从真核细胞蛋白酶体分子结构及血红蛋白分子结构出发,阐述真核细胞蛋白酶体降解血红 蛋白的分子机理,以探索出调控降解血红蛋白的有效途径,为畜禽血液的综合利用提供理论依据。
促肝细胞生长因子具有促进细胞增殖和生长的作用,国内外研究较多。我国对肝细胞生 长因子的研究和应用主要集中在肝源性促肝细胞生长因子上。在总结国内学者历年研究成果的 基础上,结合我国生产和应用的实际情况,对促肝细胞生长因子的来源、结构、理化性质、生产及 应用情况进行了综述,有助于更深入研究。
RNA沉默是一种由21-26nt RNA分子介导的真核生物体内普遍存在的以序列特定性行为 抑制基因表达的保守途径。RNA沉默最显著的特征在于它是一种非细胞自发的过程,即在植物 和小杆线虫(Caenorhabditis elegans)中RNA沉默均能被局部诱导,随后将沉默状态传导至整个生 物体。RNA沉默的系统传导特性表明,RNA沉默途径中存在着可移动的信号分子。就RNA沉默 信号传导的特征和可能的信号分子等做一综述。
蛋白质定向进化是在人类改造蛋白质的过程中产生的。蛋白质定向进化通常分三步进 行,即随机诱变、体外重组和筛选。每一步都有多种研究技术。蛋白质定向进化大大加速了人类 改造蛋白质的步伐,在实际应用研究和基础理论研究中都具有重要意义。
肿瘤化疗药物多以p53依赖性途径诱导细胞凋亡,而许多肿瘤在发生过程中丧失了p53 功能;此外,在肿瘤发生过程中往往伴随着抑制细胞凋亡的bcl-2蛋白的高水平表达。而来源于 鸡贫血病毒的凋亡素能够选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞发生凋亡,并以非p53依赖性途径 诱导细胞凋亡,不受bcl-2蛋白的抑制作用。因此,凋亡素作为1种抗肿瘤制剂用于肿瘤治疗能 够选择性地诱导肿瘤细胞和转化细胞发生凋亡,而并不杀伤人和鼠的正常二倍体细胞,且无毒副 作用,具有很好的临床应用前景。
噬菌体展示技术是(Phage Display Techniques,PDT)一种将外源肽或蛋白基因与噬菌体特定 蛋白基因在其表面进行融合表达的新技术。该技术已在生命科学的各个领域得到广泛应用,近 几年,在展示系统及筛选方法这两个关键环节上有了长足进展,就这两方面做一综述。
重组大肠杆菌的高密度培养是增加单位时间/体积重组蛋白产率的最有效途径之一。如 何在获得高密度的同时取得较高的单位时间／体积目的蛋白产率,是高密度培养(过程中亟待解 决的问题,这与所选用的菌体、构建的表达系统、发酵时pH、溶氧、培养基成分及培养温度、质粒 稳定性、代谢副产物的限制及对比生长速率的控制等因素有关。试从这些方面加以综述,分析这 些条件对重组蛋白生产的影响,介绍大肠杆菌高密度培养领域的一些研究进展。
牛疱疹病毒1型(BHV 1)是牛的易感病毒,作为大分子量DNA病毒,它具有插入并表达外 源基因成为活病毒载体的潜力。随着对BHV1分子生物学的深入研究,BHV1已被广泛用于研究 宿主范围狭窄而且安全的活病毒载体。
自2000年Polejaeva I A获得第1头克隆猪后,短短几年时间全世界已有10多例成功的报 道,使得猪的体细胞核移植有了长足的发展,但目前猪的体细胞核移植效率依然低下(1-2％), 人们对核移植中重编程分子机理的认识知之甚少。简要综述了猪体细胞核移植近年来的研究进 展,就猪核移植中的技术难点和影响因素进行了分析,涉及供体细胞种类的选择、体外长期培养 和高压筛选对随后核移植的影响以及供核细胞细胞周期的选择,核质双方的协调,去核和注核方 法的选择,融合和激活程序的优化,妊娠的维持等。
最近基因打靶研究揭示出了参与精卵结合和融合的各种分子。精子中ADAMs因子(是含 有裂解蛋白和金属蛋白酶结构域蛋白质家族),包括繁殖因子α、繁殖因子β以及cyritestin,经过 研究已经发现它们对精卵结合有重要作用,而对精卵的融合不重要。通过研究推测出其受体为 卵母细胞整合蛋白,其对精卵交互作用是必需的。最近,一些研究表明CD9和卵母细胞上GPI锚 定蛋白(glycosyl plaosphatidyl inositol糖基磷脂酰肌醇),以及精子上的附睾蛋白DE均是精卵融合 过程中的侯选因子,如果缺乏这些蛋白质分子或其作用受到干扰将导致精卵融合机制紊乱。综 述重点讨论了参与精卵交互作用的相关分子的最新研究进展。
哺乳动物的性别发育经历了个连续不同时期;受精时期性染色体的构建(XY或XX);性腺 发育和分化(精巢或卵巢);获得恰当的性别表现型(雄性或雌性)。人们已经发现睾丸决定因子 (Testis determining factor)就是SRY(Sex determining region on Y chromosome),并逐渐确定了其他与性 别决定和性别反转相关的基因,如SOX9,DAX1,SF1,WT1,GATA-4等。综述了与哺乳动物性别控 制有关的基因研究进展。
营养在动物的基因表达中起着重要的作用。在介绍基因表达过程及营养调控途径的基础 上,综述了营养水平与蛋白质、氨基酸、碳水化合物、脂肪与脂肪酸、矿物元素及维生素等营养因 子对相关基因表达的调控作用及主要机制,并对营养基因的调控、环境因子的调控和风味调控的 研究进行了展望。
线虫抗凝肽(NAP)是自犬钩口线虫成虫分离得到的一系列具有抗凝作用的小分子多肽类 物质,含有约75-85个氨基酸,拥有22％的共同序列。NAP抗凝作用强,药效持久,成本低,临床 应用前景好,现已进入Ⅲ期临床试验评估阶段。就其研究进展做一综述。
研究表明TGS往往与目的基因启动子的甲基化密切相关,RNA沉默则由目的基因的 mRNA特异性降解引起。植物体中诱导RNA沉默的外部因素有转基因和病毒。与传统的转基因 技术相比,病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing VIGS)是一种瞬时表达体系,能在较 短的时间里取得良好的效果,目前被广泛地用来研究植物基因的功能。就VIGS的研究进展做一 个比较全面的综述。阐述了DNA和RNA病毒诱导植物基因沉默的机理,同时讨论了利用病毒诱 导的基因沉默(VIGS)鉴定植物基因功能的优缺点和将来的发展趋势。
利用植物细胞生物反应器技术生产植物有用代谢产物,近些年来取得了很大发展,但植物 细胞悬浮培养的工业化应用仍受到来自生物及工程技术上的限制。针对植物细胞生物反应器技 术的特点及其研究进展,提出在综合考虑生物学和工艺学两方面的基础上,选育药用植物稳定高 产的优良细胞系是提高植物细胞生物反应器技术可行性的关键。
自上世纪80年代转基因植物诞生以来,世界各国专家在转基因作物对健康和环境的影响 问题上就一直争论不休,并严重地影响了转基因作物的商业化。解决的方法就是在转基因植株 筛选后将选择标记和其它一些辅助序列剔除。综述了近年来国内外在植物无选择标记转基因技 术方面的发展和研究成果,详细地论述了这些转化系统的基本原理和操作方法,并进一步比较了 它们彼此间的优缺点,结合实际预测了该技术在生物技术和商品化农业上的巨大潜力。
盐地碱蓬(Suaeda salsa)是一种典型的抗逆性强的真盐生植物,且营养丰富、含有多种功能 成分,蕴涵着巨大的生态、经济和社会效益,特别是在植物耐盐基因工程的研究利用方面更显示 出了广阔的应用前景和巨大的利用价值,因而近年来日益为人们所重视。目前对盐地碱蓬抗逆 特别是抗盐机制的研究已从生理水平深入到了生化及分子水平,并由此带动了其耐盐基因工程 的研究;另一方面,对其保健和药用功效的研究也取得了一定进展。以盐地碱蓬抗盐机制及其基 因工程研究为重点对以上方面的成果进行了综述。
近年来实时定量RT-PCR(real-time quantitative RT-PCR,qPCR)由于其具有敏感性,广阔的 动力学范围,可靠性的特点,成为基因表达研究的标准方法。介绍了实时定量RT-PCR的原理和 实验过程中的潜在问题,并且讨论了实时定量RT-PCR在植物基因表达研究中的应用。
对昆虫具有毒性的外源毒性物质广泛存在于微生物、植物和一些动物中。概述了Bt晶体 蛋白、蛋白酶抑制剂、植物凝集素、淀粉酶抑制剂、几丁质酶等几种外源毒性物质的特征、杀虫机 理及其基因在植物抗虫品种培育方面的应用概况,并对今后转外源毒性基因抗虫植物的主要研 究方向作了探讨。
表遗传体系包括DNA甲基化、RNA干涉、基因组印迹和组蛋白密码等多方面。它们们在 生物体生长发育过程中对基因表达和调控有重要作用,而且与生物体的防御机制和生物遗传信 息的传递存在密切联系。表遗传在肿瘤上也有重要应用,表遗传机制的异常通过使癌遗传学途 径基因失能与获能、增加基因组的不稳定性和印迹丢失等途径参与肿瘤的形成,同时也启发了对 肿瘤防治的研究。就表遗传这一新的分子生物学研究领域的发展及最新研究进展进行了综述。
花由茎顶分生组织的少数细胞分化而来。花的分生组织进行活跃的细胞分裂,并逐步分 化形成萼片、花瓣、雄蕊和雌蕊4个器官。这些器官的性质由花的“同源异型基因”决定,决定花 的器官数和对称性等的基因族也在起作用。就目前对这些基因族的研究进展做些探讨。
双液相系统是由水相与不互溶非水相组成的多相系统,在微生物降解疏水化合物时,双液 相系统有助于克服污染物可生物利用性障碍,提高污染物的生物降解速率。文中介绍了双液相 系统促进微生物降解的机制,微生物吸收底物的方式,以及底物与有机溶剂双重抑制作用存在时 微生物的生长模型等方面的研究进展。
微生物表面展示技术是通过基因工程手段,将短的外源肽或蛋白质表达在微生物细胞表 面,该技术可以应用于开发活的细菌疫苗、筛选抗体库、生产生物细胞吸附剂以及制备整细胞生 物催化剂。通过金属高效结合肽的肽库筛选和微生物展示技术,将金属结合肽直接展示在微生 物的表面,用于处理环境中的重金属污染,为环境中重金属污染的防治提供了一条崭新的途径。 利用微生物表面展示技术制备整细胞催化剂,用于有毒有机污染物的处理,可以极大地加快污染 物的降解速率。简要介绍了微生物表面展示技术及其在重金属污染治理和毒性有机污染物的脱 毒等环境生物修复方面的最新研究进展。
白腐菌是一类特殊的丝状真菌,能降解多种污染物质,具有广谱、彻底、高效、无专一性的 特点,在生物修复中有广阔的应用前景。综述了白腐菌的分类、酶系、降解机理以及应用于有机 物污染的研究现状,特别介绍了白腐菌在重金属污染的生物修复的应用进展情况,包括白腐菌吸 附重金属的原理、在重金属污染的废水中的研究应用现状及在修复重金属污染土壤中需考虑的 因素。同时展望了白腐菌在重金属污染及复合污染的生物修复中的应用前景。
采用聚乙烯醇(polyvinyl Alcohol,PVA)-硼酸包埋固定化法,包埋经驯化后的硝化污泥,制 成固定化硝化颗粒。考察了不同温度及pH条件下固定化硝化菌对氨氮的去除效果及其与游离 硝化菌的比较,并对固定化硝化菌对焦化废水中氨氮的去除及其耐毒性能进行了测定和观察。
鼠李糖脂是生物表面活性剂中一类非常重要而应用广泛的微生物发酵产物,在环境污染 修复中需求量越来越多。针对近十年来国内外对鼠李糖脂生物表面活性剂的研究,较系统地总 结了其化学结构、性质、生物合成机理及产量调节方法,及大规模生产鼠李糖脂的基础研究工作, 并对其在城市生活垃圾堆肥中的应用做了展望。
综述了用于描述微囊化细胞培养过程中物质传递机理和细胞生长特性的数学模型,分析 了这些模型在应用于微囊化细胞培养系统时所存在的问题,为建立能精确描述微囊化细胞培养 过程中的物质传递机理和细胞生长特性的数学模型提供必要的参考,以有效推动微囊化技术在 生物医学工程领域的应用。
日粮中的n-3PUFA具有多种作用,除了调节质膜组成和影响细胞信号之外,同时还涉及多 种与脂代谢有关酶与蛋白的基因表达,如:PPARα、SREBPs、LXR等,通过它们来影响靶基因(如: ACO-A、FAS等)的表达,从而起到调控脂肪沉积的作用。
微生物细胞表面工程是近年来发展起来的,它利用细胞表面展示技术使外源蛋白固定化 于细胞表面,从而生产微生物细胞表面蛋白。微生物细胞表面工程可用于细胞催化剂、细胞吸附 剂、活疫苗、生物传感器的开发等。微生物细胞表面工程具有广阔的应用前景,但是国内对这一 领域的研究刚起步。在介绍细胞表面工程的基础上,对微生物细胞表面工程技术进展进行了综 述,展望了对该技术的发展。
尿激酶是纤溶酶原的主要激活物之一。近年来的研究工作发现,尿激酶及其受体-尿激酶 受体-在其他多种生理和病理过程中也发挥了重要作用,包括了创伤愈合、组织再生、细胞迁移、 特别是癌症转移和血管生成等多种生理和病理过程。除了其配体尿激酶外,尿激酶受体还能结 合其他多种蛋白质,包括了玻璃体结合蛋白、LDL受体蛋白,及多种整合素等蛋白质,这些蛋白 质-蛋白质相互作用是尿激酶-尿激酶受体系统生物作用的结构基础,是目前的一个重要研究方 向。结合作者的工作描述了该体系的结构研究现状。
在土壤酶学基础上发展起来的堆肥酶活研究能够从生化方面更深入地反映堆肥产品的腐 熟程度、有机物质的降解以及重金属、芳香族化合物等有害物质的转化情况。文章系统总结了堆 肥中酶活变化与原料成分、添加剂、微生物种类和数量、有机质降解的关系,不同酶活性之间的相 关性以及堆肥中酶动力学的研究成果。提出筛选少数几个彼此独立的综合性酶指标,利用多元 回归分析建立堆肥化与酶活的动态关系。同时提出堆肥中酶学发展的新思路,酶活检测技术的 改进以及堆肥化中酶系统影响因素的探讨。
嗜碱性菌是一类生长于碱性环境中的特殊微生物。自发现以来引起人们广泛重视,并在 许多方面得到了应用。阐述了嗜碱性菌在酶制剂方面的应用和发展。
甘露聚糖类物质是自然界中半纤维素的第二大组分。β-甘露聚糖酶能水解底物生成甘露 寡糖,释放出与之结合的水分、微量元素等。应用于猪、鸡、鸭和水产动物日粮,可提高饲料的利 用效率,减少养殖业环境污染。甘露寡糖具有改善动物胃肠道微生态环境的功能。多种细菌、真 菌、软体动物等分泌β-甘露聚糖酶,其基因属于糖基水解酶家族5。β-甘露聚糖酶在工农业生产 和环境保护等方面有着广泛的用途。就β-甘露聚糖酶的酶学特性、研究历史、应用技术、效果和 作用机理,特别是其基因工程技术研究进展等作了概述。
文章介绍了监测干红葡萄酒发酵过程参数的现状;分析了引起干红葡萄酒发酵体积膨胀 的原因;定义了体积膨胀率;对体积膨胀率作为发酵过程物理参数的实用性进行了探讨。
酪氨酸酶具有重要的生理生化特性,在医药、环境、食品、精细化工等领域具有广泛的用 途。酪氨酸酶可以氧化L-酪氨酸合成L-多巴和黑色素,L-多巴用于帕金森症的治疗,黑色素能够 杀死HIV病毒。酪氨酸酶可用于环境工程领域处理含苯酚及胺类废水,用于精细化工领域催化 有机合成反应。综述了酪氨酸酶在各个领域的应用概况,阐明了其在工业生产领域的应用前景。
草酸脱羧酶是一种含锰的酶,在白腐菌中广泛存在,少数低等真菌和细菌中也能产生。目 前,至少10多种草酸脱羧酶得到了分离和纯化。该酶是一种氨基酸残基在379个左右的单体 酶,一般都为酸性糖蛋白,含有2个锰离子,形成2个活性区域;表面一些氨基酸被不同程度地糖 基化。晶体结构和其它一些波谱学研究解释了其空间结构和可能的电子传递机制。运用PCR 技术和cDNA文库技术,越来越多的草酸脱羧酶基因被克隆。已研究的该酶基因中都含有17个 左右的内含子,这些内含子在活性域位置上有比较高的保守性。一些特殊氨基酸序列的存在决 定了该酶的表达形式为诱导型,菌株的基因调控序列中含有一段受草酸化合物作用的序列。该 酶在一些酵母和植物等异源表达系统中有成功表达的报道。该酶的应用主要集中在以下几方 面:造纸废水中的草酸盐降解;食品中的草酸降解;草酸生物检测(如临床诊断)等。
来源于芽孢杆菌的中性植酸酶具有良好的热稳定性,适合作为消化道呈中性鲤科鱼类的 饲料添加剂。该植酸酶晶体具有独特的螺旋桨样空间结构,钙离子在其稳定性和催化活性的结 构功能关系中具有重要作用,并表现出特有的催化机理。该基因与已知植酸酶基因的结构有所 不同,是一种新的植酸酶。目前主要采用多种原核表达系统对其进行表达。比较表明,芽孢杆菌 表达系统和酵母表达系统是实现芽孢杆菌植酸酶规模化生产的有效途径。
双乙酰是乳制品中一种重要的风味物质。大多数乳酸菌(如乳球菌)都可以发酵葡萄糖和 柠檬酸产生双乙酰。描述了在乳球菌中从柠檬酸代谢和糖酵解途径来生成双乙酰的代谢途径, 以及利用基因工程和代谢工程技术来提高乳球菌的双乙酰生成量的策略。
现代生物技术在制药产业中发挥了重要作用,海洋生物技术的出现和发展推动了海洋生 物药物的研究,是今后生物技术药物的发展方向。综述了生物技术在海洋药物开发中的应用,并 展望了新世纪海洋生物制药的前景。
结合国内外对绒山羊的分子生物学研究,利用已有的遗传多态、基因序列和结构、功能等方 面的数据,以计算机网络为载体,参考国际通用数据库的格式,建立一个简洁、友好、通用而且专用 性强的绒山羊分子生物学数据库。该数据库主要由文献索引库,基因组学库及绒山羊知识库组成。 数据库的建立为绒山羊的分子生物学研究提供一个良好的数据平台,为从事绒山羊遗传多态、遗传 进化、分子育种、绒毛生长机理等方面的理论和应用研究的工作者提供方便和帮助,并为探索其他 草食家畜分子生物学数据库的构建积累经验。
21世纪是生物时代和信息时代,基因组学的研究已从结构基因组学转向功能基因组学,功 能基因组学时代对于基因功能的研究也由单一基因转向大规模、批量分析。对功能基因组学及 相关学科的概念作了概述,综述了功能基因组学的研究内容与方法,主要包括应用差异显示反转 录PCR、基因表达序列分析(SAGE)、微点阵、蛋白质组学和生物信息学等方法来研究基因组表达 概况、基因组多样性和模式生物学等。
微卫星标记作为一类重要的、成熟的分子遗传标记,凭借自身的高变异性、孟德尔遗传模 式、共显性遗传方式等优点,在遗传及其它相关领域发挥了十分重要的作用,而其主要的缺点是 必须知道所研究生物的微卫星序列及其旁侧序列。随着人类及模式生物基因组的深入研究,微 卫星标记的制备经历了从费时、费力、低效的传统法到周期短、效率高的富集法(选择性杂交法和 FIASCO法);从基因组构建文库筛选到公共数据库ESTs发掘;从实验室自制到花钱购买。总之, 随着方法与技术的不断改进,从目标生物中获得微卫星标记变得越来越简单、经济。
分子生物学技术,如等位酶分析、DNA序列分析、限制性片段长度多态性、随机扩增多态、 重复DNA序列多态性,在轮虫研究中的应用始于上世纪70年代,研究领域主要是轮虫群体遗传 学、生物变异与多样性和系统发生与进化,被研究的轮虫种类主要集中在臂尾轮虫属、晶囊轮虫 属和蛭态轮虫的一些种类。着重介绍分子生物学技术在轮虫遗传学和系统学研究中的应用,并 对今后的研究热点提出了展望。
面对现代生物技术的快速发展,结合目前的贵州省生物技术发展状况和丰富的生物资源, 开展了对传统教学体系起补充作用的教学实践,提高本专业学生实际分析问题的能力和动手能 力,探讨一条适合贵州实际情况,有利于贵州生物技术领域发展的新型生物技术专业教育模式。
重组人源性抗HBsAg Fab抗体具有较好的特异性和抗原结合活性,为了更好的阐明毕赤 酵母表达的重组人源性抗HBsAg Fab抗体的性质,用基质辅助激光解析飞行时间质谱(MALDI- TOF-MS)对重组Fab抗体的分子质量和肽质量图谱进行了分析。结果显示,毕赤酵母表达的重组 人源性抗HBsAg Fab抗体的分子质量为50678．49Da,与根据其一级结构计算的理论分子质量相 比多2763．84 Da,显示酵母表达的重组Fab抗体为糖蛋白。用胰蛋白酶酶解重组Fab抗体后进行 MALDI-TOF-MS分析显示,大部分的酶解肽段均能检测出来。结果表明毕赤酵母表达的重组Fab 抗体与预期的结构一致。
GGN1是1种功能未知的睾丸特异表达蛋白,它是睾丸特异性基因Ggn的表达产物。Ggn 基因的原初转录产物有多种剪接方式,并最终翻译产生3种蛋白,GGN1就是其中的1种。研究 发现Ggn的表达与精子的生成过程紧密相关。GGN1还可以与多种蛋白相互作用,其中包括 FANCL,GGNBP1,GGNBP2和OAZ3。为了能够在体外更方便的研究Ggn及其相关基因的功能,通 过脂质体转染和G418加压法筛选获得了能稳定表达pEGFP-N2／GGN1的CHO-K1细胞株。
通过药物抑制病毒致细胞病变效应实验和药物对病毒空斑形成抑制实验,研究低毒性失 配双链核糖核酸(Poly I:C12U)和已知的抗病毒药物双链核糖核酸聚肌胞(Poly I:C)在细胞水平对 柯萨奇病毒感染的抑制作用比较,证明Poly I:C12U的抗病毒作用。实验结果表明Poly I:C12U和 Poly I:C均可有效地抑制病毒空斑的形成,且量效关系已确定。
目的:探索利用酿酒酵母系统表达乙型肝炎病毒(HBV)preS／S基因。方法:利用PCR技 术,以HBV病毒DNA为模板,体外扩增HBV preS／S基因。然后构建重组表达载体pESC-preS／S。 用LiAc法转化酿酒酵母YPH50,选取重组菌进行培养,并诱导表达外源蛋白。提取蛋白浓缩后 进行SDS-PAGE分析,并经Western blot分析鉴定。结果:实验结果表明重组菌能够表达HBV preS／S蛋白。结论:利用酿酒酵母系统可成功表达HBV preS／S基因,为制备新型预防性疫苗提供 条件。
消化道途径转基因过程方便、快捷、易适应,可为基因治疗提供全新的模式。为了研究人 生长激素(bGH)基因的经消化道途径转基因过程,实验首先应用ECHO克隆系统。在供载体 pUni-hGH和宿主载体pcDNA4／TO-E的基础上,构建出hGH的哺乳动物表达载体pcDNA4-hGH;然 后结合酿酒酵母表达载体pESC-URA,构建出hGH的酵母-哺乳动物穿梭栽体pESC-CMV-hGH,测 序鉴定后转化酿酒酵母。用阳性重组酵母对小鼠进行灌胃免疫实验,间接ELISA方法在实验组 小鼠的血清中检测到抗hGH抗体的存在。结果证实hGH基因可通过消化道途径转进小鼠体细 胞并进行表达,初步证明了hGH的消化道基因治疗的可行性。
构建乙型脑炎E蛋白主要抗原片段与结核杆菌热休克蛋白70(Mycobacterium tuberculosis hear shock protein70,Mt．hsp70)的肽连接区(Binding domain)基因融合表达载体,利用酵母表达系 统,为下一步研究肽连接区是否能增强乙型脑炎E蛋白主要抗原片段的免疫原性作准备。以酵 母表达载体pPICZα-A为基本单位构建,以酶切位点BamHI连接这2个基因,用电穿孔法转化酵 母X-33,Zeocin平板筛选重组子,经甲醇诱导表达后,SDS-PAGE和免疫印迹分析表达产物。E蛋 白主要抗原片段与hsp70肽连接区的融合表达载体构建成功,SDS-PAGE显示,其相对分子质量为 68kDa,与实际大小相符且为分泌表达,表达量约为97mg／L,经Western印迹验证,抗原性较好。将 用同样的酵母表达载体表达的乙脑E蛋白主要抗原片段(另文发表)与上述融合蛋白均以50pmol． 的量分别对6-8周龄的:BALB／c小鼠进行腹膜内注射,3周后进行第二次免疫,从淋巴细胞的增 殖和抗体滴度两个方面进行比较,最后得出E-BD融合蛋白在免疫效果方面比乙脑E蛋白主要抗 原片段效果要好,在试验中肽连接区可以增强乙型脑炎E蛋白主要抗原片段的免疫原性。
目的:研究从包涵体中制备重组人血管抑素的可行工艺。方法:采用发酵法制备表达重组 人血管抑素的大肠杆菌,经离心、破碎、洗涤后得到包涵体,以盐酸胍作为变性液溶解包涵体,经 稀释透析法复性重组人血管抑素,以SDS-PAGE及Wetern-blot鉴定纯度,T法鉴定其生物活性 MT。结果从6．88g包涵体中得到了322．5mg的重组人血管抑素,得率4．7％。电泳鉴定为单一条 带,在浓度0．1mg/ml时,对内皮细胞(HEMC-1)最高抑制率可达33％。结论:得到了一条可行的 血管抑素的制备工艺。
目的:探讨组织工程全层皮肤移植于皮肤深度烫伤的术后治疗效果。方法:于猪背部皮肤 制备Ⅲ°烫伤创面36个随机分为3组,每组12例。空白对照组(A)、自体全厚皮片移植组(B)、组 织工程全层皮肤移植组(C),观察组间收缩率并进行镜下观察。结果:术后12周时B、C组收缩率 无显著差异,且两组镜下观非常相似,但C组未见皮肤附件结构。结论:组织工程全层皮肤具有 与正常皮肤相似的真表皮结构,可以用于皮肤深度烧伤的治疗,是一种非常有前景的皮肤替代 物。
按照nanog基因编码序列设计合成引物,利用RT-PCB从小鼠的囊胚期胚胎中扩增得到该 基因,并将该基因克隆到pET-28b(+)载体上,获得pET-28b(+)-nanog原核表达重组质粒,限制 性酶分析和DNA序列测定均证实该克隆插入片段为nanog基因编码序列。重组质粒转化大肠杆 菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达,在大肠杆菌表达系统中获得了高效表达,western杂交证实该 蛋白具有6-His抗原活性,从而证实目的蛋白为Nanog蛋白。
利用PCR技术分3段克隆了长约9．7kb的牛β-酪蛋白基因,分另4克隆在pGEM-T easy Vector的T位点。经NCBI Blastn分析,与牛β-酪蛋白基因相应区段的同源性为98％。这3段序 列包含完整的5’侧翼序列、前8个外显子及第8个内含子的部分序列。以此构建了两个乳腺特 异性表达栽体:利用第1段和第2段共有的酶切位点将两段融合,作为5’调控区(6．8kb),第3段 和实验室已有的600 bp的加尾信号通过重组PCR拼接作为3’调控区(3．4kb)构建了一乳腺特异 性表达栽体;以第一段作为5’调控区,实验室已有的600bp加尾信号作为3’为调控区构建了另一 乳腺特异性表达载体。可以应用于进一步乳腺生物反应器的研制。
猪肝酯酶(Pig Liver Esterase,PLE)是手性合成工业中最常用的三种生物催化剂之一,它的 生化提取物是多种同工酶(α、β和γ亚基)的混合物,而它的单一组分(γ亚基)有很高的手性拆分 活性。为获得重组PLE,从猪肝提取总RNA,经RT-PCR得到γ亚基目的基因,并利用pPIC9K质 粒构建成pPIC9K-PLE表达载体,转化到Pichia pastoris中,转化细胞株摇瓶发酵表达重组PLE达 450mg／L,活性染色证明分子量略低于天然酶。
根据GenBank已发表的结核杆菌HSP70的基因序列及O型口蹄疫病毒VP1基因序列,应 甩Primer5．0软件设计了2对引物,其中一对引物用于扩增结核杆菌基因组中的HSP70完整基 因,另一对引物用于以pMD-D为模板,扩增其中的VP1完整基因序列。将所扩增的2段基因串 联插入腺病毒转移载体pAdenovator-CMV5-IRES-GFP的BglⅡ位点,经PCR方法和限制性酶切方法 鉴定2基因已成功插入了转移载体并且插入方向正确,获得了重组腺病毒转移载体pAdenovator- CMV5-IRES-GFP-VP1-HSP,此转移载体可与腺病毒骨架载体进行细菌内同源重组,以产生重组腺 病毒载体。
运用RT-PCR技术扩增了禽流感病毒A／Chicken／Jiangsu／JS-1/2002(H9N2)完整的血凝素 (HA)基因,并克隆到pGEM-T载体中,进一步进行了序列测定。序列测定结果已经登陆 GenBank,登陆号为AY364228。所扩增的HA基因长度为1683核苷酸,共编码560个氨基酸,其中 信号肽长度为18aa,HA1为319aa,HA2为223aa。HA蛋白裂解位点的氨基酸组成为RSSR↓GLF, 不舍连续的碱性氨基酸,具有低致病性AⅣ HA基因裂解位点的序列特征。通过构建一个包含 18株H9N2亚型AIV的HA基因遗传进化树,发现所有的18个毒株共可分为欧亚谱系和北美谱 系两个谱系,而本分离株在分类地位上国内另外的三个分离株同属于欧亚谱系,在遗传进化上非 常接近,表明它们可能具有共同的起源。
利用离子交换和凝胶过滤层析等分离技术从江浙蝮蛇蛇毒中分离纯化到一种抗肿瘤蛋 白,经SDS-聚丙酰胺凝胶电泳检测其分子量为58．2ku。MTT法测定该蛋白对K562细胞的LC50为 4．96μn/mL,电子显微镜观察其能引起K562细胞的凋亡,琼脂糖凝胶电泳可见典型的DNA梯状条 带,实验结果表明该蛋白对K562细胞有明显的抑制作用。
目的:对编码刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)RH株果糖1,6-二磷酸醛缩酶基因进行克隆和 序列分析,并构建原核载体pETcFN融合表达该重组蛋白,以研究该分子在弓形虫速殖子入侵中 的作用。方法:从刚地弓形虫RH株速殖子cDNA中扩增编码果糖1,6-二磷酸醛缩酶的基因,并 克隆到T载体上,测序确认;通过PCGENE及在线工具对此编码序列进行分析;将该基因亚克隆 到表达载体pET30a(+)上,构建质粒pETcFN;表达产物用Western blot进行进一步确认。结果:经 PCR鉴定和质粒双酶切鉴定后测序,确认插入T载体的序列为所需的目的序列。根据序列分析, 推断蛋白的预计分子量为39．2kDa,等电点为7．75;BLAST分析,发现同源性52％以上的序列32 条;模序分析发现其分别在223-233、21-147及15-363位置隐含有与PS00158(ProfileScan)、 PD001128(BlastProDom)及PF00274(HMMPfam)相似的模序,这些序列分子功能均为果糖二磷酸 醛缩酶活性。该编码片段亚克隆到载体上成功构建融合表达质粒pETcFN,转化到大肠杆菌BL21 (DE3)中诱导表达,得到分子量为43kDa的融合蛋白。Western bolt的结果与预测相符。
目的:对蜜环菌菌索中提取出的水溶性糖复合物糖链进行部分酸降解,从中筛选出对α-葡 萄糖苷酶具有抑制活性的片断。方法:通过柱层析等方法对蜜环菌糖复合物进行纯化;按正交表 设计酸水解条件,将糖链降解成适宜的片断,从中筛选出最佳水解条件;再进行α-葡萄糖苷酶抑 制活性的研究。结果:降解后的糖复合物片断具有α-葡萄糖苷酶抑制活性。结论:结构改造对糖 复合物的生物活性有一定的影响。
本实验目的是研究海藻糖对微生物谷氨酰胺转胺酶(TGase)热稳定性的作用。糖类对 TGase的保护作用根据糖种类不同有所差异,海藻糖和蔗糖的保护作用优于葡萄糖对TGase的保 护作用。在45℃、50℃、55℃、60℃、65℃下研究了海藻糖对TG酶的保护作用。结果表明,在50- 65℃下海藻糖使谷氨酰胺转胺酶受热时的稳定性提高了约20％。海藻糖与酶复合的最合适浓度 约为14％,浓度低时保护作用不明显,加入过高浓度的糖对酶的活性维持不利。50℃下处理一段 时间内,海藻糖对酶的保护作用随时间变化很小。
对巴斯德毕赤酵母的高密度发酵条件进行了试验,并根据摇瓶发酵的优化结果进行了补 料方式的研究。在摇瓶发酵时,最佳种龄为16h,接种量为3％,甲醇的诱导浓度为15g／L,生长阶 段最适pH为5．0,诱导阶段最适pH为5．5。在间歇补料、恒速补料、变速补料三种补料方式中以 变速流加最优。
确定了杆菌(Brevibacterium ammoniagenes)JMS1601发酵产核酸的最佳发酵培养基:葡萄糖 12％,酵母浸膏1．5％,磷酸二氢钾0．3％。最佳摇瓶培养条件:温度32℃,摇床转速160r／min,接 种量(v／v)5％,装液量100ml／500ml。
在接种了本实验室保存的诱变菌株A的未灭菌的菜籽饼粕发酵样品中筛选得到3株能以 菜籽饼粕为原料生长的菌株,编号为S1、S2、S3,菌株A和这3株菌种通过鉴定确定为凝结芽孢杆 菌、圆孢芽孢杆菌、短小芽孢杆菌和球形芽孢杆菌。通过设计正交实验摸索出这4株菌种的最佳 培养条件。并对饼粕固体混合菌发酵进行了初步摸索和探讨。
从绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)PAK菌株的染色体DNA构建的基因文库中筛选到一 基因片段与绿脓杆菌的抗性相关。经测序证明该片段包含了绿脓杆菌基因组中PA4293所编码 序列,进一步实验证明与它相邻的另一段827bp的基因也与绿脓杆菌的抗药性有关。上述2基 因分别命名为pprA和pprB。以绿脓杆菌PAK菌株为出发菌株,经过新霉素耐受培养得到抗生素 抗性菌株PAK1-3,该菌株对氨基糖苷类抗生素的抗性明显增强。经PCR方法扩增上述基因并克 隆至PAK1-3菌株中,可引起该菌株对氨基糖苷类抗生素的敏感。又经pprB基因转入临床分离 得到的致病性绿脓杆菌中,导致部分绿脓杆菌对氨基糖苷类抗生素的敏感性增强。pprA和pprB 很可能是一组与绿脓杆菌抗药性相关的双分子调节系统,并与细胞膜的通透性有关。
对《分子克隆实验指南》(第三版)中的牙签法小量制备质粒DNA的方法做了改进,减少了 加样次数,免去冰浴、离心等步骤,改进后的方法在琼脂糖凝胶电泳前仅需一步加样和加热过程, 提高了实验效率。同时结合使用多孔道移液器和96孔板,更适合于在高通量筛选中鉴定阳性克 隆。实验对改进后的方法与《分子克隆实验指南》上的方法进行了比较,表明“一步法”的检测效 果、准确率与重复性均有到较好的结果。
