β2糖蛋白Ⅰ (beta 2- glycoprotein Ⅰ,β2GPⅠ) 是抗磷脂综合征(antiphospholipid syndrome,APS) 血清中抗磷脂抗体(antiphospholipid antibody,aPL)的主要抗原。β2GPⅠ 通过第五结构域与阴性磷脂oxLDL结合,进而被aPL识别,是APS动脉血栓发生的关键事件。该研究构建了编码β2GPⅠ第五结构域(β2GPⅠ-DⅤ)、β2GPⅠ-DⅤ突变体及β2GPⅠ-DⅤ的Phe280-Ala320片段的原核表达载体,对其进行诱导表达和纯化,解析了β2GPⅠ-DⅤ与阴性磷脂结合的分子机制,结果表明,β2GPⅠ-DⅤ中Cys281-Cys288以及Ser311-Lys317区段在空间上维持一定构型是与CL结合所必须的前提条件,而C245-C296,C288-C326两个二硫键在维持二者空间构型方面起到一定的作用。在此基础上,进一步检测了具有结合CL生物学活性的rDⅤ结合oxLDL以及APS血清中oxLDL的活性,表明rDⅤ具有与天然β2GPⅠ相一致的生物学活性。该研究获得的rβ2GPⅠ-DⅤ,以及与oxLDL结合的方法体系的建立,为APS早期实验室诊断奠定基础。
目的:为真核表达猪白细胞介素17(IL-17),研究产物在细胞培养下的免疫生物活性。方法:通过PCR扩增出猪IL-17基因并插入到真核表达载体pVAX1,然后转染到IPEC-J2细胞、HaCaT细胞和L02细胞中。在转染后第24、48和72h收集细胞,第48h收集上清液。收集细胞通过实时荧光定量PCR检测相关免疫基因的表达水平,收集上清液通过抑菌试验检测相关抗菌肽的生物活性。结果:采用pVAX1载体构建了表达猪IL-17的重组质粒,转染到细胞中。证实IL-17基因能诱导抗菌肽基因(RegⅢ、S100A8和BD2)的表达,显著上调JAK-STAT信号通路基因(JAK1、STAT1和STAT3)和细胞因子基因(IL-6、IL-12和TNF-α)的表达。此外,细胞上清液能够在不同程度上抑制大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的增殖。结论:成功将猪IL-17基因真核表达,其表达产物能诱导效应细胞表达多种细胞因子,产生多种抗菌肽,具有抑菌能力;这为进一步研发猪IL-17作为抗菌免疫分子制剂奠定了初步基础。
R-2-卤代酸脱卤酶能立体选择性水解R-2-卤代酸。解析酶的单晶结构对提高酶的选择性和活性提供了直接的结构指导,是目前酶结构领域研究的前沿。以实验室前期得到的来自假单胞菌ZJU26的R-2-氯丙酸脱卤酶(DehDIV-R)为研究对象,采用X射线衍射晶体法进行结构解析。采用ppSUMO载体融合表达DehDIV-R蛋白,依次通过Ni-NTA亲和层析、透析酶切、二次Ni-NTA亲和层析以及凝胶过滤层析纯化得到单一条带,且均一性好的蛋白。接着对结晶条件进行初筛与优化,得到的最佳结晶条件为0.1mol/L HEPES pH 7,12% PEG 6 000,0.2mol/L MgCl2 ,8mmol/L CHAPS。晶体在上海同步辐射光源BL18U1线站上收集衍射数据,采用分子置换法成功解析获得了分辨率为2.35?的DehDIV-R的晶体结构。Ramachandran图表明98.02%的氨基酸位于最适区,证明了该结构的合理性。DehDIV-R的纯化、结晶以及结构解析为进一步深入了解其结构和功能奠定了基础。
目的:运用Cre/Loxp重组酶系统构建肝脏特异性CD36基因敲除小鼠并进行鉴定和验证,为研究CD36的生物学功能奠定基础。方法:构建CD36打靶载体,电转转染胚胎干细胞,通过长链PCR筛选出正确同源重组的阳性克隆,阳性胚胎干细胞克隆经扩增后,注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得嵌合小鼠,再与Flp小鼠交配筛选获得Flox杂合子小鼠,该小鼠与引进的Alb-Cre小鼠交配,在F3代获得CD36fl/fl:Alb-Cre+基因型小鼠,即为肝脏特异性CD36敲除小鼠。采用PCR鉴定小鼠基因型,PCR、实时荧光定量PCR和Western blot验证小鼠肝脏CD36敲除效果,Western blot检测小鼠肾脏、脂肪和心肌组织CD36表达情况,HE染色观察小鼠肝脏形态学改变。结果:建立了CD36基因的Flox杂合子小鼠,与Alb-Cre小鼠交配后,在F3代筛选出CD36fl/fl:Alb-Cre-和CD36 fl/fl:Alb-Cre +基因型小鼠,DNA水平证实CD36 fl/fl:Alb-Cre +基因型小鼠肝脏CD36基因通过Cre/Loxp重组酶系统被敲除。与CD36 fl/fl:Alb-Cre -基因型小鼠相比,CD36 fl/fl:Alb-Cre +基因型小鼠肝脏CD36mRNA和蛋白表达水平显著降低,肾脏、脂肪和心肌组织CD36蛋白表达无差别,肝脏形态学特征无明显差异。结论:通过Cre/Loxp重组酶系统成功构建了肝脏特异性CD36基因敲除小鼠,为研究CD36在肝脏代谢和肝脏疾病中的功能提供了动物模型。
目的:筛选高表达单克隆细胞株,并通过优化培养基及流加物,最终达到提高目的蛋白产量及质量的目的。方法:通过有限稀释法对转染目的蛋白的CHO-S细胞进行单克隆化,应用双抗夹心ELISA方法对单克隆细胞株抗体表达量进行初步评估,最后根据筛选细胞株的活率、密度、产量及代谢情况,选择2~3株单克隆细胞进行培养条件优化,并对获得的发酵液进行纯化捕获,根据抗体蛋白表达量、糖型、等电点、纯度、酸碱峰分布等进行相应的评估分析,筛选出最优细胞株及最优培养方案。结果:经过单克隆化处理以及培养条件优化,蛋白的表达量由初始的不到500mg/L提升到2 290mg/L,且抗体蛋白纯度高达97.48%。抗体蛋白质量分析结果显示B1方案为该实验最优培养方案。结论:通过细胞株筛选、培养基优化能显著提高抗体蛋白的产量及质量,同时对抗体蛋白糖型、等电点、纯度等均有一定程度的优化。因此工业生产中可以通过高表达克隆的筛选、培养工艺优化等对目的蛋白产量及质量进行一定程度的改善与提高,对后期实验研究及工业化方案开发都具有很好的指导意义。
乳糖是婴幼儿获取能量的重要碳源之一,但乳糖需要在乳糖酶的作用下水解成半乳糖与葡萄糖后才能被吸收。缺少乳糖分解酶的婴幼儿在摄入含乳糖的食品后,未被消化的乳糖会直接进入大肠,刺激大肠蠕动加快,造成一系列不适应症状即乳糖不耐症,我国属于乳糖不耐症高发国家。因此,解决乳糖的体外水解问题对减轻该症状有重要的意义。研究通过将β-半乳糖苷酶(也称为乳糖水解酶)表面展示在食品安全微生物解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)细胞表面,通过培养获得该酵母,然后直接利用酵母细胞来水解乳糖生成半乳糖与葡萄糖。采用该工程酵母细胞(HCY10),能在24小时内完全水解50g/L的乳糖,生成半乳糖与葡萄糖。该方法具有高效、简便的优点,能为乳糖的高效水解提供一条新的途径。
昆虫细胞-杆状病毒载体表达系统(baculovirus expression vector system,BEVS)是病毒样颗粒亚单位疫苗(virus like particles,VLPs)的理想生产平台。动物细胞培养过程分析技术(process analytical technology,PAT)研究的重点在于更多地获取与细胞生理状态相关的过程参数,以及实现过程敏感参数的在线表征和过程控制关键时间节点的在线判定,从而指导过程优化和控制。通过昆虫Sf9细胞的分批和补料悬浮培养,发现细胞代谢活性与在线特征频率(fc)之间存在相关性。以fc作为细胞代谢活性的在线指征,在细胞代谢活性下降之前补料,使得Sf9细胞在代谢活性明显增强的基础上,最高活细胞密度提高1.75倍。通过分批培养与补料分批培养过程细胞生理特性参数的相关性分析,发现比电容增长速率(με)与培养体系S-期细胞比例之间存在相关性,με作为细胞增殖活性状态的在线指征参数,可以作为最佳接毒时间的判定依据。此外,研究还发现在线检测参数电容(ε)与最高疫苗产量之间存在相关性,可以作为疫苗最佳收获时间的在线表征参数。以在线fc值作为补料时间指征,以在线με值作为病毒感染时间指征,以在线ε值作为病毒收获时间指征,实现了猪圆环病毒2型(PCV2)VLPs的高效生产。相比于批培养,基于PAT的生产工艺疫苗单位体积产量提高76%,生产周期缩短了24h,为PCV2病毒样颗粒亚单位疫苗大规模生产提供了一种新的高效生产模式。
以ε-聚赖氨酸产量为1.60g/L的Streptomyces albulus M-Z18为出发菌株,利用核糖体工程技术选育具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株,并对高产菌株和出发菌株的生理生化性能进行比较。通过链霉素诱变成功选育出了1株遗传稳定的ε-聚赖氨酸产生菌S.albulus S-7,ε-聚赖氨酸产量为2.03g/L;对S.albulus S-7叠加巴龙霉素,获得1株遗传稳定的具有双重抗性的ε-聚赖氨酸产生菌S.albulus SP-14,ε-聚赖氨酸产量为2.37g/L,比出发菌株S.albulus M-Z18的ε-聚赖氨酸产量增加了48.10%。使用链霉素和巴龙霉素选育具有双重抗生素抗性的ε-聚赖氨酸高产菌株是一种有效的手段。
近年来,哺乳动物细胞培养技术发展迅猛,基于此技术的生物制药行业更是异军突起。在激烈的生物药市场竞争中,缩短研发时间和降低研发成本是制胜的关键。与传统的生物反应器相比,高通量微型生物反应器具有操作简单、运行通量高、实验重复性好等优点,可大大缩短研发周期,降低人力、物力成本,因此成为了生物制药行业最新的研究热点之一。目前,已成功应用于生物药物研发的微型生物反应器有Simcell TM、Ambr 15 TM、Ambr 250 TM等,分别适用于工艺开发中的不同阶段。以上述三种微型生物反应器为例,介绍高通量微型反应器在哺乳动物细胞培养工艺开发中的研究现状及发展前景。
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs) 具有很强的自我复制能力和多向分化潜能,是近年来热门研究的种子细胞。MSCs的生长微环境可以影响调控干细胞的生长、分化,力学刺激是MSCs分化的影响因素之一。细胞外基质硬度、机械应力(剪切力、静压力、牵张力)、微重力等因素对MSCs的分化作用是当前研究的热点。就细胞外基质硬度、机械应力以及机械应力作用于三维支架培养对MSCs分化的影响等方面进行综述。
甜菜素是一种植物源的水溶性天然含氮色素,用于食品添加剂和化妆品等行业中。在植物中甜菜素和花青素色素互不共存,其代谢途径是重要的植物化学分类指标。甜菜素兼具抗氧化、抗肿瘤、抗疟、保肝等药理作用,其潜在的医疗保健价值以及其代谢途径的独特性,促进了对甜菜素深入研究。综述了甜菜素合成途径中的关键酶和合成生物学策略生产甜菜素的国内外研究进展,为建立合成生物方法生产甜菜素提供参考。
在细菌生长过程中,细胞壁起到维持细胞形状和完整性,抵抗内部膨胀压的作用。细胞壁的合成、分裂、再生、循环再利用等与细菌自身生长繁殖和应对环境压力息息相关。目前,细胞壁生长机理,细菌如何调控细胞壁生长及如何与其他细胞过程相协调的机制尚未研究清楚。细胞壁调控机制的解析对了解细菌细胞壁功能、确定药物的作用方式和发展新一代的治疗方法至关重要。对细菌调控细胞壁生长机制的国外研究进展进行了概述,重点阐述了支架蛋白、转录因子、非编码小RNA及蛋白相互作用调控细胞壁的合成、细胞分裂、压力响应的机制,总结了细胞壁调控机制在抗菌药物研发中的应用,并对未来的研究方向进行了展望。
专利是技术的有效载体,通过专利态势分析可以在一定程度上有效掌握技术发展脉络及发展趋势。基于专利信息,采用定量数据、定性调研与专家智慧有机结合的方法,从申请趋势、保护市场、领域分布、重要专利权人等多维度分析视角进行农业生物技术领域专利技术态势分析。通过专利态势分析掌握全球农业生物技术专利保护概貌,指出重点方向。在此基础上结合中国农业生物技术领域专利法律状态和专利转让许可状况探讨中国农业生物技术专利保护现状及存在问题,以期支撑中国农业生物技术领域的创新决策。
