目的: 探讨S100A9在乙型肝炎病毒X(HBx)介导的HepG2细胞增殖及迁移中的作用。方法: 用表达HBx蛋白的重组腺病毒AdHBx感染HepG2细胞后,用CCK-8实验检测细胞增殖能力及划痕愈合实验检测细胞迁移能力;在HepG2/AdHBx细胞中转染S100A9-siRNA及其对照siRNA后,检测HepG2细胞增殖及迁移能力;在HepG2/AdHBx和对照组HepG2/AdGFP细胞中,采用Real-time PCR及Western Blot检测S100A9基因及蛋白的表达情况;在HepG2/AdHBx细胞中,加入不同剂量的NF-κB抑制剂BAY11-7082后,检测各组中S100A9的基因及蛋白表达情况。结果: HBx促进HepG2细胞的增殖与迁移;S100A9-siRNA抑制S100A9的表达后,HBx促进HepG2细胞的增殖与迁移的作用降低,HBx介导的HepG2细胞的增殖与迁移部分依赖于S100A9;S100A9基因及蛋白表达在HepG2/AdHBx中较对照组HepG2/AdGFP显著升高,HBx可致S100A9表达增加;抑制NF-κB转录活性后,AdHBx+BAY11-7082组S100A9基因及蛋白表达较对照组显著降低,阻断NF-κB转录活性可部分抑制HBx调控的S100A9表达。结论: HBx可调控S100A9的表达且与NF-κB活化有关, S100A9参与 HBx介导的HepG2细胞的增殖与迁移。
目的: R2R3-MYB类转录因子参与调控植物初生和次生代谢。方法: 从中间锦鸡儿(Caragana intermedia)干旱转录组数据库中搜索并克隆了一个R2R3-MYB基因,命名为CiMYB15(GenBank登录号MH678649);将CiMYB15基因编码区转入野生型拟南芥中,利用分光光度法测定了野生型和转基因拟南芥中总黄酮含量,并用qRT-PCR检测了转基因植物中AtCHS基因的表达情况。同时采用染色体步移法克隆了CiMYB15基因的启动子序列。结果表明:(1)CiMYB15基因gDNA长度为1 960 bp,包含三个外显子(134、131和521 bp)和两个内含子(281和893 bp);开放阅读框长度为786 bp,编码262个氨基酸。(2)克隆得到1 580 bp的启动子序列,序列中主要包含损伤诱导元件G-box和P-box、盐诱导作用元件GT1-motif、参与干旱诱导的反应元件MBS,以及真菌侵害应答元件BOX-W1、植物-病原菌互作元件EIER;此外,还包含调节黄酮合成基因的MYB转录因子的结合位点。(3)CiMYB15基因的表达受到紫外胁迫的诱导。(4)CiMYB15基因过表达株系的总黄酮含量高于野生型。(5)过表达植物中AtCHS基因的表达量亦高于野生型。以上结果说明,CiMYB15基因正调控拟南芥黄酮代谢。
对一株解淀粉芽孢杆菌TF28产生的抗菌脂肽进行分离鉴定及抑菌活性研究,采用酸沉淀、乙酸乙酯和甲醇萃取技术制备了抗菌脂肽粗提物,经过2次HPLC分离纯化,在保留时间32~42min内获得8个抗菌脂肽纯品,经MALDI-TOF-MS鉴定为芬芥素(fengycins),对尖孢镰刀菌和禾谷镰刀菌显示出较强的抑菌活性,该研究为提高菌株TF28抗菌脂肽产量的定向遗传改造奠定基础。
优化并全合成里氏木霉几丁质酶基因,在毕赤酵母中实现分泌表达。产物几丁质酶的蛋白浓度达0.17mg/ml,最适pH为5.6,最适温度为65℃,酶活为0.52U/ml。该酶在50℃及以下较稳定。利用该酶水解低脱乙酰度壳聚糖并对产物的组成及结构进行分析。超高效液相色谱-四极杆飞行时间质谱(ultra-performance liquid chromatography quadrupole time-of-flight mass spectrometry,UPLC-QTOF MS)检测及分析结果显示,酶解产物中包含至少41种聚合度2~18,不同脱乙酰度的壳寡糖组分;核磁共振(nuclear magnetic resonance,NMR)检测及分析结果显示,产物壳寡糖的还原端主要为N-乙酰氨基葡萄糖,非还原端则同时含有N-乙酰氨基葡萄糖及氨基葡萄糖。相关结果可为壳寡糖的结构与功能关系研究提供参考。
星形胶质细胞上调基因-1(astrocyte elevated gene-1,AEG-1)在多种肿瘤中过表达,参与肿瘤的形成、转移等过程。本实验利用CRISPR/Cas9技术敲除AEG-1基因并研究其在胶质瘤细胞转移过程中的作用。首先设计构建sgRNA/Cas9二合一表达载体并转染到人胶质瘤U251细胞中,通过TA克隆测序鉴定sgRNA的活性;然后筛选建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系,并利用Western blot实验检测AEG-1的敲除效率;最后利用Transwell小室、划痕实验评价AEG-1敲除后对肿瘤细胞迁移能力的影响。结果显示,成功构建靶向敲除AEG-1基因的sgRNA/Cas9二合一表达载体,所构建的载体与实验设计相一致,通过TA克隆测序鉴定sgRNA有活性;成功建立稳定的AEG-1敲除U251细胞系,Western blot实验结果表明敲除效率高达98%;Transwell小室实验、划痕实验结果表明AEG-1敲除U251细胞系的转移能力明显降低。
以‘贵长’猕猴桃叶片为外植体,直接脱分化产生不定芽,并对不定芽增殖以及生根体系进行优化,建立了其高效直接再生体系。结果表明,叶片在MS+4.0mg/L 6-BA+0.4mg/L NAA培养基中,不定芽诱导率达95.8%,平均出芽数达15.7个/叶片;不定芽在MS+3.0mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+0.2mg/L GA3培养基中,增殖率达100%,且1~6代平均繁殖系数达8.15;不定芽先在添加1.0mg/L IBA的1/2 MS固体培养基中诱导7d,然后再先后在1/2 MS固体培养基和充分吸附1/2 MS培养液的珍珠岩中各培养14d,生根率达98.61%,且根系发育良好;50株试管苗移栽到以珍珠岩和田间土壤(其体积比为1∶4)为基质的营养钵中,2周后成活49株,成活率达98%。该研究成功建立了‘贵长’猕猴桃叶片高效再生体系,该方法不定芽诱导周期短,出芽率高且数目多,不定芽增殖系数大,生根率高且试管苗根系发达,为‘贵长’猕猴桃离体快速繁殖和遗传转化奠定了基础。
利用甘油醛三磷酸脱氢酶(glyceraldehydes-3-phosphatedehydrogenase,GAP)启动子在毕赤酵母中表达人鹅型溶菌酶2(human goose-type lysozyme 2,hLysG2),并在小试规模建立一套有效的重组hLysG2(recombinant hLysG2,rhLysG2)生产工艺流程。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成hLysG2基因,将其连接至pGAPZαA 质粒中,构建重组表达质粒pGAPZαA-hLysG2。将重组表达载体线性化后电转化毕赤酵母GS115感受态细胞,通过Zeocin抗性筛选获取高拷贝重组菌株,并在5L生物反应器中进行发酵培养。发酵60h后发酵液上清酶活性达到最高, 发酵液上清经SDS-PAGE及Western blot检测证实rhLysG2得到表达。与诱导型表达相比,组成型表达发酵时间缩短了48h,上清中rhLysG2总活性提高了23.8%;使用甲壳素亲和层析和分子筛层析对rhLysG2进行纯化后,每升发酵液上清可纯化到187.4mg重组蛋白,纯化产物纯度达99.0%以上;浊度测定法分析显示,在pH 5.6、30℃和0.1mol/L Na +的条件下,rhLysG2可达到最大酶活性13 500U/mg。利用GAP启动子在毕赤酵母中成功表达了高纯度和高活性的rhLysG2,避免了甲醇的使用,缩短了发酵时间,提高了蛋白产量,为将rhLysG2开发为新型抗耐药菌药物奠定了基础。
端粒是染色体末端的特殊结构,对染色体具有保护作用,并且和衰老及很多疾病相关。长链非编码RNA是长度大于200bp且一般不具有编码功能的RNA。TERRA(telomeric repeat-containing RNA)是由端粒重复序列转录的一类长链非编码RNA,研究表明TERRA具有参与调控端粒长度,促进异染色体形成和保护染色体末端等功能,并且TERRA的表达与疾病和衰老相关。由于TERRA对于端粒具有重要作用,因此对于TERRA的研究已经成为端粒相关研究中的热点。目前对于TERRA的转录调控及生物学功能已有较为深入的了解。现对TERRA的生物学特性,功能和与疾病及衰老的关系进行综述,以期为TERRA后续的研究如作为疾病治疗靶点,延缓衰老等提供参考。
重组蛋白质的纯化一直是限制其生产的瓶颈环节,传统纯化工艺以批次模式为主,普遍存在成本高,处理效率及回收率低等问题。近年来,随着连续离心,过滤,层析技术的开发和应用,传统工艺的缺陷得到有效的克服。主要以下游纯化工艺为主线,对工业大规模纯化过程中所涉及的连续技术的特点及应用进行了归纳分析。对纯化工艺中的核心技术-层析,以及未来重组蛋白质的纯化技术进行了展望,旨在为重组蛋白质生产工艺的优化提供新的理论依据和指导思想。
单克隆抗体在生物学和医学研究领域中显示了极大的应用价值,是免疫检验中的新型试剂,是生物治疗的导向武器。作为医学检验试剂,单克隆抗体可以充分发挥其优势,如特异性好,灵敏度高,更便于质量控制,利于标准化和规范化。传统的方法是利用小鼠腹水制备单克隆抗体,但是近几十年杂交瘤细胞体外大规模培养制备单克隆抗体技术也在不断发展。特别是单克隆抗体在疾病诊断和治疗方面的需求,更进一步促进了杂交瘤细胞体外培养生产技术的发展,体外培养杂交瘤细胞生产的单克隆抗体已应用到许多方面。由于杂交瘤细胞的半贴壁性质,无论是悬浮培养还是贴壁培养,均可进行杂交瘤细胞的体外大规模培养。针对应用于体外诊断试剂的杂交瘤细胞体外培养制备单克隆抗体进行综述,主要包括中空纤维细胞培养和生物反应器细胞培养方法,以及不同培养方法优化的进展。
目的: 从产品开发角度分析免疫细胞治疗类药物的发展现状和未来趋势。方法: 检索科睿唯安(Clarivate Analytics)的Cortellis数据库的数据,利用定量分析法和对比分析法对检索结果进行分析。结果: 目前已有2种免疫细胞治疗类药物上市,1种免疫细胞治疗类药物处于预注册阶段,4种药物处于临床Ⅲ期,同时大量处于临床Ⅱ/Ⅰ期药物显示未来市场上将有更多免疫细胞治疗类药物。产品交易方面,目前在免疫细胞治疗类药物的商业交易也趋向频繁。通过列举分析目前已发生的交易金额前十的交易,发现其中药物开发及商业化许可是最主要的交易模式。结论: 目前免疫细胞治疗类药物市场尚处于起步阶段,但随着未来技术的不断发展改进,相信未来有更多的药物进入商用市场,为癌症及其他疾病的治疗提供新的契机。
