中国生物工程杂志

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曹家兵,周宇波,祁佳,杨鸿蒙,王克生,韩泽广

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 0-0.

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采用生物信息学工具预测与实验相结合的方法得到了一个新的小鼠分泌蛋白基因mBolA1。该基因定位于染色体3F2，cDNA全长为730bp，编码137个氨基酸的蛋白，该蛋白含有一个保守的BolA结构域，等电点为9.05。用RT-PCR方法从鼠的混合cDNA库中克隆到mBolA1。Western blot实验表明mBolA1能从瞬转的COS7细胞中分泌到细胞培养液中。亚细胞定位显示mBolA1定位于细胞浆，且与高尔基体不共定位，提示它是个非经典分泌途径的分泌蛋白。RTPCR显示mBolA1在组织中广泛表达。它的具体功能有待进一步研究。

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来源于E.coli和CHO表达系统的重组人β-NGF性质比较

姜静,姜桂香

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 8-12.

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基于原核表达系统极难表达具有正确三级结构的重组人β神经生长因子（rhNGF-β），E. coli是否能作为其工业化生产菌株存在争议。为此，将构建于E.coli体系，经表达体外复性后的rhNGF-β与中国仓鼠卵巢细胞（CHO）表达体系分泌的rhNGF-β，运用HPLC、SDS-PAGE、质谱、N-末端分析等手段以及鸡胚背根神经节（DRG）、 PC12 细胞体外测活法对制备产物进行分析、测定。结果表明：二者具有一致的理化性质和生物学活性，HPLC纯度均大于95%、生物学比活均不低于1.8 ng/U；经添加赋型剂制成冻干粉后，在温度37℃±2℃、相对湿度75%±5%条件下进行3个月加速试验，活性均不变。说明E. coli表达体系可生产质量均一、高生物学活性的rhNGF-β，且具有明显成本优势。

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人白介素18(IL-18)RGD模体抗黑色素瘤细胞B16活性研究

卢忠民,赵宝昌

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 13-19.

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利用定点突变及DNA重组技术，在人白细胞介素18(IL-18)的cDNA序列中插入了GGC序列，使IL-18第39精氨酸残基和第40天冬氨酸残基之间插入一个甘氨酸残基，从而构建了RGD模体。此重组的cDNA序列构建入表达质粒pPIC9K，并转化Pichia Pastoris酵母GS115，利用表达系统进行了高效表达。用Sephadex G-100凝胶过滤纯化表达产物，获得初步纯化的蛋白。研究表明，IL-18在体外对黑色素瘤细胞株B16没有作用，而IL-18-RGD抑制作用明显，IC50 = 8.10μmol/L；应用小鼠动物模型研究结果显示，IL-18及IL-18-RGD均对黑色素瘤细胞B16有抑制作用，且IL-18-RGD比IL-18的作用强；同时,对鸡胚绒毛尿囊膜(chicken chorioallantoic membrane,CAM)血管生成的抑制实验发现，IL-18-RGD 对CAM血管生成的抑制作用也比IL-18强。但IL-18-RGD仍保存对PBMC诱导产生IFN-γ能力。结果提示，IL-18-RGD在具有抗炎，抗感染作用的同时增添了抑制肿瘤血管新的功能。

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无载体固定化培养模式下HEK293细胞的生长和代谢特征

刘兴茂,刘红,吴本传,叶玲玲,李世崇,倪小平,陈昭烈,黄培堂

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 20-24.

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利用HEK293细胞在悬浮培养体系中下具有聚集成团的体外培养特性，在250ml的spinner flask搅拌式细胞培养瓶中以悬浮细胞团的形式实施HEK293细胞的无载体固定化培养，以细胞密度、细胞活力、细胞团粒径分布和葡萄糖比消耗率 (qglc)、乳酸比产率 (qlac)、乳酸转化率 (Ylac/glc)、氨基酸消耗为观察指标，同时设置静止培养体系作为参照，考察无载体固定化培养模式下的HEK293细胞生长和代谢特征。观察结果表明，HEK293细胞在搅拌式细胞培养瓶中无载体固定化培养和在组织培养瓶中静止贴壁培养表现为基本相同的细胞生长和代谢特征，平均粒径小于300μm的细胞团中的物质传递能够满足HEK293细胞维持正常生长和代谢的基本需要。HEK293细胞的无载体固定化培养便于实施灌注操作、提高生物反应器单位体积的生产效率。

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人肝再生增强因子CXXC活性结构域的研究

潘艳,佟明华,孔祥平,鞠桂芝

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 25-28.

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人肝再生增强因子(human augmenter of liver regeneration, hALR)蛋白序列中有一段保守的Cys-Xaa-Xaa-Cys (CXXC)氨基酸序列，针对hALRp的CXXC结构，对hALR分别进行C65A和Q88C突变，表达、纯化突变体蛋白。体外检测hALRp和突变体的黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide, FAD)辅助的巯基氧化酶活性，hALR-FAD和hALRQ88C-FAD组与对照组比较有显著差异(P<0.05)，hALR-FAD和hALRQ88C-FAD组之间无差异；hALRC65A-FAD组与对照组比较无差异。结果显示，通过C65A突变将CXXC结构破坏后，该突变体的巯基氧化酶活性完全丧失；通过Q88C突变增加一个CXXC序列后，该突变体的巯基氧化酶活性较hALR-FAD未见明显增加；同时，FAD不仅是hALRp发挥巯基氧化酶活性必须的辅助因子，而且有助于hALRp突变体蛋白的复性。

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重组类胰岛素样生长因子-Ⅰ的纯化与复性

刘侃,汪炬,谢秋玲,李志英,洪岸

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 29-33.

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目的获得高纯度和高活性的胰岛素样生长因子（Insulin-like growth factor, IGF-1）;方法构建好的BL21大肠杆菌工程菌经IPTG诱导，以融合一段截短型半乳糖苷酶及His-tag形式表达IGF-1融合蛋白(约15,000Da)，超声破碎，提取包涵体经镍柱亲和层析后, 用羟氨切割纯化的融合蛋白，纯化后的蛋白质在小分子保护剂及GSH/GSSG的存在下复性。结果经Ni2＋柱亲和层析, IGF-1纯度达90％以上，复性后得到有较高生物活性的IGF-1。结论 IGF-1发酵及纯化和复性方法的建立为大量生产IGF-1打下了基础。

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LFA-1基因敲出鼠胶原诱导风湿性关节炎发病率及程度的降低

王轶楠,王世瑶,柳忠辉,崔雪玲,台桂香

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 34-37.

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淋巴细胞功能相关抗原（LFA-1）属于黏附分子家族，在细胞相互作用中发挥重要作用。通过观察LFA-1基因敲除小鼠的胶原诱导关节炎(CIA)发病率、放射线学及组织学变化，探讨LFA-1分子在CIA发病中的作用。实验采用100μg的二型胶原(CII)加弗氏完全佐剂充分混合，在LFA-1基因敲除小鼠及正常对照组小鼠尾根部皮内注射，21天后重复免疫一次，随后进行发病率、放射线学及组织学分析。研究结果显示，CII免疫后，正常对照组小鼠平均发病率为57%，临床可见明显的放射线及组织学的异常变化。而LFA-1基因敲除小鼠无发病，放射线及组织学检查亦无明显异常改变。上述结果提示LFA-1在胶原诱导的关节炎发病中起重要作用。

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EGFP基因在中国明对虾原代培养细胞中的导入和表达

张晓军,余黎明,李富花,相建海

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 38-43.

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本文以我国重要水产养殖动物中国明对虾（Fenneropenaeus chinensis）贴壁培养和悬浮培养的血细胞、植块培养的类淋巴器官（Oka器官）细胞和卵巢细胞为材料，通过磷酸钙共沉淀法、脂质体介导的转染（脂染）和电穿孔法等多种方法进行了导入EGFP基因的实验。结果表明，通过脂染可以成功地将质粒DNA导入悬浮培养的血细胞、植块培养的Oka器官细胞和卵巢细胞，并使报告基因EGFP得到表达。

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棉铃虫组织蛋白酶B酶原在毕赤酵母中的表达

董杜鹃,扈进冬,张新昌,李子劲,王金星,赵小凡

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 44-48.

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棉铃虫组织蛋白酶B（ Helicoverpa armigera Cathepsin B ，HCB）属于半胱氨酸蛋白酶类，参与胚胎发育中卵黄蛋白水解供给胚胎发育的氨基酸。本研究将HCB基因克隆到pPIC9K载体并转化毕赤酵母KM71菌株，经甲醇诱导，HCB表达并分泌到培养上清中。表达产物经SDS-PAGE测定分子量为38 kD, 与HCB基因编码的蛋白质分子量一致。用HCB的特异性抗体检测表明重组表达产物为棉铃虫组织蛋白酶B，原位水解实验显示重组表达的蛋白酶具有蛋白水解活性，表明在毕赤酵母中表达了有活性的棉铃虫组织蛋白酶B, 可用于组织蛋白酶B酶原活化机理研究及开发新蛋白酶产品。

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毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1）克隆及正义植物表达载体的构建

李春秀,齐力旺,王建华,张守攻

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 49-52.

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以毛白杨形成层为材料克隆了毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1），序列分析表明该基因序列为3215bp, 与欧洲颤杨的PtCesA1基因同源性为97% 具有开放的阅读框，编码区在52~2985碱基之间，编码区为2925bp。通过同义突变引入BamHI酶切位点，将全长基因克隆到植物表达载体pBI121中，经酶切和PCR鉴定确认载体构建正确，为下一步ptoCesA1转基因功能研究打下了基础。

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基因组改组（genome－shuffling）提高

王玉华,李岩,裴晓林,冯雁

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 53-58.

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首先采用紫外线与亚硝基胍两种传统微生物诱变方法对干酪乳杆菌进行诱变，经低pH平板、碳酸钙平板和摇瓶试验获得了5株耐酸性提高的突变菌株。以获得的突变菌株为出发菌株，应用灭活双亲原生质体融合后致死损伤得到互补获得活性融合子的方法，对其进行基因组改组，经过低pH平板、碳酸钙平板和摇瓶筛选，获得4株可以在pH3.8平板上旺盛生长且产酸量较高的改组菌株。将改组菌株与原始菌株分别于pH 3.8和3.4的YE液体培养基中培养，改组菌株能够在原始菌株无法生存的pH条件（pH 3.4）下生长。在pH 3.8的条件下，对改组菌株与原始菌株的发酵特征进行比较，37℃发酵48小时后，改组菌株产酸量为原始菌株的2.4倍，表明基因组改组技术能有效提高多基因调控表型的进化。

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自制显示系统检测免疫印迹中的目的蛋白

张晓楠,陈南春,曹云新,张延凤

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 59-61.

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目前蛋白免疫印迹显示系统有显色法和化学发光法，因化学发光法具有灵敏、快速、准确等特点而倍受科研工作者的青睐，但一般商品化的化学发光试剂盒价格颇为昂贵，为此，在参考文献的基础上作了一些改进，将TrisCl的pH值从7.5提高到11.0，同时提高了对碘苯酚的浓度（从1mmol/L提高到2mmol/L），得到了自制的化学发光试剂。首先用其检测了大肠杆菌中表达的2种不同分子量的蛋白（gam，13kDa；bet,30kDa），发现当蛋白上样量为2~20ng时，各蛋白条带均清晰显示。随后的斑点免疫印迹实验表明：自制及进口化学发光试剂在检测酶标二抗效价方面有着同样高的敏感性。

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马立克氏病病毒gB部分基因的原核表达

邱亚峰,葛菲菲,陈溥言

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 62-65.

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邻氯青霉素单克隆抗体的制备及特性鉴定

王琳,齐孟文

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 66-68.

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采用碳化二亚胺法，将邻氯青霉素（cloxacillin）与牛血清白蛋白偶联制备免疫原，免疫BALB/c小鼠，经杂交瘤技术获得了一株能稳定分泌抗邻氯青霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2H8-B1-F4。间接ELISA方法测定，抗体亚类为IgG1，其细胞上清抗体效价为1：1000，腹水效价为1：4×105。与其结构类似物苯唑青霉素、双氯青霉素的交叉反应率为21.3％和19.6％，和氨苄青霉素、羟氨苄青霉素和苄青霉素无交叉反应。体外传代培养和冻存复苏后抗体分泌稳定。为进一步研制检测邻氯青霉素的 ELISA试剂盒奠定基础。

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Bax基因诱导鼻咽癌细胞中相关基因的mRNA差异显示分析

董加喜,李运南,马涧泉

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 69-73.

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目的：应用差异显示技术，筛选鼻咽癌相关基因的异常表达。方法：选用连接有bax基因的真核表达质粒pSFFV-bax-neo, 采用脂质体转染法, 将其转染到CNE2细胞中, 以转染有空载的pSFFV-neo 质粒的CNE2细胞为对照, 采用Trizol试剂快速抽取法, 提取mRNA经逆转录成cDNA,用锚式引物和随机引物进行PCR扩增, 加入同位素, 用6%的测序变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳PCR产物进行分离。切下聚丙烯酰胺凝胶上明显的6条差异带, 回收差异cDNA, 进行第二次PCR扩增, 经低溶点琼脂凝胶回收, 获取大量PCR扩增的差异cDNA片段，同位素标记作为探针, 抽取RNA, 进行点样, 杂交, 洗膜放射自显影等步骤, 进行细胞RNA的Northern印迹斑点杂交。结果：表明4条cDNA片段均为CNE2细胞表达片段。结论：发现bax可诱导CNE2细胞中有某些相关基因表达，并抑制了CNE2细胞某些相关基因表达。

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外源质粒DNA对小鼠脾脏物质能量代谢的影响

刘建文,施用晖,乐国伟

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 74-78.

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研究外源质粒DNA经胃肠道途径对免疫激活状态下小鼠脾脏代谢的影响。给Balb/c小鼠灌喂质粒pcDNA3 200μg，分别在灌喂后4h和18h分离脾脏，提取脾脏总RNA。利用Affymetrix基因表达谱芯片对灌喂质粒pcDNA3后的Balb/c小鼠脾脏进行基因表达谱研究。采用Genmmapp和MAPPFinder软件进行功能聚类分析。对上调倍数两倍及两倍以上的基因进行功能聚类发现，灌喂后4h,外源质粒刺激小鼠脾脏产生免疫应答的同时，脾脏中嘌呤代谢及蛋白质合成，胆固醇合成、脂肪酸合成、糖酵解、三羧酸循环及线粒体氧化磷酸化途径等大量代谢过程受到诱导。在灌喂后18h也得到类似的结果。结果表明外源质粒DNA可通过胃肠道途径吸收影响小鼠脾脏物质能量代谢过程。结果有助于在分子水平上深入了解外源质粒DNA经胃肠道吸收后的作用机制。

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长效重组蛋白药物的研究进展

戚楠,马清钧

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 79-82.

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重组蛋白药物经静脉和皮下注射后通常半衰期较短，目前延长蛋白药物半衰期的方法主要基于三种原理：1、增大蛋白药物分子量；2、利用血浆药物平衡；3、减少免疫原性。本文针对构建突变体、PEG化修饰和与血清白蛋白融合三种延长重组蛋白药物半衰期的方法，及其已上市的和正在研发中的长效重组蛋白药物的特征、半衰期和免疫原性问题进行了综述。

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双水相体系逆流色谱技术在蛋白质分离中的应用

李挺,曹学丽,董银卯

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 83-88.

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双水相体系逆流色谱技术结合了逆流色谱的高效率、高制备量以及双水相体系适于蛋白质分离的特点，因此在蛋白质的分离方面具有独特的应用价值。本文综述了近年来基于正交轴逆流色谱仪器的双水相体系逆流色谱技术在多种蛋白质分离中的应用。并对一些新兴的蛋白质逆流色谱分离技术及新型逆流色谱柱分离系统进行了介绍。

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辅酶工程在酿酒酵母木糖代谢工程中的研究进展

侯进,沈煜,鲍晓明

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 89-94.

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辅酶工程（cofactor engineering）是代谢工程的一个重要分支，它通过改变辅酶的再生途径，达到改变细胞内代谢产物构成的目的。介绍了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)木糖代谢工程中，利用辅酶工程解决氧化还原平衡问题的研究进展，包括引入转氢酶系统，增加代谢中可利用的NADPH，实现NADH的厌氧氧化等策略。同时介绍了改变XR、XDH辅酶偏好的研究进展。

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利用BDPs同时作为反硝化微生物的碳源和附着载体的研究

周海红,王建龙

中国生物工程杂志. 2006, 26(02): 95-98.

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饮用水源水中硝酸盐污染已引起世界各国的普遍关注，异养反硝化是去除水中硝酸盐的主要技术之一。利用可生物降解聚合物（BDPs）同时作为反硝化微生物的碳源和附着生长的载体，近年来得到了人们的关注。该系统对进水水质的波动具有良好的适应能力；BDPs对人体无毒无害，不会污染出水水质。随着各种新型BDPs材料的不断涌现以及BDPs材料生产成本的降低，BDPs材料在饮用水源水生物脱氮中会得到越来越广泛的应用。本文对利用可生物降解聚合物进行反硝化的研究进展进行了综合评述。

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2006年, 第26卷, 第02期　
刊出日期：2006-02-25

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