菌 Methylobacterium sp MB200 中crtI基因的克隆及表达

林琼珊, 唐咸来, 李献, 蒋承建, 李俊芳, 申佩弘

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 56-61.

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八氢番茄红素脱氢酶(CrtI)催化八氢番茄红素经过4次脱氢合成番茄红素,或者经过3次脱氢合成链孢红素,在类胡萝卜素的生物合成中发挥重要的作用。以甲基营养菌Methylobacterium sp MB200为原始菌株,首先采用转座子突变技术构建部分突变体库共11552株,筛选得到33株颜色发生变化的目的突变体,随后利用分子克隆技术从目的突变体中获得crtI基因的完整ORF,长为1539 bp,编码512个氨基酸。与来自M. populi BJ001、M. chloromethanicum CM4和M. extorquens AM1的crtI一致性均为93%。将crtI与载体pCM80连接得到重组质粒pCM80-crtI,导入原始菌株中得到重组菌MB200/pCM80-crtI。测定原始菌株与重组菌株的CrtI酶活,结果发现,重组菌株CrtI的酶活与原始菌株相比约提高了40%。实验结果为完善甲基营养菌中类胡萝卜素的生物合成代谢途径提供了理论参考。

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无标签重组人硫氧还蛋白的大规模表达、纯化及活性检测

郭云萍, 孙璐, 张立剑, 王增禄, 高超, 杨强, 刘毅, 张英起, 屈延, 陶凌

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 62-67.

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目的:利用基因工程的方法原核表达无标签的重组人硫氧还蛋白(rhTrx)并对其进行大规模表达、纯化和鉴定。方法:从人胚胎肾HEK293细胞中提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,经两步离子交换层析纯化重组蛋白,采用SDS-PAGE、Western blotting、HPLC、MALDI-TOF-MS及经典的胰岛素二硫键还原法对重组蛋白进行鉴定。结果:构建成功了rhTrx基因表达载体;实现了rhTrx在原核细胞中的可溶性表达;纯化出的蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析证实为rhTrx;HPLC和MALDI-TOF-MS分析表明,纯化出的目的蛋白纯度大于95%;胰岛素二硫键还原法证实纯化出的 rhTrx具有生物学活性。结论:成功构建了rhTrx的原核表达体系,建立了rhTrx的纯化和鉴定方法,为其进一步的理论研究和生产开发提供了有效基础数据。

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慢病毒载体介导的绿色荧光蛋白转基因标记法研究猪嵌合体制作

石永乾, 何文腾, 周洋, 焦明霞, 解炳腾, 胡魁, 孔庆然, 刘忠华

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 68-74.

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目的:通过建立慢病毒载体感染猪胚胎体系实现胚胎标记,进而研究不同发育阶段猪孤雌胚胎之间的嵌合能力,为进一步研究猪早期胚胎发育以及细胞分化奠定基础。方法:首先,通过显微注射的方法把2×10⁹I.U./ml、2×10⁸I.U./ml和2×10⁷I.U./ml三个梯度的表达绿色荧光的慢病毒载体分别注射到猪1-细胞胚胎和2-细胞胚胎的透明带下,进行胚胎的GFP转基因标记,在荧光显微镜下观察比较卵裂率、阳性胚胎率、囊胚率、阳性囊胚率和囊胚细胞数。然后,采用凹窝聚合法对同步发育胚胎在不同阶段(2-细胞,4-细胞,8-细胞)进行嵌合,2-细胞胚胎与不同发育阶段(2-细胞、4-细胞、8-细胞)胚胎进行嵌合以及2-细胞胚胎卵裂球互换制作嵌合体胚胎,发育到囊胚时在荧光显微镜下检测胚胎的嵌合状态。结果:2×10⁹I.U./ml的慢病毒感染猪2-细胞胚胎组中,体外受精和孤雌胚胎感染阳性率(80.00%、76.36%)和阳性囊胚率(90.74%、89.56%)都显著高于其它滴度组(P<0.05),另外,慢病毒感染的两种胚胎与对照组对卵裂率、囊胚率和囊胚细胞数三个指标没有显著影响(P>0.05)。2-细胞胚胎之间嵌合囊胚率和2-细胞卵裂球互换嵌合囊胚率(53.85%、62.50%)显著高于2-细胞胚胎与4-细胞胚胎的嵌合率(18.60%,P<0.05),在同步发育胚胎中8-细胞胚胎之间的嵌合率(75.00%)高于4-细胞胚胎之间和2-细胞胚胎之间的嵌合率(65.00%、53.80%)。结论:2×10⁹I.U./ml的慢病毒感染2-细胞期胚胎效率最高,另外,慢病毒感染对猪胚胎发育没有明显影响。8-细胞间的嵌合率比较高;发育同步胚胎间的嵌合率高于发育非同步胚胎间的嵌合率。

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耐底物腈水合酶融合子的产酶条件优化

张丽铃, 王筱兰

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 75-80.

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采用正交设计法对耐底物腈水合酶融合子的发酵条件进行优化,以发酵液起始pH,发酵周期,接种量,装料系数作为考察因素,最终确定最佳发酵条件为:起始pH8.0、发酵周期54h、接种量12%、装液系数12%。在此优化条件下融合子腈水合酶的活力达到1100万U/ml, 较优化前提高了83.3%。通过响应面法对发酵培养基配方进行优化研究,采用Plackett-Burman 法对8 个因素进行了筛选, 结果表明, 葡萄糖、尿素、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾是影响发酵液腈水合酶产量的主效应因子。用最陡爬坡试验及Central composite design 设计进一步优化, 利用Design-Expert 软件进行二次回归分析, 得到各因素的最佳浓度为: 葡萄糖22.62g/L、尿素9.76g/L、K₂HPO₄ 1.22g/L、KH₂PO₄ 1.268g/L。在此培养基优化配方下融合子腈水合酶的活力达到1280万U/ml, 较原配方的酶活提高了16.4%。

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精原干细胞移植及受体制备技术研究进展

王琛, 朱化彬, 刘玲, 郝海生, 赵学明, 冯荣, 杜卫华, 秦彤, 刘岩, 黎宗强, 王栋

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 81-86.

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精原干细胞移植为研究精子发生、雄性生殖能力及新型转基因技术奠定了基础。尽管已利用小鼠建立了较成熟的移植技术体系,白消安受体制备法和曲细精管及睾丸网移植法已得到广泛应用,但白消安可导致动物较高的死亡率,局部射线照射和无内源性精子发生受体动物的制备费用较昂贵,热处理受体制备法应用范围较窄且效果不稳定;三种移植方法均对操作有较高的技术要求,曲细精管、睾丸输出管移植需要显微注射装置,而睾丸网移植需要超声仪的辅助。而且,移植效果在不同实验间、物种间差异较大,移植效率有待提高,对移植排斥反应的认识也有待进一步深入。对睾丸结构和精原干细胞生物学特性的深入研究,将有助于建立更简单高效的受体制备和移植的方法。

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动物源溶菌酶研究进展

张鹏, 江明锋, 王永

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 87-93.

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动物源溶菌酶是一种动物体内广泛存在的酶类,它可以水解细菌细胞壁肽聚糖中的β-1,4糖苷键,具有消化分解细菌、抑制外源微生物生长、增强机体免疫力的作用。目前溶菌酶已被用作研究蛋白功能、性质以及分子进化的模型。首先介绍了溶菌酶及其分子的晶体结构,溶菌酶基因及其蛋白研究进展,其次介绍了动物源溶菌酶的功能,包括溶菌酶生物学功能和重组蛋白功能活性,重点介绍了溶菌酶基因在转基因工程中的应用研究,最后对动物源溶菌酶研究进行了展望。研究动物源溶菌酶对于基础科学,并应用其转变成现实生产力具有重要的指导意义。

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植物花青素苷生物合成及调控的研究进展

高燕会, 黄春红, 朱玉球, 童再康

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 94-99.

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花青素苷(anthocyanin)是植物新陈代谢过程中产生的类黄酮物质,决定被子植物花、果实、种皮、茎、叶和根等的颜色,具有重要的营养价值和药理作用。近年来关于花青素生物合成途径的研究已取得突破,综述了植物花青素苷基因研究现状和发展趋势,包括植物花青素生物合成途径、参与生物合成途径中相关的结构基因和调控基因及功能研究以及影响花青素苷生物合成的环境因素等的研究进展。

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荧光假单胞菌抗生性代谢产物合成相关基因的研究现状

杨毅, 李治, 高玲霞, 孙燕

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 100-106.

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荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)是一种重要的植物根际促生菌,它能够产生藤黄绿脓菌素、2,4-二乙酰基藤黄酚、硝吡咯菌素、吩嗪-1-羧酸等抗生性次级代谢产物,可抑制多种病原物,在农作物土传病害的生物防治研究中具有重要意义。总结了荧光假单胞菌中已确立的抗生性次级代谢产物的合成机制,重点阐述了相关基因的结构、功能,以及利用生物工程技术对荧光假单胞菌进行遗传操作的最新进展,同时对荧光假单胞菌在生物防治中的应用和其作为生防菌剂的前景进行了展望。

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表面展示工程在酒精发酵方面的应用

李小冬, 杨娜, 万永虎, 吴嘉, 贾东晨, 乔敏

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 107-110.

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目前,表面展示工程作为一种新型的极具应用潜力的技术手段,在组合文库的筛选、蛋白质工程、燃料乙醇的生产和生物修复等技术中已经扮演了极其重要的角色。介绍了表面展示工程在酒精发酵方面的应用,重点阐述酒精发酵过程中酶类展示原理和全细胞催化的应用前景。

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微生物分子生态学研究方法的新进展

吕昌勇, 陈朝银, 葛锋, 刘迪秋, 孔祥君

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 111-118.

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环境中微生物的群落结构及多样性和微生物的功能及代谢机理是微生物生态学的研究热点,长期以来,由于受到研究技术的限制,对微生物的群落结构和多样性的认识还不全面,微生物的功能及代谢机理方面了解也很少。随着高通量测序、基因芯片等新技术的不断更新,微生物分子生态学的研究方法和研究途径也在不断变化。高通量测序技术改变了微生物多样性、宏基因组学和宏转录组学的研究方法, GeoChip高密度覆盖海量已知功能的基因探针于单张芯片,能快速确定微生物和已知功能基因的存在与否。总结和比较了目前最新的研究手段,并归纳了这些方法的适用性和优缺点。

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欧盟Biocircle项目策略分析及对中国国际合作项目的启示

张大璐

中国生物工程杂志. 2012, 32(08): 119-122.

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欧盟第七框架计划是当今世界上最大的官方重大科技合作计划,其研究以国际前沿和竞争性科技难点为主要内容,具有研究水平高、涉及领域广、投资力度大、参与国家多等特点。Biocircle项目是隶属于欧盟第七框架计划,参与国家24个,是一项国家联络点建设项目。通过介绍欧盟Biocircle国际合作项目,分析了欧盟国际合作项目的优势,并指出中国国际合作计划要更加主动更加开放,以期为中国的生物技术产业乃至于科技领域带来更多更好的促进机会。

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刊出日期：2012-08-25

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