2006年, 第26卷, 第11期　
刊出日期：2006-11-25

  

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研究报告
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  杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5′上游序列的克隆与功能分析

  李杰,贾岩龙,闫红霞,潘卫东,薛乐勋

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 1-7.

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  目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶（NR）基因5′上游序列序列,并对其功能进行分析。方法: 利用BamHI、EcoRI、HindIII、PstI、SalI、Xbal 6种限制性内切酶分别酶切盐藻基因组DNA，并与接头连接，构建成盐藻基因组步行文库。采用 LA-PCR方法，从上述盐藻步行基因组文库中扩增NR基因5′上游序列序列，测序并进行分析。为检测其表达特性,构建了该片段与GUS 嵌合基因的表达载体pNR-GUS, 通过电击法将所构建的重组表达载体转化盐藻，组织化学染色法观察GUS的表达。结果: 从盐藻基因组步行文库中扩增出约1200bp特异片段，序列分析表明5′上游序列含有启动子的特征性序列。GUS瞬时表达染色结果显示,该DNA 片段具有硝酸盐诱导和铵抑制的启动子活性。结论：所克隆的盐藻的5′上游序列可能是一种具有"开关"活性的可控性启动子。
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  非洲猪瘟病毒VP73基因克隆及在大肠杆菌中的高效表达

  常华,花群义,段纲,杨云庆,周晓黎,董俊,尹尚莲,项勋,曾昭文

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 8-13.

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  参照Genebank中非洲猪瘟VP73基因序列，人工合成的VP73全基因克隆至pMD 18-T克隆载体质粒中，采用PCR扩增得到1188 bp的VP73基因；将VP73基因片段亚克隆插入pBAD/Thio表达载体，经测序鉴定，筛选获得VP73基因正向插入、有正确读码框的阳性克隆，成功构建了非洲猪瘟病毒VP73基因重组表达载体。经L-Arabinose诱导表达，可稳定、高效地表达VP73蛋白抗原。SDS-PAGE结果表明，以终浓度为0.002 %的L-Arabinose进行诱导，4 h后表达量最高，表达蛋白为融合蛋白，分子量约60 kDa，表达产量约占菌体总蛋白的30％。Western blotting和ELISA检测表明，表达的融合蛋白能与非洲猪瘟阳性血清发生特异性反应，说明表达获得的产物为非洲猪瘟病毒VP73融合蛋白，且具有良好的反应原性，这为应用该表达蛋白抗原制备ASFV免疫血清学诊断试剂和疫苗研究奠定了基础。
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  透明颤菌血红蛋白的DNA改组研究

  袁宁,胡又佳,朱春宝,朱宝泉

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 14-19.

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  为提高透明颤菌血红蛋白在限氧条件下促进宿主细胞生长的能力，首先通过易错PCR向透明颤菌血红蛋白基因中引入突变，再结合DNA改组对其进行改造。将改组基因置于透明颤菌血红蛋白天然启动子下游，转化大肠杆菌DH5α，构建改组文库。以限氧培养条件下菌体沉淀的颜色为指标进行试管初筛，再以限氧和极端限氧条件下菌体湿重为指标进行摇瓶复筛，最终得到一个高活性突变蛋白VHb'042506。该蛋白使宿主的菌体湿重在限氧和极端限氧条件下较原基因转化子分别提高了31.25%和58.75%。经测序和比对，该基因与原基因相比发生了11处碱基点突变，致氨基酸4处错义突变。CO差光谱实验显示该蛋白具有更强的特征吸收。
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  人HMGB1分子的克隆、重组蛋白表达与生物学活性

  刘洪波,范学工,Haichao,Wang,彭建萍,黄建军,李宁

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 20-23.

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  采用RT-PCR,从重症肝炎病人外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells PBMCs）的mRNA中扩增高迁移率族蛋白1（high mobility group box－1 protein，HMGB1）基因，构建重组表达质粒pGEX4T-1-HMGB1，转化入大肠杆菌，测序证实其序列与基因数据库中HMGB1基因(NM_002128)一致。诱导表达的融合蛋白GST-HMGB1，用Glutathione Sepharose 4B亲和层析纯化，经Thrombin酶切得到HMGB1。结果显示：经Western-blotting检测，GST-HMGB1 和HMGB1均具有免疫活性； ELISA和MTT检测发现，两者均能刺激RAW264.7细胞产生大量TNF-α，明显刺激HeLa细胞增殖。GST-HMGB1具有良好的生物学活性,为今后的研究打下了基础。
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  3-甾酮-1-脱氢酶基因的表达及甾体转化分析

  李玉,路福平,孙同毅,刘逸寒,杜连祥

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 24-28.

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  本文利用带有P43启动子的表达分泌载体pWB980，实现了简单节杆菌3-甾酮-1-脱氢酶在枯草芽孢杆菌中的表达，表达出的目的蛋白的分子量为55KDa。利用分光光度法检测得到胞内和胞外可溶性部分的酶活分别为110±0.5mU和15±0.6mU每毫克蛋白, 比出发菌株简单节杆菌提高了将近30倍。重组芽孢杆菌对甾体底物4-AD的转化率为45.3％，比出发菌株简单节杆菌提高了近10倍。利用枯草芽孢杆菌对甾体底物进行脱氢为甾体药物的生产开辟了一个新的途径。
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  心肌特异性高表达热休克蛋白27转基因鼠建立

  刘莉,张小进,姜苏蓉,程蕴琳

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 29-32.

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  目的 建立人热休克蛋白27（heat shock protein 27, Hsp27）基因在小鼠心肌特异性表达的转基因鼠模型。 方法 将人心肌Hsp27cDNA插入含有心肌特异性表达启动子αMHC的pBSⅡ-SK+载体中，限制性内切酶EcoRI酶切、纯化后，获得含有αMHC启动子－Hsp27cDNA－HGH polyA的线性DNA片段，以显微注射法将目的基因导入受精卵, PCR筛选基因型，Western Blot鉴定转移基因的表达和表达的组织特异性。结果和结论 共获得两个转基因系小鼠，均呈心肌组织特异性高表达。
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  家蝇抗菌肽的抑菌动力学研究及其机理初探

  翟培,韩晋辉,侯丽霞,乐国伟,施用晖

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 33-39.

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  利用鼠伤寒沙门氏菌针刺诱导家蝇幼虫表达抗菌肽，对抗菌肽的抑菌动力学进行研究，并通过抗菌肽样品对不同细菌动力学特性的研究出发对抗菌肽抑菌作用机制进行探讨。研究发现抗菌肽样品的活性与作用时间有关，24h内出现一到两个活性峰，同一抗菌肽样品对不同细菌的抑菌动力学有差异，抗菌肽的抑菌动力学机制应该与它的的抑菌作用机制有关。通过电镜观测、细胞磷代谢、紫外吸收物测定以及抗菌肽与细菌DNA相互作用结果可知，微生物诱导家蝇表达的抗菌肽样品不仅能够造成细菌细胞的快速坍塌破裂而且能够破坏细胞核心，与DNA结合作用。抗菌肽抑菌动力学的解释：微生物诱导产物中含有两类抗菌肽，一类抗菌肽能造成细胞膜的快速坍塌破裂形成第一个活性峰；另一类抗菌肽可进入细胞，破坏细胞核心，造成紫外吸收物大量外泄形成第二个活性峰。
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  蒙古绵羊原始生殖细胞用于胚胎干细胞培养的研究

  图雅,曹贵方

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 40-44.

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  原始生殖细胞是用做分离和克隆胚胎干细胞的一种新的细胞资源。本研究将30-45日龄的蒙古绵羊胚胎生殖嵴及其临近组织用机械剪碎和胰蛋白酶+EDTA消化处理，添加DMEM（低糖）+10%FBS（犊牛血清）、38.0℃、5%CO2和饱和湿度条件下进行培养。其结果：未加任何细胞生长因子的情况下与其胎儿成纤维细胞共培养的方式也能分离得到类胚胎干细胞集落。这些集落细胞经多次克隆传代具有胚胎干细胞的诸多特征，如：具有连续传代的能力，细胞集落有典型鸟巢状结构，AKP染色呈阳性，核型分析结果染色体正常等。这些表明该细胞具有多能性，是绵羊类ES细胞。
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  一种小肽的多顺反子串联表达方法

  杨利军,杨涛,程牛亮,解军,张悦红,牛勃

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 45-47.

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  目的：构建蛇毒锯鳞蝰素(Echistatin，简写为Ecs) 多顺反子串联多拷贝基因。方法：以pMD18T-Ecs为模板，利用三对引物分别扩增Ecs基因，每个Ecs基因都有独立的起始和终止密码子，然后通过三个Ecs基因之间合适的酶切位点使之串联，再与表达载体pET30a连接后得到三拷贝重组质粒，在三个Ecs基因之间分别有SD序列和SD间隔序列。将质粒转化E.coli BL21(DE3)后IPTG诱导表达，18% SDS-PAGE和Western blot鉴定结果。结果：Ecs的表达量占全菌总蛋白的18%，实现了Ecs的串联表达。结论：Ecs多顺反子的串联表达为小分子蛋白的体外制备提供了一种全新的思路和方法。
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  γ-谷氨酰基转肽酶（GGT）基因工程菌的构建及其发酵条件的初步研究

  王娜,张洁,沈微,唐雪明,诸葛健

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 48-53.

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  利用PCR技术以Bacillus subtilis SYU 20016基因组DNA为模板，扩增出1.8kb编码γ-谷氨酰基转肽酶的基因ggt，将其连接到温控表达载体pBV220，得到重组载体pBV220-ggt，重组载体在大肠杆菌JM109中得到表达。SDS-PAGE分析显示融合表达产物的分子量大小为65kD，同核酸序列测定所推导的值相符。对含有ggt的基因工程菌进行表达研究表明：发酵的培养温度为30℃，pH为7.2，装液量为20mL(在250mL的锥形瓶中)的条件下42℃诱导4h后，重组菌的γ-谷氨酰基转肽酶酶活力达到6U/mL，目前报道的非基因工程菌（枯草芽孢杆菌NX-2）酶活力最高仅为3.2U/mL。
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  氮源对L-苏氨酸发酵的影响

  冯志彬,王东阳,徐庆阳,温廷益,陈宁

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 54-58.

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  以L-苏氨酸生产菌TRFC为供试菌株，研究了氮源对L-苏氨酸发酵的产量和糖酸转化率的影响。首先通过摇瓶实验确定发酵的最佳无机氮源和有机氮源分别为硫酸铵和酵母粉，进一步利用10L罐补料分批发酵确定硫酸铵和酵母粉的最佳用量，继续优化培养条件，采用发酵中后期流加硫酸铵和糖氨混合补料等措施，L-苏氨酸产量得到进一步的提高。在最优发酵条件下，通过10L罐补料分批发酵36h，产酸可达118.9g/L，糖酸转化率为47.6%。
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  嗜热厌氧乙醇菌JW200转化条件的研究

  彭惠,傅百灵,毛忠贵

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 59-61.

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  摘要 嗜热厌氧乙醇菌遗传转化系统的缺少，制约了对该菌理论基础和应用领域的进一步研究。利用聚乙二醇（PEG6000）转化和电转化技术国际首次实现了嗜热厌氧乙醇菌JW200外源基因的导入。PEG转化效率很低，因此选择对电转化条件进行优化，转化效率从4±3.2个转化子/μg质粒DNA提高到50±7.4个转化子/μg质粒DNA。实验表明获得较高的转化效率的必要条件是在细胞密度为OD660 0.2时添加甘氨酸与蔗糖后继续培养2h以及细胞在电击前的收集与洗涤保持低温。本研究为利用基因工程手段改造嗜热厌氧乙醇菌和从分子水平研究胞内乙醇代谢途径奠定了基础。
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  生物传感器快速测定BOD系统的稳定性研究

  王建龙,陈劲松,张力生,魏国

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 62-65.

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  在前期研究工作的基础上，确定了生物传感器快速测定BOD的实验流程。研究了温度对检测结果的影响，初始BOD浓度与检测时间的关系，并探讨了检测结果的重现性及其线性范围。结果表明：恒温环境可以保持微生物活性的相对稳定，并保证了检测过程的相对稳定，检测结果的最大相对偏差7.7%，满足BOD快速测定的要求；溶液BOD浓度不同，所需的检测时间也不同，BOD浓度越高，所需时间越长。在曝气状态下，可以保证BOD浓度在200mg/l以下的样品在15min以内检测完毕。通过对线性范围的分析，该方法适宜的线性范围可达5－200mg/l。
综述
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  CD4+CD25+调节性T细胞、IL-2与免疫耐受

  曲艳燕,赵勇

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 66-69.

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  近年来，越来越多的研究表明CD4+CD25+调节性T细胞在免疫耐受的过程中起着非常重要的作用。IL-2作为一种T细胞生长因子调控着调节性T细胞诱导免疫耐受的过程。IL-2维持着中枢及外周的调节性T细胞的活性，但是对胸腺调节性T细胞的发育是非必要的。同时，IL-2信号影响着调节性T细胞的功能并维持着其的竞争适应性。因此，CD4+CD25+调节性T细胞通过与IL-2之间形成的免疫网络调控着免疫耐受的过程，从而影响着机体的免疫平衡。
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  慢病毒载体的设计及应用进展

  王淑艳,张愚

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 70-75.

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  慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体，由于其结构和功能的特点作为一种重要的基因转移工具被应用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域。目前，为进一步完善慢病毒载体的功能，研究者们从提高载体的生物安全性及增强外源基因的表达调控能力等方面对慢病毒载体进行了改建。本文对慢病毒载体的设计进展及应用进行了简要综述，展望了今后的研究前景。
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  TILLING在水稻育种中的应用前景

  闫双勇,李学军,苏京平,马忠友,孙林静

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 76-80.

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  TILLING(Targeting Induced Local Lesions in Genomes)是功能基因组研究中应用的一种反向遗传学技术。它能高通量低成本地在EMS诱变群体中鉴定出发生在特定基因上的点突变。在其基础上发展出的EcoTILLING技术则可发现种质资源中的SNP位点及小插入或缺失多态性位点。水稻是非常重要的粮食作物, 也是已经完成了全基因组序列测定，有丰富的生物信息学资源可以利用的基因组研究模式植物。水稻的分子标记辅助育种将在育种中扮演越来越重要的角色。在这样的背景下，本文从基于特定基因的种质资源鉴定、EMS诱变育种、及水稻功能标记开发等方面论述了其在水稻育种中的应用前景。
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  产番茄红素基因工程菌的研究进展

  李晔,袁其朋

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 81-86.

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  番茄红素是一种重要的类胡萝卜素，具有许多生物功能和生物活性，尤其在保护人类健康方面起着重要的作用。随着番茄红素生物合成途径的阐明及其相关基因的克隆，运用基因工程手段调控番茄红素的合成已经成为可能。本文首先综述了番茄红素生物合成途径及合成途径中相关基因的克隆，然后对近年来构建的番茄红素基因工程菌进行了全面的总结，包括：运用DNA重组技术使异源微生物大肠杆菌、酵母等生产番茄红素，以及通过过表达特定基因从而提高霉菌等产番茄红素的量，最后分析了改造过程中存在的主要问题，并展望了未来的研究方向。
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  生物柴油的研究进展

  沈珺珺,迟晓元,赵宗保,张卫,秦松

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 87-90.

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  摘要：生物柴油重要的新型可再生能源。本文阐述了生物柴油的主要特性及开发意义，对生物柴油的原料利用进行了分析，介绍了国内外生物柴油的研究进展，并展望了生物柴油的发展前景。
专利
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  中国基因专利的数据挖掘

  杨仑,夏振华,陈剑,毛颖,徐朗莱

  中国生物工程杂志. 2006, 26(11): 91-96.

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  对中国专利基因数据库（NASDAP, http://nasdap.generank.org/）进行了统计和数据挖掘，展示了中国基因专利的全貌；揭示了我国基因专利申请的热点和薄弱面；通过对专利基因生命周期聚类结果的分析，总结出围绕一个专利基因进行二次创新的策略以及我国对此类申请的授权态度。这些数据挖掘结果可为我国药物开发和疾病诊断等生命科学高技术领域知识产权战略制定提供重要参考。