2022年, 第42卷, 第7期　
刊出日期：2022-07-25

  

• 全选
  |

研究报告
• Select
  不同类型神经细胞对低氧的敏感性研究^*

  胡文宇,李硕硕,程金波,袁增强

  中国生物工程杂志. 2022, 42(7): 1-11. https://doi.org/10.13523/j.cb.2202052

  摘要 ( ) PDF全文 ( ) HTML ( )   可视化   收藏

  目的 阐明低氧对神经细胞在能量代谢、氧化应激、炎症等方面的影响,探讨不同类型神经细胞响应低氧刺激的敏感性, 为低氧诱导的脑损伤病理机制研究提供理论基础。方法 将不同类型的神经细胞系(BV2、N9、Gl261、HT22)低氧(0.1% O₂,5% CO₂)处理0~24 h,用CCK8法(Cell Counting Kit-8)检测细胞增殖,发光细胞活力测定法(luminescent cell viability assay)检测细胞活力。提取各细胞总RNA及总蛋白质,通过实时荧光定量PCR (quantitative real time-PCR,RT-qPCR)、免疫印迹(Western blot)、流式细胞仪等技术检测能量代谢、炎症相关基因表达水平和氧化应激水平。结果 低氧处理后,各类神经细胞增殖明显减慢。小胶质细胞BV2和N9对低氧的响应主要表现在炎症因子和糖代谢相关酶的改变,星形胶质细胞Gl261和神经元HT22对低氧的响应主要表现在糖代谢相关酶的改变,小胶质细胞和星形胶质细胞在低氧刺激下氧化应激水平显著增加。结论 不同类型神经细胞响应低氧刺激的敏感性不同。能量代谢和炎症反应方面,小胶质细胞对低氧处理更敏感,表现为糖酵解酶显著上调,炎症因子变化明显;氧化应激方面,小胶质细胞和星形胶质细胞对低氧处理更敏感,表现为氧化应激响应快,ROS产生显著增加。
• Select
  可利霉素通过调控巨噬细胞极化影响黑色素瘤的增殖^*

  杨子荣,杨璇,倪婷婷,潘聪,谭诗生,王姿

  中国生物工程杂志. 2022, 42(7): 12-23. https://doi.org/10.13523/j.cb.2203018

  摘要 ( ) PDF全文 ( ) HTML ( )   可视化   收藏

  目的 探讨可利霉素(CAM)是否通过调节巨噬细胞极化,继而影响黑色素瘤的发生发展。方法 通过实时荧光定量聚合酶链反应(Q-RT-PCR)和Western blot检测CAM对巨噬细胞极化的影响;流式细胞术和CCK-8法检测CAM对小鼠体内外巨噬细胞吞噬和增殖的影响;构建B16-F10细胞系荷瘤模型评价CAM对黑色素瘤的抗肿瘤作用。结果 CAM可上调M1巨噬细胞TNF-α和iNOS的水平,下调M2中Arg-1的水平;上调p-STAT1表达,下调p-STAT3表达。CAM抑制黑色素瘤的发生发展,抑瘤率为41.6%,促进M1巨噬细胞数量增加 (P<0.05)。结论 CAM促进体内M1巨噬细胞数量增多,抑制黑色素瘤的进展,提示CAM可能通过诱导巨噬细胞向M1巨噬细胞极化发挥抗肿瘤作用。
• Select
  AAV载体介导的蓬佩病模型小鼠体内基因治疗研究^*

  武志杰,马文豪,董哲岳,吴小兵,杨怡姝,盛望

  中国生物工程杂志. 2022, 42(7): 24-34. https://doi.org/10.13523/j.cb.2202040

  摘要 ( ) PDF全文 ( ) HTML ( )   可视化   收藏

  目的 蓬佩病是一种由酸性α-葡糖苷酶(GAA)缺乏引起的溶酶体糖原贮积症,病理特征是糖原在心脏、骨骼肌和中枢神经系统中累积。基因治疗有望成为治疗蓬佩病的突破性手段。采用AAV9载体在蓬佩病模型小鼠体内介导GAA基因转移,评估转基因干预后小鼠体内GAA酶活力变化、组织糖原累积及病理改变。方法 采用AAV9载体携带密码子优化的GAA基因(coGAA),通过杆状病毒生产工艺包装AAV病毒载体rAAV9-coGAA,分别以1.1×10¹³ vg/kg、3.0×10¹³ vg/kg、1.2×10¹⁴ vg/kg的剂量静脉单次注射给予成年蓬佩病模型小鼠,以3.0×10¹³ vg/kg的剂量静脉单次注射给予老龄蓬佩病模型小鼠。到达试验终点后安乐死小鼠,使用荧光分光光度法测定GAA酶活力、PAS染色观察糖原累积、HE染色检查病理变化。结果 成年模型小鼠给药5周后,各个组织能够广泛表达具有活性的GAA,其中心脏、肝脏表达水平较高,脑和脊髓表达水平较低。转基因干预后心肌、骨骼肌与脑中的糖原含量下降,心肌、骨骼肌的空泡样变性显著减少。老龄小鼠治疗后,组织酶活力与模型小鼠相比显著提升,心肌的空泡样变性和炎细胞浸润减少,但骨骼肌的病理改善有限。结论 静脉单次注射rAAV9-coGAA在蓬佩病模型小鼠中能够提升GAA酶活力,减少糖原累积并改善病理,治疗效果呈剂量依赖,对老龄小鼠也有一定治疗效果。为AAV9静脉递送GAA基因治疗蓬佩病的临床应用奠定了基础。
技术与方法
• Select
  酵母脂肪酶分子进化及催化合成(S)-1,4-苯并二口恶烷^*

  张琦,唐璐瑶,何远志,张凯,祝加伟,崔莉,冯雁

  中国生物工程杂志. 2022, 42(7): 35-44. https://doi.org/10.13523/j.cb.2203068

  摘要 ( ) PDF全文 ( ) HTML ( )   可视化   收藏

  目的 1,4-苯并二口恶烷是普罗克生、多沙唑嗪等抗高血压和MCK-242等抗抑郁药物的手性中间体,在医药领域具有广泛应用。目前化学合成具有产量高的优势,然而存在环境污染和生产安全性低等问题。应用脂肪酶进行催化合成提供了1,4-苯并二口恶烷的绿色合成新途径。研究发现天然酶存在对映体选择性低的局限,因此针对南极假丝酵母脂肪酶B进行分子进化,并建立了1,4-苯并二口恶烷催化合成的技术路线。方法 首先,针对南极假丝酵母脂肪酶B活性中心参与底物结合和转化的关键氨基酸残基进行分析,并构建了相互作用位点协同进化的饱和突变库,通过HPLC检测,筛选获得了系列转化效率高和对映选择性强的突变体,最后对影响最佳突变体D223N/A225K催化效率的反应条件进行系统优化。结果 来自D223和A225位点突变体(D223N/A225K和D223G/A225W等)偏向于合成(S)-型产物;而E188和I189位点突变体(E188D/I189M等)表现出偏向于合成(R)-型产物。与野生型相比,最佳突变体D223N/A225K合成(S)-1,4-苯并二口恶烷的ee_s值从11.9%提升到29.3%。对反应条件系统优化后,突变体D223N/A225K在37℃、正丁醇/磷酸盐缓冲液(20∶80,V/V)两相溶剂中反应50 min后对底物(R,S)-1,4-苯并二口恶烷-2-甲酸甲酯的转化率为(47.5±2.33)%,ee_s值达(93.9±0.16)%。结论 通过分子改造与条件优化,成功实现对(R,S)-1,4-苯并二口恶烷-2-甲酸甲酯的高效动力学拆分,为蛋白质工程技术创制新酶提供了新例证,也为酶法高效催化合成(S)-1,4-苯并二口恶烷类分子提供了理论和技术基础。
• Select
  几株啤酒酵母的筛选及发酵性能比较^*

  曹春蕾,余培斌,吴殿辉,蔡国林

  中国生物工程杂志. 2022, 42(7): 45-53. https://doi.org/10.13523/j.cb.2203034

  摘要 ( ) PDF全文 ( ) HTML ( )   可视化   收藏

  啤酒酵母是啤酒酿造的灵魂,可以直接影响啤酒品质。在啤酒酿造过程中,由于啤酒酵母被多次传代和保藏,造成优良菌种发酵性能衰退等问题,导致发酵不彻底,影响最后啤酒的风味质量。为此以8株Lager型啤酒酵母为出发菌株,通过平板分离纯化获得80株分离菌株,再经过三角瓶发酵初筛和复筛、发酵罐中试发酵实验最终获得了8株发酵性能优良的啤酒酵母。其中,6株酵母可应用于酿造双乙酰含量低于0.1 mg/L的啤酒;3株酵母发酵度高于70%,适合酿造干啤酒;1株酵母发酵度低于50%,适合酿造低醇啤酒。在风味方面:1株酵母酿造的啤酒醇酯比为3.3,啤酒酯香味较突出;另1株酵母酿造的啤酒醇酯比为4.5,啤酒高级醇含量较高。8株经过选育的啤酒酵母发酵特征明显,便于精酿啤酒厂实际应用。

• Select
  茄病镰刀菌单克隆抗体的制备及胶体金免疫层析试纸条的研发^*

  汪琨,赵福运,徐云飞,袁小凤,赵伟春

  中国生物工程杂志. 2022, 42(7): 54-61. https://doi.org/10.13523/j.cb.2202053

  摘要 ( ) PDF全文 ( ) HTML ( )   可视化   收藏

  目的 利用浙贝母(Fritillaria thunbergii)根腐病病原菌之一的茄病镰刀菌(Fusarium solani)为抗原制备分泌特异性单克隆抗体(单抗)的细胞株,开发基于单抗的胶体金免疫层析试纸条,为检测浙贝母根腐病提供技术支撑。方法 以茄病镰刀菌全菌体蛋白质提取液为抗原,利用杂交瘤技术制备能分泌针对茄病镰刀菌特异性单抗的细胞株;间接ELISA和Western blot检测单抗的特异性、效价、灵敏度、结合蛋白等特性;采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒并标记单抗,制备胶体金免疫层析试纸条。 结果 获得3株能分泌针对茄病镰刀菌的特异性单抗的细胞株,分别命名为FsA3、FsG6、FsD4。其中FsA3检测灵敏度为24.41 ng/mL,FsG6、FsD4检测灵敏度均为12.21 ng/mL。FsA3、FsG6、FsD4均针对茄病镰刀菌强烈反应,且不与细极链格孢(Alternaria tenuissima)、交链格孢(A. alternata)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、木贼镰刀菌(F. equiseti)、变红镰刀菌(F. incarnatum)、尖孢镰刀菌(F. oxysporum)、茎点霉属真菌(Phoma sp.)、Phomopsis oblonga等抗原发生交叉反应。基于FsG6的胶体金免疫层析试纸条检测浙贝母无菌组培苗提取液时只出现质控线,加入100 ng茄病镰刀菌抗原或浙贝母根腐病病株样品时,均出现肉眼可见的质控线和检测线。结论制备的单抗和试纸条具有简单、快速、特异性和灵敏度高的优点,可用于检测浙贝母病株中分离到的茄病镰刀菌,这为浙贝母根腐病田间快速准确检测提供了技术支撑。
综述
• Select
  核酸适配体在三阴性乳腺癌诊疗中的研究进展^*

  姚芷昕,李婉明

  中国生物工程杂志. 2022, 42(7): 62-68. https://doi.org/10.13523/j.cb.2202034

  摘要 ( ) PDF全文 ( ) HTML ( )   可视化   收藏

  乳腺癌是女性高发恶性肿瘤,三阴性乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)恶性程度极高,且发病机制复杂,是乳腺癌分型中预后最差的类型,但目前其早期筛查和诊断的敏感度仍处在较低水平。因此,亟须通过应用具有高度特异性的肿瘤标志物分子探针,实现其早期诊断和治疗。核酸适配体是在人工合成的随机单链核酸序列文库中,通过指数富集的配体系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment, SELEX)筛选获得的寡核苷酸序列。高效的分子识别能力使其成为最具潜力的生物靶向分子,在肿瘤诊断及治疗中具有广阔的应用前景。目前,通过筛选已获得了多种靶向TNBC细胞的核酸适配体。重点综述基于SELEX及其衍生技术筛选TNBC相关核酸适配体的新进展,以及核酸适配体在TNBC诊断和治疗中的应用,为相关研究提供参考。

• Select
  鼠伤寒沙门菌入侵宿主细胞机制研究进展^*

  闫春晓,吴昊,阮海华,袁琳,宋倩倩,乔建军

  中国生物工程杂志. 2022, 42(7): 69-78. https://doi.org/10.13523/j.cb.2202016

  摘要 ( ) PDF全文 ( ) HTML ( )   可视化   收藏

  鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)是一种人畜共患的肠道病原菌,可引起肠道炎症。该病原菌主要通过其致病岛(SPIs)编码的III型分泌系统(T3SS)分泌效应因子,包括促炎因子和抗炎因子。其在入侵肠上皮细胞时会释放促炎因子引发炎症反应,同时,为防止促炎因子过度破坏宿主细胞影响菌体的生存和繁殖,鼠伤寒沙门菌会产生一系列抗炎因子来调节细胞内信号通路,与宿主共同繁殖并最终全身扩散造成严重感染。旨在对鼠伤寒沙门菌利用T3SS效应因子入侵并调节宿主细胞信号通路机制进行概述。

• Select
  辅因子在微生物细胞工厂中的代谢调控与应用^*

  贾男,臧国伟,李春,王颖

  中国生物工程杂志. 2022, 42(7): 79-89. https://doi.org/10.13523/j.cb.2203042

  摘要 ( ) PDF全文 ( ) HTML ( )   可视化   收藏

  生物体中大部分酶催化反应都需要辅因子参与,辅因子平衡对维持正常的细胞代谢至关重要,而辅因子失衡则会导致细胞生长和生产的紊乱。在微生物细胞工厂的构建中,通过调节辅因子代谢平衡来提高产物合成途径的效率,从而调控细胞生长与产物生产,使代谢流能够最大限度地流向目标产物,已经成为代谢调控的重要手段。目前常见的用于代谢调控的辅因子有NAD(P)H/NAD(P)⁺、辅酶、ATP/ADP等。围绕这几种辅因子的代谢途径及功能分类进行了综述,并总结了微生物中不同产物利用辅因子平衡策略进行合成调控的研究,以期为各类化合物的高效生物合成提供参考。

• Select
  蓝藻光驱固碳合成糖类物质的技术研究进展^*

  曾雪霞,但玉,毛绍名,孙佳慧,栾国栋,吕雪峰

  中国生物工程杂志. 2022, 42(7): 90-100. https://doi.org/10.13523/j.cb.2203072

  摘要 ( ) PDF全文 ( ) HTML ( )   可视化   收藏

  糖类物质在食品、医药、日化、发酵领域有着广泛应用,对人类健康和社会发展有着重要意义。发展新型糖类物质合成技术有利于解决传统植物生物质“采集-炼制”产糖模式所面临的高成本、长周期、时空限制等风险和问题。蓝藻是一类重要的光自养微生物,也是极具潜力的新型微生物光合平台,发展蓝藻光驱固碳产糖技术有望实现二氧化碳向特定糖类产物的一站式定向转化,实现糖类物质合成的模式变革。糖类物质本身在蓝藻天然光合代谢网络中发挥重要作用,特别是卡尔文循环、糖原代谢、相容性物质代谢等几个重要生理模块的运转都是以不同糖类物质的转化来驱动的;而合成生物技术的发展又为光合产糖网络重塑和扩展注入了新的驱动力,在产品类型、合成模式及生产效率上显著提升了蓝藻光驱固碳产糖技术的发展和应用潜力。针对蓝藻光驱固碳产糖技术的发展应用,从模式、策略、产物等不同维度总结了相关进展和风险挑战,并对其未来前景和方向进行了展望。

• Select
  基于酿酒酵母的大片段DNA组装与转移技术进展^*

  田方方,何博,吴毅

  中国生物工程杂志. 2022, 42(7): 101-112. https://doi.org/10.13523/j.cb.2203026

  摘要 ( ) PDF全文 ( ) HTML ( )   可视化   收藏

  DNA组装与转移技术是合成生物学的核心使能技术之一,生命体设计改造的复杂度不断提升,使得对大片段DNA组装与转移技术的需求也日益旺盛。小片段DNA的组装与转移技术目前已经比较成熟,大片段DNA由于其分子量大、易断裂,使得体外操作繁琐且效率低下。聚焦酿酒酵母体内组装和转移的技术进展,详细介绍了基于酿酒酵母一次组装和迭代组装的不同方法,并从导入与导出的角度介绍了大片段DNA的转移技术,便于研究者更好地理解和选择酿酒酵母体内组装与转移技术。此外,还展望了将酿酒酵母开发为大片段DNA组装与转移通用平台实现更多物种基因组大尺度设计改造的愿景。

技术情报
• Select
  英国脱欧后基因技术监管趋势及对中国的启示^*——基于英国《基因技术报告》的分析

  李欣,刘旭霞,张弛

  中国生物工程杂志. 2022, 42(7): 113-120. https://doi.org/10.13523/j.cb.2203019

  摘要 ( ) PDF全文 ( ) HTML ( )   可视化   收藏

  英国脱欧后加快了生物技术领域的立法进程,迫切希望通过革新原先欧盟的保守监管模式,在保障技术安全的前提下充分发挥基因技术的应用价值。为实现该目标,英国发布了《基因技术报告》,旨在重新构建更加全面的基因技术监管体系。这一报告不仅分析了既有基因技术治理实践的不足,还指明了未来英国基因技术监管的方向。当前基因编辑、合成生物学等新型基因技术正处于高速发展时期,英国的报告也为这些技术的应用提供了一条可供参考的治理路径。