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中国生物工程杂志

CHINA BIOTECHNOLOGY
中国生物工程杂志
中国生物工程杂志  2019, Vol. 39 Issue (4): 38-51    DOI: 10.13523/j.cb.20190406
研究报告     
添加剂对大孔吸附树脂固定化脂肪酶的影响 *
林海蛟1,2,张继福3,张云1,孙爱君1,胡云峰1**()
1 中国科学院南海海洋研究所 中国科学院热带海洋生物资源与生态重点实验室 广州 510301
2 中国科学院大学 北京 100049
3 广东省中医院 广州 510120
The Effective of Additives on the Immobilization of Lipase by Microporous Absorbent Resin
Hai-jiao LIN1,2,Ji-fu ZHANG3,Yun ZHANG1,Ai-jun SUN1,Yun-feng HU1**()
1 CAS Key Laboratory of Tropical Marine Bio-resources and Ecology, South China Sea Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510301,China
2 University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China
3 Guangdong Provincial Hospital of Chinese Medicine, Guangzhou 510120, China
 全文: PDF(1531 KB)   HTML
摘要：

利用大孔吸附树脂DA-201为载体对海洋脂肪酶固定化,并探寻添加剂对固定化过程的影响。分别以NH4Cl、甘露糖和甘氨酸为添加剂,采用单因素和正交实验相结合的方法优化条件。结果显示,以NH4Cl为添加剂的最优条件:柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH 6.0,固定化温度30℃,载体投放量0.5g,NH4Cl浓度25mmol/L,固定化时间3.0h,酶活力达到115.27U/g;比不含有添加剂的固定化酶固定化效率提高47.42%。以甘露糖为添加剂最优条件:磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液pH7.0,固定化温度35℃,载体投放量0.5g,甘露糖浓度10mmol/L,固定化时间4.5h;酶活力达到122.75U/g,比不含有添加剂的固定化酶固定化效率提高6.50%。以甘氨酸为添加剂的最优条件:磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液pH7.0,固定化温度20℃,载体投放量0.5g,甘氨酸浓度为25mmol/L,固定化时间7.5h;酶活力达到141.69U/g,比不含有添加剂的固定化酶固定化效率提高26.12%。采用不同添加剂对大孔吸附树脂DA-201的吸附固定化过程有较大影响,可以极大地提高吸附效率;同时发现缓冲液类型、pH、温度、添加剂浓度和固定化时间等对DA-201树脂吸附脂肪酶有很大影响,对后续吸附固定化工业酶研究有较好的参考价值。
关键词： 大孔吸附树脂;  海洋脂肪酶;  固定化;  添加剂    
Abstract:

Macroporous absorbent resin DA-201 was adopted as a carrier to immobilize marine-derived lipase, and the influence of additives on the immobilization process was explored. NH4Cl, mannose and glycine were used as the additives, and the conditions were optimized by a combination of single factor and orthogonal experiments. The results showed that the optimal conditions with additive NH4Cl were: citric acid-sodium citrate buffer pH6.0, immobilization temperature 30℃, carrier quantity 0.5g, NH4Cl concentration 25mmol/L, immobilized time 3.0h; enzyme activity reached 115.27U/g, which was 47.42% higher than that of the immobilized enzyme without additive. The optimal conditions with additive mannose were: potassium dihydrogen phosphate-sodium hydroxide buffer pH7.0, immobilized temperature 35℃, carrier quantity 0.5g, mannose concentration 10mmol/L, the immobilized time 4.5h; the enzyme activity reached 122.75U/g, which was 6.50% higher than that of the immobilized enzyme without additive. The optimal conditions with glycine additive: potassium dihydrogen phosphate-sodium hydroxide buffer pH7.0, immobilized temperature 20℃, carrier quantity 0.5g, the glycine concentration 25mmol/L, the immobilized time 7.5h; the enzyme activity reached 141.69U/g, which was 26.12% higher than that of the immobilized enzyme without additive. The addition of different additives exhibited great effects on the immobilization through absorbtion by macroporous absorbent resin DA-201 and could greatly improve the adsorption efficiency. Additionally, buffer type, pH, temperature, additive concentration and immobilization time were found to have great influence on the adsorption of lipase by resin DA-201, which provides good reference for subsequent research of the immobilization of industrial enzymes.
Key words: Macroporous absorbent resin    Marine lipase    Immobilization    Additives
收稿日期: 2018-11-01 出版日期: 2019-05-08
ZTFLH:  Q814.2  
基金资助: *广东省海洋渔业科技攻关与研发方向项目(A201701C12);中国科学院战略性先导科技专项(XDA11030404);中国科学院“科学”号高端用户项目(KEXUE2018G05);广东省自然科学基金资助项目(2018A030313151)
通讯作者: 胡云峰     E-mail: yunfeng.hu@scsio.ac.cn
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林海蛟
张继福
张云
孙爱君
胡云峰

引用本文:

林海蛟,张继福,张云,孙爱君,胡云峰. 添加剂对大孔吸附树脂固定化脂肪酶的影响 *[J]. 中国生物工程杂志, 2019, 39(4): 38-51.

Hai-jiao LIN,Ji-fu ZHANG,Yun ZHANG,Ai-jun SUN,Yun-feng HU. The Effective of Additives on the Immobilization of Lipase by Microporous Absorbent Resin. China Biotechnology, 2019, 39(4): 38-51.

链接本文:

https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/10.13523/j.cb.20190406    或    https://manu60.magtech.com.cn/biotech/CN/Y2019/V39/I4/38

序号 pH 温度
(℃)		 载体量
(g)		 浓度
(mmol/L)		 时间
(h)
1 5.0 20 0.5 10 1.5
2 5.5 25 1.0 15 3.0
3 6.0 30 1.5 20 4.5
4 6.5 35 2.0 25 6.0
表1  NH4Cl固定化条件优化正交实验因素与水平
序号 pH 温度
(℃)		 载体量
(g)		 浓度
(mmol/L)		 时间
(h)
1 6.0 25 0.5 2 1.5
2 6.5 30 1.0 5 3.0
3 7.0 35 1.5 10 4.5
4 7.5 40 2.0 15 6.0
表2  甘露糖固定化条件优化正交实验因素与水平
序号 pH 温度
(℃)		 载体量
(g)		 浓度
(mmol/L)		 时间
(h)
1 6.0 20 0.5 10 3.0
2 6.5 25 1.0 15 4.5
3 7.0 30 1.5 20 6.0
4 7.5 35 2.0 25 7.5
表3  甘氨酸固定化条件优化正交试验因素与水平
图1  载体的筛选和添加剂对脂肪酶吸附固定化的影响
图2  NH4Cl添加剂各条件对脂肪酶吸附固定化的影响
序号 pH 温度(℃) 载体量(g) 浓度(mmol/L) 时间(h) 相对酶活力(%)
1 5.0 20 0.5 10 1.5 72.62±0.97
2 5.0 25 1.0 15 3.0 76.87±0.86
3 5.0 30 1.5 20 4.5 66.82±0.73
4 5.0 35 2.0 25 6.0 55.87±0.96
5 5.5 20 1.0 20 6.0 62.74±1.40
6 5.5 25 0.5 25 4.5 91.14±0.51
7 5.5 30 2.0 10 3.0 61.77±1.03
8 5.5 35 1.5 15 1.5 44.82±1.41
9 6.0 20 1.5 25 3.0 61.55±1.34
10 6.0 25 2.0 20 1.5 55.21±0.43
11 6.0 30 0.5 15 6.0 100.00±1.28
12 6.0 35 1.0 10 4.5 66.62±0.61
13 6.5 20 2.0 15 4.5 55.36±0.63
14 6.5 25 1.5 10 6.0 65.41±1.11
15 6.5 30 1.0 25 1.5 71.53±0.43
16 6.5 35 0.5 20 3.0 91.06±1.36
K1 272.17 252.27 354.82 266.41 244.18
K2 260.48 288.63 277.75 277.05 291.25
K3 283.38 300.12 238.60 275.83 279.94
K4 283.36 258.37 228.22 280.10 284.02
R 22.90 47.85 126.60 13.68 47.07
优势水平 3 3 1 4 2
优势组合 pH6.0, 温度30℃, 载体量0.5g, 浓度25mmol/L, 时间3.0h
主次因素 载体量>温度>时间>pH>浓度
表4  使用NH4Cl的吸附固定化条件优化正交实验结果与分析
图3  甘露糖添加剂各条件对脂肪酶吸附固定化的影响
序号 pH 温度(℃) 载体量(g) 浓度(mmol/L) 时间(h) 相对酶活力(%)
1 6.0 25 0.5 2 1.5 80.57±1.23
2 6.0 30 1.0 5 3.0 55.17±2.50
3 6.0 35 1.5 10 4.5 71.18±1.97
4 6.0 40 2.0 15 6.0 50.25±2.13
5 6.5 25 1.0 10 6.0 82.37±1.91
6 6.5 30 0.5 15 4.5 93.74±0.49
7 6.5 35 2.0 2 3.0 44.10±1.86
8 6.5 40 1.5 5 1.5 54.56±1.79
9 7.0 25 1.5 15 3.0 61.60±1.50
10 7.0 30 2.0 10 1.5 47.96±0.50
11 7.0 35 0.5 5 6.0 100.00±0.81
12 7.0 40 1.0 2 4.5 70.73±2.32
13 7.5 25 2.0 5 4.5 46.93±1.38
14 7.5 30 1.5 2 6.0 48.55±0.79
15 7.5 35 1.0 15 1.5 65.13±0.87
16 7.5 40 0.5 10 3.0 79.81±0.50
K1 257.18 271.47 354.12 243.95 248.23
K2 274.77 245.42 273.40 256.66 240.69
K3 280.29 280.42 235.90 281.32 282.58
K4 240.42 255.34 189.24 270.73 281.16
R 39.87 35.00 164.89 37.37 41.89
优势水平 3 3 1 3 3
优势组合 pH7.0, 温度35℃, 载体量0.5g, 浓度10mmol/L, 时间4.5h
主次因素 载体量>时间>pH>浓度>温度
表5  使用甘露糖的吸附固定化条件优化正交实验结果与分析
图4  甘氨酸添加剂各条件对脂肪酶吸附固定化的影响
序号 pH 温度(℃) 载体量(g) 浓度(mmol/L) 时间(h) 相对酶活力(%)
1 6.0 20 0.5 10 3.0 89.55±0.52
2 6.0 25 1.0 15 4.5 70.73±1.11
3 6.0 30 1.5 20 6.0 52.93±0.52
4 6.0 35 2.0 25 7.5 50.92±0.51
5 6.5 20 1.0 20 7.5 78.02±2.12
6 6.5 25 0.5 25 6.0 86.82±1.59
7 6.5 30 2.0 10 4.5 48.21±0.54
8 6.5 35 1.5 15 3.0 50.09±0.82
9 7.0 20 1.5 25 4.5 75.86±1.08
10 7.0 25 2.0 20 3.0 66.10±1.57
11 7.0 30 0.5 15 7.5 100.00±1.42
12 7.0 35 1.0 10 6.0 72.46±0.57
13 7.5 20 2.0 15 6.0 59.18±1.06
14 7.5 25 1.5 10 7.5 61.70±0.77
15 7.5 30 1.0 25 3.0 76.22±0.89
16 7.5 35 0.5 20 4.5 81.37±0.88
K1 264.13 302.61 357.74 271.92 281.97
K2 263.15 285.36 297.43 280 276.17
K3 314.42 277.36 240.58 278.41 271.39
K4 278.47 254.84 224.42 289.83 290.64
R 51.27 47.76 133.33 17.91 19.25
优势水平 3 1 1 4 4
优势组合 pH7.0温度20℃载体量0.5浓度25时间7.5h
主次因素 载体量>pH>温度>时间>浓度
表6  使用甘氨酸吸附固定化条件优化正交实验结果与分析
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