目的:探讨长链非编码RNA SNHG3对人乳腺癌细胞MCF-7增殖、迁移与侵袭的影响。方法:构建SNHG3过表达质粒,实验分别设置阴性对照组(pcDNA-3.1+)与SNHG3基因过表达组(pcDNA-3.1+/SNHG3)。将MCF-7细胞转染对照组质粒和SNHG3过表达质粒,采用实时定量PCR 方法检测 SNHG3 mRNA 转录水平,Western blot 检测MMP9及EMT相关蛋白质水平;集落形成实验检测MCF-7细胞增殖能力;划痕愈合实验检测MCF-7细胞横向迁移能力; Transwell 小室实验检测MCF-7细胞纵向迁移能力及侵袭能力。结果:过表达SNHG3后,MCF-7细胞中SNHG3的mRNA水平显著增高(P<0.001);MCF-7细胞的体外增殖能力明显增加(P<0.01),迁移(P<0.01)与侵袭能力(P<0.001)也显著增强,实时定量PCR, Western blot 结果显示SNHG3可激活EMT相关通路。结论:过表达SNHG3可能通过激活EMT通路促进乳腺癌MCF-7细胞的增殖,迁移与侵袭。
古紫质4(archaerhodopsin 4,aR4)与细菌视紫质(bacteriorhodopsin,bR)同属于盐杆菌科,同源性59%,均为光驱质子泵。其功能是在光照条件下将质子由胞内泵到胞外形成跨膜质子梯度,该梯度差被膜上另外一种蛋白ATP合成酶用于ATP的合成,从而完成光能向生物能的转化。aR4和bR具有相似的光循环过程,但质子传递时序不同,aR4是先从胞内吸收质子再将质子释放到胞外,而bR恰好相反。甲硫氨酸-145是位于bR视黄醛发色团键合区的一个重要残基,对其光循环有着重要的影响,而在aR4中处在相应位置上的苯丙氨酸-146是其视黄醛键合区与bR唯一不相同的残基。因此通过定点突变,采用紫外可见吸收光谱、动力学光谱、质子泵功能检测、低温透射红外光谱等手段对比分析研究M145F和F146M单点突变对bR和aR4光循环造成的影响,有助于深入理解aR4结构与功能的关系。研究结果表明,M145F突变造成了bR光循环L的丢失和质子泵功能的减弱,而F146M突变并未对aR4的光循环造成显著影响,且突变后aR4质子释放时序没有反转,表明该位置上的残基在两个体系中的作用不尽相同。
目的:对美洲大蠊内生黏质沙雷氏菌几丁质酶ChiA基因进行克隆、可溶性表达及功能验证。方法:PCR扩增ChiA基因,TA亚克隆,构建重组表达载体ChiA/pET21b,生物信息学分析和低温诱导表达、SDS-PAGE、Western blot鉴定,打孔法对几丁质酶活性检测。结果:PCR成功扩增了ChiA基因序列,该序列与GenBank上的S.marcescens ChiA基因序列同源性达99%;该序列编码571个氨基酸,并能够在原核系统中稳定表达。可溶性表达分析显示:通过低温诱导表达,获得可溶性的目的蛋白;活性试验发现:含目的蛋白的表达产物可分解几丁质,且活性强于美洲大蠊内生黏质沙雷氏菌。结论:从美洲大蠊内生黏质沙雷氏菌基因组中成功克隆了几丁质酶ChiA基因,通过原核表达系统获得了具有较强活性的可溶性几丁质酶ChiA,为其应用奠定了基础。
Kex2蛋白酶是一种来源于酵母的前体加工蛋白酶。利用毕赤酵母(Pichia pastoris)同源表达来源于毕赤酵母的Kex2蛋白酶(PPKex2),研究其表达特性和酶学性质,同时与毕赤酵母表达的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)Kex2蛋白酶(SCKex2)进行比较。首先,分别从毕赤酵母和酿酒酵母基因组中获得Kex2基因,将其插入到表达载体pPIC9K中,并转化毕赤酵母菌株GS115。重组菌株经甲醇诱导表达后,结果表明PPKex2的发酵上清液比活是SCKex2的7倍。Kex2蛋白酶经Q-FF强阴离子交换柱纯化后进行酶学性质研究。酶学性质研究结果表明,PPKex2的最适反应pH是8.0~9.0,最适反应温度是37℃,与SCKex2性质相近。在稳定性方面,PPKex2在pH 7.0时最稳定,在碱性条件下的稳定性高于SCKex2,在酸性条件下的稳定性低于SCKex2,另外PPKex2的温度稳定性略低于SCKex2。酶促反应动力学研究表明,PPKex2的kcat和kcat/Km值分别为SCKex2的4.8倍和3.3倍。首次报道了同源表达毕赤酵母Kex2蛋白酶的表达特性及酶学性质,为其今后的研究及应用奠定了基础。
Tpl2是调节I型(IFNα/β)和II型(IFNγ)IFN的关键调控因子,对病毒感染期间产生有效免疫应答至关重要。为了建立支持流感病毒高效繁殖的新型MDCK细胞系,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Tpl2基因敲除的MDCK细胞,绘制其细胞生长曲线;根据《中国药典》第三部,对细胞进行形态检查、内外源因子和致瘤性检测;流感病毒接种细胞(MOI=0.1),测定12h、24h、48h、72h细胞培养上清的血凝滴度及72h TCID50滴度。结果：靶基因组测序结果显示,获得一株稳定敲除Tpl2的MDCK细胞(MDCK-Tpl2 -/-);其与亲本细胞生长速率无显著差异,均为贴壁、上皮样细胞形态;细胞内细菌、真菌、支原体、病毒及致瘤性检测均为阴性;病毒接种后12h、24h、48h、72h,MDCK-Tpl2 -/-细胞培养上清的血凝效价提高了1.78~2.5倍。病毒接种后72h,MDCK-Tpl2 -/-细胞培养上清病毒的TCID50滴度提高了2.8倍。结果表明,利用Tpl2缺陷型MDCK细胞系可以提高流感病毒产量,为提升疫苗质量奠定基础。
目的:制备具有碱性成纤维细胞生长因子缓释性能手术缝纫线的复合材料,并探究其机械性能和体外释药情况。方法:利用静电纺丝技术,通过研究复合材料中物质成分的配比,优化包载效率,并研究聚己内酯-胶原复合结构 (PCL-Col) 对可控释放 bFGF 的影响来制备具有生物活性与药物缓释性能的手术缝纫线;观察缝纫线微观结构,检测缝纫线机械性能和载药量。结果:通过扫描电镜结果证明载药的手术缝纫线具有完整的线状结构。进一步通过拉伸与拉伸循环实验证明缝纫线具有良好的机械性能,最后通过酶联免疫吸附实验 (enzyme linked immunosorbent assay,ELISA) 证明所制备的手术缝纫线具备一定的药物缓释性能。结论:通过静电纺丝装置,优化纺丝参数,成功制备了PCL-Col-bFGF的手术缝线复合材料。该缝纫线满足缝合所需要的机械性能同时具备一定的bFGF缓释性能。
在采用前期已构建的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET20b(+)-hic进行高密度发酵制备角质酶时发现,在高诱导强度发酵时,菌体浓度下降明显。同时,通过测定纯化重组角质酶的磷脂水解活性,考察验证了重组酶对宿主细胞的损伤作用。重组酶的磷脂酰乙醇胺活性为9.8U/mg(NPB水解比活力为1 047.6 U/mg),在卵黄平板出现了明显的反应圈现象。在此基础上尝试了高菌体浓度结合高诱导强度的发酵策略,以进一步提高重组酶在3L罐中的表达水平。优化后的最佳条件及结果为:OD600为75时,恒速流加0.8g/(L ·h)的乳糖溶液,发酵24h后,酶活达到最大值4 788.0U/ml,约为摇瓶发酵酶活的28倍,与OD600为50时、流加0.2 g/(L ·h)进行诱导的发酵策略(酶活2 233.0 U/ml)相比,提高幅度约为114.0%,发酵时间缩短40.0%。
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas(CRISPR-associated)系统是近年来发展起来的新型的基因编辑技术,在生物医学领域得到广泛应用。CRISPR/Cas9系统需要在gRNA存在的条件下通过Cas9蛋白实现对基因组的定点编辑,通常情况下以慢病毒感染或质粒转染等方式提供Cas9和gRNA。但是,这些方式容易引起免疫反应及基因片段不可控插入,存在一定的风险,限制了CRISPR/Cas9技术在机体的应用。近年来发展起来的基于体外组装的核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)转导入胞的策略由于快捷安全、编辑的脱靶率低等优势引起广泛关注。对Cas9 RNP的转导方式及其应用进行了总结,并就其目前存在的问题进行探讨,以期为CRISPR/Cas9技术的进一步发展提供依据,为拓展其应用奠定基础。
成纤维细胞生长因子14(FGF14)是成纤维细胞生长因子家族中一员,主要在发育中及成熟的神经系统中表达。研究发现,FGF14在退行性神经系统中的脊髓小脑共济失调27型中发挥着重要的作用,FGF14的功能与各种离子通道关系密切,以钠离子通道为主,活性被神经元的兴奋性调节。根据FGF14的特点,归纳总结了FGF14目前的研究进展,为FGF14的基础和工程化研究提供理论依据。
重组蛋白/多肽类药物在人体血清内半衰期较短, 很大程度上限制了其临床应用。人血清白蛋白(HSA)具有半衰期长、生物相容性好、低免疫原性等优点,是理想的药物载体。各种基于HSA的蛋白质药物长效化技术得到了广泛的应用和发展,目前主要包括构建HSA融合蛋白,通过共价化学键与HSA偶联,通过非共价键与HSA可逆性结合。总结了近年来基于白蛋白药物长效化技术的发展,各项技术的优缺点及药物开发现状。
乙型肝炎(乙肝)病毒(hepatitis B virus,HBV)是引起病毒性乙肝的主要病原体,依然是影响人类健康的全球性问题。干扰素和核苷(酸)类似物是国内外获批上市的主要抗乙肝病毒药物。替诺福韦和恩替卡韦在国外抗乙肝病毒药物市场上占据巨大的份额,而早期推出的拉米夫定和阿德福韦酯因其耐受性和安全性等原因所占市场份额逐年减少。国外有39种抗乙肝病毒新药正处于临床阶段。国内临床上使用更多的是口服核苷(酸)类似药物,尤其是恩替卡韦近年来占近一半抗乙肝药物市场。抗乙肝病毒药物城市零售前10的企业市场份额占整个零售的91.8%,市场集中度较高。虽然国内乙肝新药研发水平与欧美还存在较大差距,但是在国内创新政策推动下,出现了东阳光、正大天晴等20余家从事研发企业,并取得一定的成效。基于我国抗乙肝病毒药物发展困境,提出了继续完善抗乙肝病毒药物医保政策、部署和实施乙型肝炎重大专项等研发项目、推进产学研用深度融合等对策建议。
目的:构建适用于干细胞专利价值评估的指标模型,并对现实场景中除指标内容外影响干细胞专利转移转化的因素进行分析。方法:基于中国技术交易所《专利价值分析指标体系》构建适用于干细胞的专利价值评估体系,采用层次分析法确定权重,通过案例分析验证指标模型的可操作性。结果:基于干细胞的技术特点与指标可操作性构建了适用于干细胞专利价值评估的指标体系,包括技术价值度、市场价值度和法律价值度3个一级指标,技术先进性、技术成熟度、技术成本等9个二级指标,其中,技术先进性、技术成熟度、政策适应性以及市场需求是对干细胞专利价值评估影响力最大的指标。其他因素的分析中,技术核心优势是影响干细胞专利转移转化的关键,此外,技术可行性、质量控制与远期收益均对干细胞技术的成功转移转化有着重要的影响。结论:建立的专利价值评估模型与因素分析可用于干细胞领域的专利价值评估,有助于推动专利技术的有效开发和产业化。
