对人源类溶菌酶蛋白6(human lysozyme-like protein 6,LYZL6)在受精过程中的作用进行研究,并对重组LYZL6蛋白(recombinant LYZL6,rLYZL6)的生理特性进行分析,从而揭示其生理功能。细胞免疫荧光法确定LYZL6定位于成熟精子头部的顶体后区域,反转录PCR(RT-PCR)分析表明精子表面的LYZL6蛋白来源于睾丸和附睾的分泌,Western blot法分析表明精子获能前后表面LYZL6的量无明显改变。半透明带结合实验和精子穿透实验分析表明兔抗LYZL6血清未明显抑制人精子结合透明带,但可明显抑制精卵融合。利用毕赤酵母表达系统成功表达了rLYZL6,使用甲壳素亲和层析和凝胶过滤层析可从发酵上清中纯化到具有生物活性的rLYZL6。酶联免疫吸附法(ELISA)分析显示rLYZL6不具有透明质酸结合能力、透明质酸水解能力和自由基清除活性,但具有较强的肽聚糖结合能力和异肽酶活性。LYZL6由睾丸和附睾分泌后定位于成熟精子头部的顶体后区域,可以参与精卵融合,并具有肽聚糖结合能力和异肽酶活性,提示LYZL6可能通过多种机制参与精子功能。
为初步探讨Herpud1在肾脏发育中的生物学作用,过表达Herpud1载体及敲低Herpud1载体被构建。载体被转染进后肾间充质细胞,通过RT-PCR和蛋白质免疫印迹检测了上皮间质的转换过程(EMT)的标志蛋白E-钙黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、Snail蛋白及内质网应力的标志蛋白葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、真核起始因子2α (eIF2α)的表达变化,通过EDU细胞增殖实验检测了Herpud1对细胞增殖的作用,同时利用细胞划痕实验验证了细胞的迁移能力。结果显示,与空白对照组相比,在Herpud1过表达的实验组中,E-cadherin的表达在mRNA和蛋白质水平均是降低的,而Snail和Vimentin的表达则是上升的,并伴随着细胞增殖活性的降低和细胞迁移能力增加,同时内质网应力相关蛋白GRP78和eIF2α是升高的。在Herpud1敲低的实验组,E-cadherin的表达在mRNA和蛋白质水平均是升高的,而Snail和Vimentin的表达下降,细胞迁移能力是降低并且细胞增殖活性升高,同时内质网应力相关蛋白GRP78和eIF2α也是降低的。这些结果证明Herpud1可以促进MK3细胞EMT过程,提高细胞的迁移能力,抑制细胞的增殖活性,其机制可能与细胞的内质网应力相关。
克隆表达2型猪链球菌中磷酸甘油酸激酶(PGK)并对其酶学特性进行测定。
采用PCR方法从05ZYH33基因组中扩增出pgk片段,构建重组表达质粒pET28a:pgk,经双酶切及测序验证正确的质粒转化入E.coli BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,重组PGK蛋白经SDS-PAGE和质谱鉴定并测定其酶学活性。
PGK在大肠杆菌中可溶性表达,纯化后得到约43kDa的重组PGK蛋白,其酶促反应最适温度为25℃,最适pH为7.5,2型猪链球菌PGK的酶活性为75U/ml,PGK相对于3-PGA的Km值为1.744mmol/L,Vmax为0.143mmol/(L·min),相对于ATP的Km值为2.266mmol/L,Vmax为0.318mmol/(L·min)。
利用原核表达系统成功地表达了2型猪链球菌中的PGK,并获得了活性较好的重组PGK,酶学检测发现纯化的PGK具有良好的体外活性,为进一步研究该病在2型猪链球菌致病及代谢机制奠定了基础。
利用烟草遗传转化体系,研究叶桉(Eucalyptus urophylla)咖啡酸氧甲基转移酶基因(EuCOMT)和咖啡酰CoA氧甲基转移酶基因(EuCCoAOMT)对木质素单体合成的定向调控效果。
分别利用EuCOMT的正义片段、EuCCoAOMT的全长RNAi片段进行单基因和二价基因的烟草转化研究,并对转基因烟草植株中目标基因表达水平、木质素和纤维素的含量、茎部解剖结构及木质素单体含量进行检测。
分别获得了转基因植株C-S(转EuCOMT正义片段)、CR(转EuCCoAOMT全长RNAi片段)、C-CR(EuCOM和EuCCoAOMT二价基因转化)。烟草中转入的正义EuCOMT的片段能够正常表达,而EuCCoAOMT的全长RNAi片段对烟草CCoAOMT基因引发了强烈的抑制。转基因烟草的生长形态、木质素、纤维含量及解剖结构与野生型无显著差异。转基因植株C-S中G木质素含量升高17.72%,S/G值降低17.99%;CR中S/G值升高61.62%,C-CR中G木质素降幅达到57.38%,S/G比值升幅达到114.94%。
抑制CCoAOMT对G木质素合成具有显著的抑制效果,EuCOMT和EuCCoAOMT二价基因转化对S/G比值的定向调控效果最为理想。
叶片衰老是植物生长发育的最后阶段,黑暗、干旱和极端温度等会加速叶片衰老过程,严重影响植物的生长发育和作物产量。bHLH(basic helix-loop-helix)属于转录调控因子中的一个大家族,因具有保守性较高的bHLH结构域而得名,广泛存在于真核生物界。在中间锦鸡儿(Caragana intermedia)转录组数据库中得到一条候选bHLH基因全长序列,将其命名为CibHLH027。正常和黑暗诱导的情况下,CibHLH027-OE株系较WT相比叶片衰老明显,并且黑暗处理后叶绿素含量下降、离子渗透率增大、细胞膜受损严重,说明CibHLH027参与了叶片衰老调控过程。
镉(Cd)是一种重要的环境污染物,其具有半衰期长、不能生物降解等特性使之易于在人体重要脏器中蓄积并对人身体健康造成不可逆的损伤。为此,减少镉的摄入,尤其是经胃肠道,是预防人体慢性镉中毒的有效方法。
方法构建以α-半乳糖苷酶作为筛选标记、表达金属硫蛋白融合蛋白(GST-SUMO-MT)的重组乳酸乳球菌MG1363/pM-GSMT。原子吸收光谱法分析重组乳酸菌对Cd 2+和Zn +的结合能力。以灌胃方式,对雄性Sprague-Dawley大鼠每天口服不同剂量的重组乳酸菌(2×10 9~2×10 11 CFU/d)及CdCl2溶液[5mg/(kg·d)],连续处理56天。收集实验动物肝、肾、脑及睾丸,利用原子吸收光谱法检测这些脏器中镉离子的含量。生化分析检测血清中尿素及丙氨酸转氨酶的含量。石蜡切片及苏木精-伊红染色分析各组织的病理变化。
结果获得不含抗生素抗性的重组乳酸菌MG1363/pM-GSMT,其吸附Cd 2+、Zn 2+能力比对照组分别提高3.52倍和1.60倍。动物实验结果显示,镉能在肝、肾、脑及睾丸中蓄积,并对这些器官造成明显的病理损伤。原子吸收光谱分析、血清生化指标及病理切片结果都显示,重组乳酸菌能有效降低胃肠道中镉的摄入,进而减少Cd 2+在各脏器中的蓄积及对器官功能的损伤。
结论为预防人体食源性慢性镉中毒提供了一种有效的生物材料和使用方法。
SUMO蛋白酶(Ulp1)是切割小分子泛素修饰(SUMO)融合蛋白获得天然N端靶蛋白的一种工具酶,具有酶切效率高、特异性好等优点。但现有市售SUMO蛋白酶Ulp1价格昂贵、操作复杂,限制了SUMO融合体系的运用。利用基因工程技术,合成基因ulp1(Leu403-Lys621),并在N端和C端加入多聚组氨酸标签(His6),构建重组表达载体psvT7-ulp1,将重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)和BL21 trxB(DE3)中。经过高通量筛选技术快速确定最优的表达条件为采用BL21(DE3)作为表达宿主,转接后7h加入IPTG,IPTG的终浓度为0.1mmol/L,诱导时间为16h,最终蛋白质表达量占菌体总蛋白质量的34.5%,重组蛋白Ulp1的表达量为190mg/L,通过Ni-NTA一步纯化即可得到纯度95%以上的Ulp1。通过酶切反应,测定酶活为5.19U/μl,比酶活为5.23×10 4U/mg,是先前报道比酶活的1.87倍,通过酶活动力学分析,Ulp1的表观米氏常数Km=0.359g/L,Vm=5.10μg/(ml·min)。将SUMO融合表达体系用于单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)的表达,得到可溶的SUMO-scFv融合蛋白,使用表达的Ulp1进行酶切并纯化,获得纯度高于90%且N端不含多余氨基酸的scFv,操作步骤简单,显著改善了scFv在大肠杆菌中难以高效可溶性表达纯化的现状。
通过优化PET11b-sTNFαRI 5' mRNA翻译起始区(TIR)二级结构从而提高可溶性肿瘤坏死因子I型受体(sTNFαRI)在大肠杆菌[E.coli BL21(DE3)]中的表达水平。
方法通过对PET11b-sTNFα RI mRNA 5'端TIR区二级结构的自由能及核苷酸位置熵分析,设计相应的引物对mRNA 5'翻译起始区(TIR)相应密码子进行突变,从而使核糖体结合位点(RBS)及起始密码子(AUG)暴露于发夹结构之外,此外将pET11b核糖体结合位点由GAAGGAGA突变为GAAGAA,以利于翻译复合体的组装以及翻译起始。通过基因克隆的方法将5'端TIR区优化后的序列与sTNFαRI序列一起克隆到pET11b载体中,并转化大肠杆菌BL21(DE3),阳性转化子经IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blot检测。
结果通过对PET11b-sTNFα RI 5'TIR mRNA二级结构优化, 经SDS-PAGE和Western blot分析表明重组sTNFαRI的表达水平较优化前提高50%~60%。
结论通过对重组载体翻译起始区(TIR)mRNA序列的二级结构优化可以有效提高目的蛋白的表达水平,对进一步工业化生产具有重要的应用价值。
在医学上,神经系统对神经损伤的自我修复能力往往有限。因此,探索有效修复损伤神经的方法已经成为近年来的研究热点。研究发现脂肪干细胞对各类损伤神经都有一定的修复作用,可作为修复神经损伤的种子细胞。脂肪干细胞不仅具有干细胞的特性而且还具有自身的优点;首先它属于成体细胞,来源于中胚层,具有多种分化的潜能;其次免疫原性较低,易于取材;另外脂肪干细胞移植后的风险较低,因此被认为是修复神经损伤的优秀种子细胞。就脂肪干细胞的特性及脂肪干细胞在神经创伤修复方面的研究进展和存在的问题进行综述。
神经系统疾病是发生于中枢、周围、自主神经系统的以感觉、运动、意识、自主神经功能障碍为主要表现的疾病,是目前对人类危害最大的疾病之一。随着干细胞生物学的发展,人类在诱导干细胞神经分化方面取得了显著进展,并可能会解决神经修复与再生的关键问题。其中,小分子化合物因其在使用的便捷性、可控性和功能多样性等方面的显著优势,正越来越多地被用于干预和研究干细胞的增殖、分化和重编程等生物学行为。针对小分子化合物诱导干细胞神经分化的研究现状作一概述。
CRISPR/Cas9系统是细菌体在长期进化过程中抵御病毒或噬菌体DNA的一种适应性免疫系统。尽管近年来的一些基因编辑技术,如锌指核酸酶、转录激活因子效应物核酸酶等已经给基因编辑带来了许多便利,但CRISPR/Cas9系统以其独特的优势,给基因编辑领域带来了革命性的变化。CRISPR/Cas9系统在生物研究、基因相关疾病的治疗、疾病的基因水平研究等多方面都有广泛的应用。综述近年来CRISPR/Cas9运输系统的研究进展及其在基因缺陷疾病方面取得的应用成果,分析慢病毒和腺相关病毒运载基因编辑元件的利弊,并探讨CRISPR/Cas9系统在基因编辑效率方面的影响因素及仍然存在的问题。
赖氨酰内肽酶是一种重要的工具酶,广泛应用于科学研究及工业化生产。目前市场上的赖氨酰内肽酶大多是从天然微生物中提取获得,其高昂的价格限制了其广泛运用,重组表达能够解决产量的难题。首次对赖氨酰内肽酶进行了综述,包括赖氨酰内肽酶的来源、结构、功能性质及其主要应用,并重点总结了近年来的重组表达进展,同时对今后的研究方向进行了展望。
猪链球菌是一种传染性革兰氏阳性菌,是严重影响养猪业发展的重要人畜共患病原体,造成人类死亡率在5%~20%。其毒力因子在致病过程中发挥着重要作用。近年来对猪链球菌2型的毒力因子研究有诸多新的进展,对其致病机制的了解和对该病有效防控都有新的认识。对近些年研究2型猪链球菌毒力相关因子,对蛋白质类、酶类研究的新进展,同时对毒力因子基因表达双组分系统、与宿主免疫系统相互作用的IV型分泌系统的进展进行总结和分析,以期为猪链球菌病的治疗和疫苗的研制提供新参考。
抗坏血酸在植物的生长发育和抗逆过程中具有重要作用。主要概述了抗坏血酸在模式植物和园艺植物中的代谢途径,并且从转录水平、翻译水平和遗传转化等方面综述了多个不同基因对抗坏血酸水平的调控机制。以期为深入研究抗坏血酸在植物(尤其是园艺植物)中的代谢调控机制提供参考。
