目的:孕酮(progesterone, P4)作为一种生殖激素,在牛的发情期和妊娠期呈规律性变化,且在妊娠的建立和维持过程中发挥着重要作用。拟应用孕酮浓度测定辅助人工观察筛选克隆胚胎移植受体牛并监测其整个妊娠过程。方法:通过对自然配种牛不同生殖阶段血液中孕酮水平的分析,建立其在发情初期、妊娠期孕酮浓度的变化规律,以此为依据辅助人工观察筛选适合胚胎移植的受体牛。同时将在体外培养7天后的体细胞核移植重构囊胚移植到所筛选出的同期发情的受体牛子宫内,并应用孕酮测定监测其妊娠状态。实验结果: (1)运用孕酮检测筛选克隆胚胎移植受体牛时,当孕酮浓度在发情第0天和第5天分别为≤0.64nmol/L和2~8nmol/L时,适宜作为胚胎移植受体牛,根据此筛选指标能够排除50%左右假发情牛。(2)运用孕酮检测较传统的人工观察方法,胚胎移植的克隆牛出生率提高了7.1倍。结论:运用牛血清孕酮检测方法能有效提高母牛生理周期判断的准确性,有利于选择合适的胚胎移植受体牛,既能实时、有效地监测怀孕受体牛的妊娠状态,又避免了靠人工观察受体牛返情、流产时的人为疏漏和误判,有效地提高受体牛的利用率,提高克隆牛的生产效率,并能推广应用于畜牧行业牛的生产繁育中。
目的:构建抗α2δ1和CD3的双特异性抗体,并在体外初步评价其杀伤肝癌细胞的功能。 方法:通过基因工程技术,构建BiTE形式的anti-α2δ1/CD3双特异性抗体(BsAb),转染Expi 293F细胞96h后,使用镍离子亲和色谱纯化出双特异性抗体,使用流式细胞术检测anti-α2δ1/CD3 BsAb对α2δ1和CD3的结合性质,使用Perkin Elmer Operetta 高内涵成像仪测定anti-α2δ1/CD3 BsAb介导细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)对高表达α2δ1的人肝癌细胞Hep-12的杀伤效应,ELISA法检测杀伤过程中CTLs分泌hIL-2和hIFN-γ的变化。结果:anti-α2δ1/CD3 BsAb可以特异性结合α2δ1和CD3,anti-α2δ1/CD3 BsAb可以有效介导CTLs靶向杀伤高表达α2δ1的人肝癌细胞Hep-12,其介导杀伤Hep-12细胞的EC50为8pmol/L,对于低表达α2δ1的人肝癌细胞Hep-11, anti-α2δ1/CD3 BsAb不能介导CTLs发挥杀伤作用,并且在杀伤过程中Hep-12细胞组CTLs释放的hIL-2和hIFN-γ比Hep11细胞组显著增多(P<0.05)。结论:anti-α2δ1/CD3 BsAb能有效介导CTLs体外杀伤高表达α2δ1的人肝癌细胞Hep-12,为双特异性抗体的肝癌免疫治疗奠定了一定的基础。
目的:构建肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor,TNF)纳米抗体的噬菌体文库,筛选并表达与TNF-α具有亲和特异性的纳米抗体。方法:(1)利用TNF-α免疫羊驼,提取外周血淋巴细胞总RNA,构建噬菌体文库;多次淘洗筛选到与TNF-α有亲和力的克隆。(2)通过ExPASy分析其分子量和亲疏水性等理化性质,并将筛选得到的VHH基因在大肠杆菌E.coli DH5α中表达。(3)表达的NbTNF-α蛋白质经过Ni金属螯合亲和层析纯化,采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)检测蛋白质的抗原特异性和亲和力。结果:(1)通过噬菌体文库的构建和淘洗,筛选到8个与TNF-α有亲和力的VHH基因片段。(2)通过软件预测,这8个NbTNF-α蛋白均为亲水性蛋白,其分子量为19.6~20.1kDa;在大肠杆菌中重组表达这8个抗体蛋白。(3)ELISA检测结果表明,有5株纳米抗体NbTNF-α-1、NbTNF-α-2、NbTNF-α-3、NbTNF-α-4和NbTNF-α-5能与TNF-α特异性结合。结论:成功筛选并表达了5株具有TNF-α特异性的纳米抗体,可能成为抗TNF-α的候选药物。
目的:获取含RGD靶向肽的乙肝核心病毒样颗粒,为药物靶向纳米递送系统提供一种新型载体。方法:将实验室前期构建测序正确的含RGD修饰的乙肝核心病毒重组质粒转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,单因素分析及正交试验探究重组蛋白最适表达条件。在最适表达条件下扩培,收集菌体超声破碎后离心,采用凝胶过滤层析、离子交换和蔗糖密度梯度离心进行纯化,利用透射电镜对形成的RGD-HBc VLPs的形态及稳定性进行鉴定。纯化的RGD-HBc VLPs利用其体外自组装的特性,将光敏剂ICG装载到颗粒的内部,通过静脉注射到4T1乳腺癌荷瘤小鼠,探究重组RGD-HBc VLPs作为纳米递送系统的靶向性。结果:RGD-HBc VLPs在温度32℃、IPTG 0.5mmol/L、诱导4h时以可溶性蛋白的形式得到高效表达。经蔗糖密度梯度离心纯化后纯度到达95%以上。透射电镜下观察纯化的RGD-HBc VLPs形态、大小均一,直径约为32nm,通过近红外荧光活体成像证实了RGD-HBc作为纳米载体的靶向性。结论:经表达和纯化后,RGD-HBc VLPs具有较高的表达量和大小均一的形态外貌,近红外荧光活体成像证实具有较好的靶向性,这不仅为肿瘤的可视化诊断提供一种快速、精准、方便的方法,而且为今后靶向免疫治疗提供一种新型载体。
近年来的动物实验结果表明电磁辐射的危害主要是具有神经系统毒性、诱发肿瘤和生殖系统损伤等,广域、隐蔽和累积效应是辐射的特点,除对机体进行直接损伤外,还可导致间接损伤,即通过产生活性氧(ROS)和自由基攻击生物大分子。为了迅速和简便地检测辐射毒性的大小建立了新型的辐射生物传感器,构建了携带SOS反应和氧化应激反应相关的SulA、RecA、Cda和SoxR四种启动子融合经过密码子简并性优化的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)报告因子的工程菌传感器,并对这些生物传感器进行了γ射线辐照处理,筛选出了针对γ射线响应较好的,优选RecA工程菌传感器。利用PCR和Overlap PCR克隆获得了启动子-报告因子融合基因,并插入表达载体PUC19中,转化入宿主大肠杆菌DH5α,通过提取质粒进行双酶切和测序验证后,将构建成功的工程菌传感器首先进行化学毒性试剂刺激,一旦化学试剂刺激结果阳性便进行物理辐射刺激。结果显示,构建成功的4种工程菌传感器均对物理辐射产生应答,且随物理辐射剂量的增加(0~30Gy),绿色荧光强度逐渐增强。运用合成生物学手段,成功建立基于生物损伤修复效应和氧化应激反应的辐射生物传感器,具有制备简便、结果可视性等优点,能满足快速、广范围、在线监测的需求,在细胞毒性物、辐射环境乃至空间射线的损伤能力测定方面具有良好的应用前景。
目的:探究SarA-AG、IcaA-AG及IcaA-SarA-AG(Azami Green用AG表示)融合基因的DNA疫苗及对小鼠免疫应答的影响。方法:以金黄色葡萄球菌基因组为模板,通过PCR等反应进行SarA-AG、IcaA-AG及IcaA-SarA-AG融合基因DNA疫苗的构建,将DNA疫苗转染至HeLa细胞,荧光显微镜下观察DNA疫苗的瞬时表达情况,将转染成功2周后的细胞进行基因组提取,PCR检测质粒在染色体上的整合情况。使用AG、SarA-AG(A组)、IcaA-AG(B组)及IcaA-SarA-AG(C组)4组免疫BALB/c小鼠,应用ELISA试剂盒检测小鼠血清中IgG抗体、IL-2、IL-4、IL-13、IFN-γ及TNF-α的分泌情况。结果:成功构建SarA-AG、IcaA-AG及IcaA-SarA-AG融合基因DNA疫苗,荧光显微镜下观察DNA疫苗转染情况,结果显示有绿色荧光。提取细胞基因组PCR检测结果显示未出现目的基因条带。免疫小鼠后,A、B、C组均能够诱导小鼠产生较高水平的IgG抗体。与空白组及空载体AG组相比,A、B组均能分泌较高水平的IL-2(P<0.001)、IFN-γ(P<0.001)、TNF-α(P<0.001)、IL-4(P<0. 01)及IL-13(P<0. 01),而C组TNF-α(P<0.05)、IL-4(P<0. 05)及IL-13(P<0. 05)分泌较少,但差异有统计学意义,细胞因子的分泌随着免疫次数的增加,差异显著增加。空白组及空载体AG组细胞因子无显著差异。结论:成功构建SarA-AG、IcaA-AG及IcaA-SarA-AG融合基因的DNA疫苗,且成功在真核细胞中表达。PCR验证结果证实了DNA疫苗的安全性。DNA疫苗免疫小鼠后可诱导体液免疫应答和以Th1细胞为主的细胞免疫应答,具有较好的应用前景。
Surfactin作为一种绿色生物表面活性素在多种领域均有潜在的应用价值,但是在生产过程中存在着泡沫难以控制的问题,阻碍了其实现工业化生产。因此在7L发酵罐水平探究了适合surfactin工业化生产的最佳发酵策略。研究结果表明,过量添加消泡剂会对微生物的生长造成不利影响而且会增加生产成本,以有机硅和大豆油为消泡剂时surfactin产量分别为1.42g/L和1.96g/L。通过改进发酵罐采用泡沫分离的发酵策略,不仅可以经济有效地解决泡沫难以控制的问题,而且可以实现surfactin的原位分离,surfactin产量为2.39g/L;基于泡沫分离式发酵,控制pH=7后surfactin产量提高至3.45g/L;又进一步通过控制DO≥20%后产量提高至5.07g/L。最后,将泡沫分离耦合pH、溶解氧控制及恒速补料,控制pH=7、DO≥20%、恒速流加速度1.39ml/min,可以将surfactin产量显著提高至6.04g/L,与添加消泡剂相比,产量提高了4.25倍。以上结果为surfactin的工业化生产提供了依据。
糖尿病是各种因素导致的高血糖慢性代谢疾病,已发展成为流行疾病之一。化学抗糖药虽能控制血糖水平,延缓病程进展,但需长期服用;胰岛移植能从根本上治愈糖尿病,但胰岛来源不足,且需终生应用免疫抑制剂,故并没有得到广泛应用;干细胞是一类能够自我复制的细胞,具有多向分化潜能和旁分泌特性,近年来的研究证明,干细胞在糖尿病治疗方面有着积极的效果,被认为是有效治疗糖尿病的理想细胞类型。因此,就干细胞治疗糖尿病的分子机制和临床研究现状进行简要阐述。
Janus纳米粒子(Janus nanoparticle,JNP)用于描述由两个不同侧面组合而成的一种异质结构的实体材料。Janus纳米粒子每个侧面在化学性质和/或极性上都有所差异,可将不同材料的特征和功能结合在一起,这是同类均质的材料难以实现的。近年来,Janus纳米粒子的制备方法已取得了重大突破,但其应用的发展方向仍然是一个充满挑战的领域,其中在抗肿瘤药物输送系统领域的研究较为突出。主要介绍了在药物输送系统中Janus纳米粒子的制备方法及应用,并提出了研究前景和可能面临的挑战。
致泻性大肠埃希氏菌是一类能够引起人类和动物腹泻的食源性致病菌,迅速确定致泻性大肠埃希氏菌的污染来源可有效缩小疫情影响范围,建立简便高效的致泻性大肠埃希氏菌检测与分型技术是保障食品安全和控制疫情的关键。为适应对时间敏感度较高要求的现场或在线检测,基于PCR技术的检测分型方法不断地被标准化和规范化。对近年来国内外的致泻性大肠埃希氏菌分子检测与分型的PCR技术研究进展进行了综述,并详细地介绍了多重聚合酶链反应、荧光实时定量聚合酶链反应和核酸等温扩增技术的原理及其优缺点。为致病菌溯源方法的选择提供参考,对防御并控制致病菌引起流行病传播具有重要的意义。
咖啡酸及其酯类衍生物如绿原酸、迷迭香酸和咖啡酸苯乙酯等具有天然抗氧化、抗肿瘤、抗病毒和抗炎等重要的药理活性,具有广阔的药用开发前景。从天然药物中提取或者化学合成咖啡酸及其酯类衍生物,存在含量低、提取效率不高、催化成本高昂以及环境污染等问题。随着咖啡酸及其酯类衍生物合成途径解析和合成生物学的快速发展,微生物异源合成咖啡酸及其酯类衍生物的研究已逐渐展开。对微生物异源合成咖啡酸及其酯类衍生物合成途径的最新进展以及代谢工程策略进行了综述,并讨论了目前存在的问题和未来的发展趋势。
采用文献计量分析方法,分析了全球生物技术研究领域的发展现状和趋势及其对中国生物技术研究发展的启示。研究结果表明:2019年我国在生物技术文献发表数量上已位列世界第一,但在生物技术文献的质量、学术影响力以及国际合作能力方面仍与欧美等发达生物技术国家存在一定差距,接着分析了全球生物技术研究的学科组成、各生物技术分支领域的研究交叉现状,最后分析了目前各生物技术细分领域的热点研究主题。针对当前我国面临的生物技术研究发展问题,我国应当注重研究成果质量,促进各学科间交叉融合,加强国际合作交流,顺应未来生物技术发展热点趋势。
