目的:探讨微环境中钙周期素S100A6 是否通过影响巨噬细胞(macrophages, Mφ)进而促进结直肠癌(colorectal cancer, CRC)细胞的增殖及其机制。方法:制备(原核表达)并鉴定带GST(glutathione S-transferase,谷胱甘肽S-转移酶)标签的人重组S100A6蛋白(recombinant GST-hS100A6,rS100A6) 和对照蛋白GST;采用台盼兰计数、CCK8和结晶紫染色检测CRC细胞系HCT116的增殖能力;用定量实时聚合酶链反应检测Mφ中IL-6 mRNA水平;用Western blot检测Mφ中IL-6的蛋白水平、HCT116细胞中JAK2和STAT3及其磷酸化水平。 结果:(1)成功制备rS100A6和GST蛋白。(2)与经rS100A6处理的Mφ(即A6-Mφ)共培养后,HCT116细胞的增殖能力增强(P<0.05);同时,HCT116细胞中的JAK2和STAT3水平无明显变化,但其磷酸化水平提高(P<0.05)。(3)A6-Mφ中,IL-6的mRNA和蛋白水平均升高(P<0.05)。(4)在HCT116与A6-Mφ的共培养体系中加入IL-6R封闭肽后,A6-Mφ促HCT116细胞的活力和增殖能力的作用被部分逆转(P<0.05)。 结论:微环境中的S100A6可通过上调巨噬细胞中IL-6的表达、进而激活HCT116细胞中IL-6/JAK2/STAT3信号通路来促进CRC细胞的增殖。
目的: 主要是miR-219通过对TGFBR2调控机制,介导ENDMT途径缓解急性心肌梗死的发展。方法: qRT-PCR检测AMI患者及AMI小鼠血清中miR-219的表达量;过microRNA靶基因数据库TargetScan进行筛选预测;萤光素酶报告基因法及qRT-PCR分析TGFBR2与miR-219的调控机制;通过心脏超声心动图检测AMI小鼠心肌注射miR-219慢病毒4周后的血分数(LVEF);采用qRT-PCR检测心肌注射miR-219慢病毒的AMI小鼠中Nppa 的mRNA的表达量;通过Masson’s trichrome染色法检测小鼠4周后左心室纤维化变化;使用α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)对小鼠左室切片进行免疫组化分析;通过Western blot检测P-smad2、P-smad3及TGFBR2缺氧诱导蛋白磷酸化的表达水平。结果: miR-219对AMI有调控作用;miR-219可抑制TGFBR2的mRNA表达,而miR-219 inhibitor可以抑制这种下调效果,miR-219对TGFBR2具有抑制调控性;miR-219可抑制急性心肌梗死的进程,促进梗死心肌功能的恢复;miR-219能促进AMI小鼠心肌组织血管的新生和成熟,最终心脏收缩能力上升,心功能恢复;miR-219能抑制TGFBR2抑制EndMT途径,导致缓解AMI的病理进程。结论: miR-219能通过抑制TGFBR2影响EndMT途径,心肌纤维化减少,促进血管的新生和成熟,心功能恢复,抑制AMI的病理发展。
为了提高猪克隆效率,获得更多的克隆猪,研究了延迟激活对猪体细胞克隆胚胎体外、体内发育的影响。研究发现,和同步融合激活方法相比,延迟激活虽然会降低克隆重构胚的融合率(P>0.05),但能够显著提高克隆胚胎的卵裂率(P<0.01)和囊胚率(P<0.05);延迟激活方法重构胚使用CB辅助激活4h,其囊胚率均极显著高于不使用CB组(P<0.01);将克隆胚胎移植到126头受体母猪后,延迟激活组受体母猪分娩率显著高于同步激活组(P<0.05),虽然在窝均总仔、窝均活仔、克隆效率方面没有显著差异,但延迟激活组显然获得了更多的克隆仔猪。以上结果说明,延迟激活方法能够提高猪克隆胚胎的体外、体内发育效率。
目的:优化AMPs17重组蛋白的原核表达条件,分析重组蛋白的抗真菌活性。方法:比较不同的诱导温度(25℃、28℃、 30℃、32℃、34℃)、异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)诱导浓度(0.025mmol/L、 0.05mmol/L、0.1mmol/L、0.3mmol/L、0.5mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L)和诱导时间(12h、15h、18h、21h、24h)对AMPs17重组蛋白表达量的影响,筛选AMPs17重组蛋白的最佳表达条件;采用镍离子金属螯合剂亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,SDS-PAGE和ImageJ图像分析系统对表达结果进行分析,Western blot对AMPs17重组蛋白进行鉴定,高效液相色谱分析重组蛋白的纯度,微量液体稀释法及菌落计数法检测其抗真菌活性。结果:在诱导温度为32℃、IPTG浓度为0.05mmol/L的条件下诱导培养15h,AMPs17重组蛋白的表达量最高且最为稳定;HPLC色谱仪分析显示AMPs17重组蛋白纯度可达到90%以上;优化后的AMPs17重组蛋白能有效抑制白色念珠菌的生长。结论:优化了家蝇抗菌肽AMPs17的诱导表达条件,获得了高表达、稳定且具有抗真菌活性的蛋白质,为后续抗菌机制及应用研究提供一定的实验基础。
人类线粒体N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(mitochondrial O-GlcNAc transferse, mOGT)通过其N端基质导向序列(matrix targeting sequence,MTS)定位于线粒体内膜上,mOGT的过表达将导致细胞的凋亡。蛋白质的O-GlcNAc修饰存在于绝大多数真核生物中,而酿酒酵母唯独缺乏该修饰途径。对人体mOGT过表达引起酿酒酵母生长缺陷的机制进行分析,期望利用该模型研究mOGT导致的细胞凋亡调控机制。在酿酒酵母细胞中表达人体mOGT及其截短序列发现:mOGT对酿酒酵母的生长抑制及细胞中的定位依赖于N端全长的MTS序列;MTS序列在酿酒酵母中共表达导致线粒体融合。MTS序列过表达的酿酒酵母菌可以作为研究mOGT引起细胞凋亡的模式细胞。
利用大孔吸附树脂DA-201为载体对海洋脂肪酶固定化,并探寻添加剂对固定化过程的影响。分别以NH4Cl、甘露糖和甘氨酸为添加剂,采用单因素和正交实验相结合的方法优化条件。结果显示,以NH4Cl为添加剂的最优条件:柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液pH 6.0,固定化温度30℃,载体投放量0.5g,NH4Cl浓度25mmol/L,固定化时间3.0h,酶活力达到115.27U/g;比不含有添加剂的固定化酶固定化效率提高47.42%。以甘露糖为添加剂最优条件:磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液pH7.0,固定化温度35℃,载体投放量0.5g,甘露糖浓度10mmol/L,固定化时间4.5h;酶活力达到122.75U/g,比不含有添加剂的固定化酶固定化效率提高6.50%。以甘氨酸为添加剂的最优条件:磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液pH7.0,固定化温度20℃,载体投放量0.5g,甘氨酸浓度为25mmol/L,固定化时间7.5h;酶活力达到141.69U/g,比不含有添加剂的固定化酶固定化效率提高26.12%。采用不同添加剂对大孔吸附树脂DA-201的吸附固定化过程有较大影响,可以极大地提高吸附效率;同时发现缓冲液类型、pH、温度、添加剂浓度和固定化时间等对DA-201树脂吸附脂肪酶有很大影响,对后续吸附固定化工业酶研究有较好的参考价值。
通过目的基因的随机整合方式,构建得到的CHO表达细胞系,常会因为目的基因插入到染色体内不稳定区域,而在长期传代过程中出现表达不稳定的现象,这主要是由于位点效应所导致的。为了解决这个问题,现利用CRISPR/Cas9技术介导的同源重组,将目的基因直接整合于CHO细胞染色体上的稳定表达区域,以克服位点效应带来的CHO表达细胞系的长期表达不稳定。利用该技术总共获得了2株外源基因(人白蛋白基因)定点整合细胞系;Western blot结果显示,细胞上清液的产物具有人白蛋白抗原性;细胞在贴壁状态下,两株细胞系在第3、12、23、35、50代,细胞每日表达的HSA质量接近,且均维持在0.5pg cell/d;选取一株表达细胞系,经悬浮驯化后,在批次条件培养下,第1、25、50代的悬浮细胞,在摇瓶内的表达浓度均稳定在13~14mg/L。显示了将外源基因定点整合于CHO细胞基因组内的可行性;且外源基因整合在稳定表达区域后,重组细胞系具有对外源基因长期表达的稳定性。
目的:在大肠杆菌宿主中过量表达丁二酮还原酶(DAR),同时构建辅酶NADH原位再生系统,利用全细胞高效催化丁二酮不对称还原合成(S)-乙偶姻。方法:PCR克隆多黏芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)dar基因连到质粒pETDuet-1,转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),构建重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR;通过HiTrap TALON柱亲和层析纯化表达产物DAR酶蛋白,测定DAR的比酶活和分子动力学参数。在重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR中构建辅酶NADH原位再生系统,协同表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的葡萄糖脱氢酶(GDH),构建重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH,并以此重组菌为全细胞生物催化剂,优化催化条件,提高(S)-乙偶姻的产量和产率。结果:获得重组工程菌E.coli BL21(DE3)-DAR和E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH。DAR以NADH为辅酶还原丁二酮的米氏常数Km、最大催化速率Vmax、催化常数Kcat分别为2.59mmol/L、1.64μmol/(L·min·mg)、12.3/s,还原丁二酮生成(S)-乙偶姻光学的纯度为95.86%,具有较好的催化效率和立体异构体选择性。构建辅酶NADH原位再生系统后,重组菌E.coli BL21(DE3)-DAR/GDH可高效催化丁二酮合成乙偶姻。在最优催化条件下分批补料,乙偶姻产量达51.26g/L,转化率为81.37%,生产速率为5.13g/(L·h)。结论:使用非手性化合物原料丁二酮生产高附加值的手性化合物(S)-乙偶姻,以重组菌为全细胞生物催化剂合成(S)-乙偶姻,不需额外添加昂贵的辅酶,具有较高的生产应用价值。
目的:大肠杆菌中分泌表达重组蛋白受限于其分泌效率,为此设计构建大肠杆菌诱导裂解系统以实现胞内重组蛋白的快速高效分泌。方法:利用大肠菌素E7对细胞的裂解能力,构建共表达目标重组蛋白和E7的大肠杆菌细胞裂解系统,使目标重组蛋白在E7表达后得以释放到培养基中。结果:首先以红色荧光蛋白(red fluorescent protein, RFP)为报告基因,在pET28a(+)载体上构建大肠杆菌素E7和红色荧光蛋白两个表达盒,通过对比分析IPTG一步诱导和IPTG-阿拉伯糖分步诱导系统蛋白质的表达效果,发现分步诱导系统能够更高效地表达并释放目标蛋白到培养基。在IPTG-阿拉伯糖分步诱导裂解系统中表达玉米赤霉烯酮降解酶基因,培养基上清液中检测到玉米赤霉烯酮降解酶有较好的表达量和较高的活性,能够在37℃反应30min的条件下降解约5.8μg玉米赤霉烯酮毒素。结论:利用大肠菌素E7成功构建大肠杆菌细胞裂解系统,并且此系统在快速释放胞内表达外源蛋白方面有适用性。
猪支原体肺炎是由猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae,Mhp)引起的一种存在于世界各地的严重危害养猪业的疾病,严重影响饲料报酬,造成巨大的经济损失。准确、敏感、快速的Mhp检测方法有助于了解Mhp在猪群的流行情况,进而采取相应的预防、治疗和综合防控措施。对国内外Mhp病原学、分子生物学和免疫学检测方法进行了综述,为科技工作者全面了解Mhp检测方法提供参考资料。
PR结构域蛋白16(PR domain-containing 16,PRDM16)是棕色脂肪细胞分化过程的重要转录因子,其对维持棕色脂肪细胞的特殊形态特征及细胞功能具有重要的作用。PRDM16不仅能调控棕色脂肪细胞的分化,而且可能是脂肪细胞和肌细胞相互转化的“开关”,还与白色脂肪细胞的米色化过程相关。研究发现,人和家畜的PRDM16基因具有丰富的SNPs位点,这些SNPs位点与人类疾病和家畜生产性状之间存在着一定的相关性。鉴于PRDM16在脂肪分化和人类健康等方面的重要性,综述了近十几年来国内外研究者在PRDM16基因与PRDM16蛋白的结构与功能、该基因与疾病和家畜经济性状的相关性等方面的研究成果,并展望了PRDM16的未来研究方向与在人类疾病治疗和动物性状改良方面的应用前景。
诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)是利用细胞重编程技术人工获得的与胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)功能类似的细胞,能分化成包括三胚层在内的所有细胞类型,并且规避了ESCs的伦理学争议和移植后的免疫排斥问题,具有十分广阔的应用前景。对iPSCs体外诱导为生殖细胞所用的诱导物及其诱导效果进行了综述,生殖细胞发育机制的研究有望促进未来生殖和发育技术的进步。
工程细胞的单克隆源性是保证产品质量的重要因素之一,因此得到了越来越多的重视。当前,药物审评机构要求报批单位采用合适的实验手段证明所使用细胞的单克隆源性。综述通过介绍生产用工程细胞株单克隆的挑选过程及诸如有限稀释法、ClonePix、流式细胞术等常用方法,讨论如何确保工程细胞的单克隆源性,以及在生物药品生产过程中保证工程细胞单克隆源性的意义。
细菌中普遍存在L/D型氨基酸,与L-氨基酸(L-AAs)不同,D-氨基酸(D-AAs)不参与蛋白质合成,而与细胞壁肽聚糖的合成有关,直接影响细菌细胞壁的形状、数量和强度。D-AAs在细菌表征、药物抑菌性、靶标确定等方面具有重要的作用。目前,外源添加D-AAs参与肽聚糖合成的机制已有一些研究进展,其荧光衍生物已应用于细菌可视化,特异性探测细胞壁形成/重塑、细菌生长和细胞形态。但D-AAs如何影响细菌生长及其抗逆性的机制尚未研究清楚。对D-AAs的研究现状进行综述,重点介绍D-AAs在细菌中的生物合成机制和参与细胞壁合成的机制、非典型D-AAs对细菌的调控以及在细菌可视化中的应用,并对D-AAs未来研究方向进行了展望。
合成生物学是生物学、工程学、化学和信息技术等相互交叉融合的一个新兴领域,在医学、药物、农业、材料、环境和能源等领域具有广阔的应用前景,甚至可能创造出自然界中没有的新生物,被视为生物科技领域的颠覆性技术。分析了合成生物学领域主要国家和地区的相关发展战略、资助项目和政策措施,总结了合成生物学领域专利技术的发展历程,揭示了该领域的专利研发主题分布情况,综合对比分析了该领域的主要国家和主要机构的专利产出情况,以期为我国合成生物学领域的科研工作者和管理决策者提供参考数据。
