2017年, 第37卷, 第4期　
刊出日期：2017-04-25

  

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专题
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  2016年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势

  国际农业生物技术应用服务组织

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 1-8. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170401

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  国际农业生物技术应用服务组织(ISAAA)出版了全球生物技术/转基因作物商业化年度回顾,即ISAAA简报,本文是这一系列的第21期,记载了以下最新信息:2016年转基因作物的应用和分布的全球数据,自1996年(商业化的第一年)以来的累计数据、国家状况、转基因作物的批准动态,以及转基因作物种植国家和全球的未来技术展望。ISAAA简报因其可靠性和准确性成为现代农业生物技术领域内最常被引用的参考文献之一。自从1996年应用转基因作物以来,ISAAA成为这一信息的最突出的单一来源。
研究报告
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  Gadd45g诱导小鼠胚胎干细胞向中内胚层分化

  孙元元, 李薇, 叶守东, 刘大海

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 9-17. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170402

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  为探究生长阻滞和DNA损伤诱导蛋白45γ（Growth arrest and DNA-damage-inducible protein GADD45 gamma，Gadd45g）对小鼠胚胎干细胞 （mouse embryonic stem cells，mESCs）在体外培养条件下自我更新状态的影响，通过设计并构建含有Gadd45g 基因的重组质粒，将其导入mESCs内，过表达目标基因；在含有白血病抑制因子（LIF）的血清培养条件下，通过细胞计数、碱性磷酸酶染色、qRT-PCR以及免疫荧光等实验手段检测mESCs的生长情况。结果显示，与对照组相比，过表达Gadd45g 基因后，mESCs的生长速度减缓，碱性磷酸酶活性降低，且中内胚层标志基因的表达水平显著上升。进一步研究发现，在添加LIF的有血清或2i无血清培养体系中，过表达Gadd45g 均可以降低细胞内STAT3蛋白的磷酸化水平，由此推断上调Gadd45g的表达会抑制STAT3的活性，从而推动mESCs向中内胚层分化。研究结果扩大了目前人们对于ESCs分化机制的理解，有利于胚胎干细胞未来的基础研究与安全应用。
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  抗A型产气荚膜梭菌α毒素全人源双价单链抗体的构建、表达及其活性的初步研究

  王冬冬, 张国利, 岳玉环, 吴广谋, 田园, 刘雨玲, 吉元刚, 王金鹏, 李建, 潘荣荣, 马洪圆

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 18-25. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170403

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  目的：为防治A型产气荚膜梭菌α毒素引起的肠毒血症及气性坏疽等相关疾病，构建并高效表达中和α毒素（CPA）的特异性双价单链抗体，并对其生物学活性进行初步研究。方法：以全人源噬菌体抗体库中筛选得到的抗A型产气荚膜梭菌α毒素单链抗体scFv基因为模板，PCR的方法扩增两条单链抗体片段并通过引物设计引入中间连接肽G4S或（G4S）3，亚克隆至原核表达载体pET-28a（+），转化E.coli BL21，IPTG诱导表达、鉴定及表达产物的层析纯化；Western blot和 间接ELISA方法检测与抗原的免疫结合活性；通过体外检测抗体抑制CPA水解卵磷脂的活性和溶血活性以及体内小鼠攻毒保护试验初步研究双价单链抗体的生物学活性。结果：双酶切鉴定及基因测序结果表明构建的双价单链抗体sc（Fv）2-5和sc（Fv）2-15均正确，诱导表达后经12% SDS-PAGE分析，两者均以包涵体形式表达且蛋白分子量符合理论值大小，Western blot和间接ELISA分析结果显示，构建的双价单链抗体与抗原CPA具有特异结合活性，且sc（Fv）2-15与抗原的结合活性明显高于sc（Fv）2-5和scFv，体外与体内生物活性试验结果进一步证明，sc（Fv）2-15中和毒素的能力较sc（Fv）2-5和scFv具有明显优势。结论：成功制备了抗A型产气荚 膜梭菌α毒素的全人源双价单链抗体，为进一步研究该毒素引发的各类疾病的诊断和治疗奠定了基础。
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  重组小鼠白细胞介素-33的原核表达制备及其粘膜免疫佐剂活性

  冯雪军, 龙琼, 唐增华, 黄惟巍, 刘存宝, 杨旭, 孙文佳, 白红妹, 马雁冰

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 26-32. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170404

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  目的：白细胞介素 （IL）-33对树突状细胞、巨噬细胞及T细胞等免疫细胞具有重要调控作用。利用大肠杆菌制备重组小鼠的IL-33，并初步考察其作为粘膜免疫佐剂应用的潜能与特点。方法：以IPTG诱导硫氧还蛋白（Trx）/IL-33融合蛋白在大肠杆菌DH5α中的表达，并通过Q-Sepharose离子交换和Ni⁺⁺金属螯合亲和层析纯化Trx/IL-33，进一步经肠激酶切割获得成熟形式的IL-33。重组HBcAg混合纯化的IL-33后经滴鼻免疫小鼠，考察HBcAg特异的IgA及IgG₁、IgG_2a的应答。结果：纯化的重组IL-33具有与标准品相当的促巨噬细胞RAW264.7表达TNF-α的体外细胞生物学活性。作为佐剂可显著增强滴鼻粘膜免疫激发的不同粘膜组织中HBcAg特异的IgA应答，以及血清与支气管肺泡灌洗液中特异IgG₁的应答水平，而抑制IgG_2a应答。结论：利用大肠杆菌可制备活性IL-33，其具有粘膜免疫佐剂的应用潜能。
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  Hmox1促进BMP9诱导C3H10T1/2细胞向成骨分化

  刘晓骅, 吉彩霞, 徐丽, 董超群, 罗进勇

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 33-39. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170405

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  目的：研究血红素加氧酶1（hemeoxygenase 1，Hmox1）在骨形态发生蛋白9（bone morphogenetic proteins 9，BMP9）诱导下间充质干细胞C3H10T1/2向成骨分化过程中发挥的作用。方法：用Ad-BMP9感染C3H10T1/2，分别用Q-PCR和Western blot检测Hmox1mRNA和蛋白水平的变化；Hmox1激动剂COPP处理BMP9诱导的C3H10T1/2细胞，碱性磷酸酶（ALP）染色和活性测定检测早期成骨指标ALP的变化；过表达Hmox1的重组腺病毒（Ad-Hmox1）处理BMP9诱导的C3H10T1/2细胞，ALP染色和活性测定早期成骨指标ALP，茜素红染色检测晚期成骨指标钙盐沉积，Western blot检测成骨相关基因COL1A1。结果：Ad-BMP9感染C3H10T1/2后，Hmox1的mRNA及蛋白水平均升高；BMP9与Hmox1激动剂COPP联用与BMP9组相比ALP的活性增强；Ad-Hmox1可以增强BMP9诱导下C3H10T1/2细胞的ALP活性和钙盐沉积，以及成骨相关基因COL1A1表达。结论：Hmox1可以促进BMP9诱导下C3H10T1/2细胞的成骨分化。
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  ANKRD49通过上调Bcl-xL的表达抑制UV诱导GC-1细胞的凋亡

  白欣艳, 温丽敏, 王玉晶, 王海龙, 解军, 郭睿

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 40-47. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170406

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  目的：利用稳定过表达Ankyrin repeat domain 49（ANKRD49）的GC-1（小鼠精原细胞）细胞模型，探讨ANKRD49过表达对GC-1细胞凋亡的影响。方法：40 J/m² 紫外线（UV）刺激GC-1细胞2 min 诱导凋亡，分别利用流式细胞术、Hoechst33258染色和免疫印迹技术检测过表达ANKRD49对GC-1细胞线粒体膜电位、核浓缩情况和凋亡相关蛋白多聚ADP核糖聚合酶（poly ADP-ribose polymerase，PARP）、Cleaved-Caspase-3、Bcl-xL和Bax的表达变化，以反映ANKRD49对GC-1细胞凋亡的影响。结果：流式细胞术检测结果表明稳定过表达ANKRD49的GC-1细胞线粒体膜电位下降率和细胞凋亡率均明显低于空载体组和裸细胞组（P<0.05）。Hoechst33258染色结果显示ANKRD49稳定过表达组细胞的凋亡百分比明显低于其它组（P<0.05）。Western blotting 检测结果显示ANKRD49稳定过表达组Cleaved-PARP、Cleaved-Caspase-3蛋白的表达水平明显低于对照组，而Bcl-xL蛋白表达水平明显高于对照组（P<0.05）。结论：ANKRD49过表达可抑制UV诱导的GC-1细胞凋亡，其作用可能是直接或间接通过促进Bcl-xL的表达而实现的。
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  Notch信号参与BMP4诱导的间充质干细胞成骨分化及其机制的初步探讨

  曹俊杰, 李爱芳, 卫亚琳, 廉静, 唐敏

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 48-55. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170407

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  目的：探讨Notch信号对骨形态发生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）诱导间充质干细胞成骨分化的影响以及作用机制。方法：（1）DAPT或Ad-dominant-negative mutants of Notch1（AddnNotch1）和BMP4-CM处理小鼠胚胎成纤维细胞，检测早期成骨指标碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）；（2）茜素红S染色实验检测晚期成骨钙盐沉积情况；（3）半定量反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测成骨分化相关基因ALP，Runx2，Col1a1 的表达；（4）免疫细胞化学检测p-Smad1/5/8的表达；（5）结晶紫染色和流式细胞术检测细胞的增殖及周期改变。结果：（1）DAPT抑制BMP4诱导的早期成骨分化，且呈浓度依赖性；（2）Delta-like 1（DLL1）促进BMP4诱导的成骨分化，DAPT和dnNotch1抑制BMP4诱导的成骨分化；（3）DLL1促进BMP4诱导的成骨相关基因ALP，Runx2，Col1a1的表达，DAPT抑制这些基因的表达；（4）DLL1促进BMP4诱导的细胞核内p-Smad1/5/8的表达，而DAPT抑制其表达；（5）DLL1促进BMP4诱导的细胞增殖，而DAPT抑制BMP4诱导的细胞增殖。结论：Notch信号通过BMP/Smads信号通路促进BMP4诱导的MSCs成骨分化，在此过程中也有促细胞增殖的作用。
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  对SDS稳定的V8(V125T)蛋白酶突变体的高效表达及性质研究

  程可利, 刘晓, 李素霞

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 56-67. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170408

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  谷氨酰内切酶能特异性切割谷氨酸、天冬氨酸残基羧基端结合的肽键。将含有V8蛋白酶突变体（V125T）基因的表达质粒的重组大肠杆菌BL21（DE3），在50 L发酵罐中发酵，融合蛋白为可溶性表达，可得菌湿重50 g/L，相对蛋白表达量为33%。融合蛋白采用GST亲和纯化、肠激酶激活、DEAE-FF阴离子交换层析，得到纯的V8（V125T）突变体，经纯化后可获得0.998 mg蛋白/g菌（湿重），比活为13.47 U/mg pro.纯化过程的酶活回收率达到了97.9%。对纯酶进行酶学性质分析，以Z-Phe-Leu-Glu-pNA作为底物测得V8（V125T）蛋白酶的Km为0.339 mmol/L，Vmax为16.642 μmol/min。其最适pH为8.0，在pH4.0~10.0之间较稳定；最适反应温度在45 ℃，12 h内在4~35℃有很好的温度稳定性；25 ℃条件下1 mmol/L的金属离子对酶具有不同程度的影响，其中Fe³⁺的抑制作用最强；2 mol/L尿素及1 mmol/L EDTA对酶活性无影响，在0.1% SDS中保存12 h、在0.5% SDS中4 h和在1% SDS中1 h，活性均能维持90%以上，在0.5%，0.1% SDS保存12 h，仍能保持80%和64%的活性，与未突变的重组V8蛋白酶相比，该突变体对SDS的耐受性得到极大提高。
技术与方法
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  白蛋白结合肽-多柔比星耦合物的设计、制备、表征及初步评价

  刘立平, 张纯, 殷爽, 王祺, 张耀, 余蓉, 刘永东, 苏志国

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 68-75. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170409

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  为了改善多柔比星在血液中的循环半衰期，基于白蛋白在血浆中含量丰富、性质稳定、半衰期持久的特点，通过大肠杆菌体系重组表达了源于细菌表面蛋白中白蛋白结合肽段，并建立了纯化工艺，获得了纯度高于95%的重组白蛋白结合多肽，并证明重组多肽在体外能够迅速地与人血清白蛋白结合。通过与DOXO-EMCH分子化学耦联，制备获得重组白蛋白结合肽-多柔比星耦合物。A549细胞毒力实验结果显示耦合物的IC₅₀浓度升高，药代动力学结果显示重组白蛋白结合肽能够显著延长多柔比星在血液中的循环半衰期，相对于多柔比星或DOXO-EMCH分别提高了5.6倍和3.8倍。荷瘤小鼠肿瘤生长抑制实验结果显示耦合物的抗肿瘤效力得到提升。证明了基于白蛋白结合机制可为小分子药物长效设计提供新的思路。
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  PEG法介导蛹虫草遗传转化体系的建立

  孙丹, 张敏, 解长睿, 郭晓威, 徐赫韩, 高红桃, 李晓薇, 孙天旭, 李海燕

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 76-82. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170410

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  由于真菌的遗传转化体系中一般以原生质体作为受体细胞，因而对蛹虫草原生质体制备的各种因素进行比较研究。结果表明，蛹虫草原生质体制备的最佳体系为：液体培养4天的蛹虫草菌球，以0.8 mol/L 甘露醇作为稳渗剂，加入含1.5%蜗牛酶+1.5%溶壁酶复合酶，在34℃酶解蛹虫草菌球4 h时，原生质体得率达到1.0×10⁷个/ml。潮霉素筛选压实验表明，蛹虫草原生质体在PDA 固体培养基上的潮霉素最低筛选浓度为650 mg/L。采用正交试验的方法，设计PEG 介导蛹虫草原生质体转化，将质粒pSB130-GFP转化蛹虫草原生质体，在荧光倒置显微镜下观察比较，得到最佳的转化体系为：PEG浓度为25%，冰浴时间为10 min，室温时间为20 min，质粒质量为30 μg，原生质体个数为10⁷个/ml。最终得到PEG法介导蛹虫草遗传转化的转化频率约为100~200个/μg（抗性转化子/质粒+10⁷个原生质体）。转化子在含潮霉素的培养基上经4代以上的继代培养后仍可以表达潮霉素抗性并稳定遗传。为通过基因工程手段定向、快速改良蛹虫草药用品质，利用蛹虫草发酵方法生产一些具有重大经济价值的外源蛋白等奠定基础，并且有助于进一步了解蛹虫草这一大型真菌中基因的表达调控机制。
综述
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  长效化融合蛋白药物及其药动学分析技术的研究进展

  邵莉, 马晓慧, 王相阳, 徐寒梅

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 83-88. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170411

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  融合蛋白技术应用于生物制药行业已超过25年，其目的为改善原来天然蛋白的性质，从而具有新的理化特征和生物学功能，其中最为显著的特点是改善了小分子蛋白及多肽半衰期短的缺陷。基于该技术所诞生的融合蛋白类药物已成为当前生物药研发的热点。结合已上市融合蛋白类药物，通过与传统多肽蛋白类药物比较，重点突出融合蛋白类药物自身特点，主要从融合抗体Fc段和人血清白蛋白以延长小分子蛋白及多肽半衰期的角度对融合蛋白药物长效化策略进行评述；对融合蛋白类药物在体内的吸收、分布、代谢和排泄的显著特征进行概述；综述该类药物在体内的分析技术并指出当前分析技术的优缺点及发展方向，为长效化融合蛋白药物的设计、分析研究与开发提供依据和思路。
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  模拟α-螺旋多肽类似物抑制剂设计的研究进展

  陈蓉, 杨帆, 成细瑶, 苏正定

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 89-97. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170412

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  抑制剂筛选主要是通过反复、高通量地筛选化合物库，这个过程存在着对已有化合物库的依赖性和一定的机遇性。通过分析蛋白质数据库（PDB）发现，大多数蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）界面以α-螺旋结构为主体。α-螺旋多肽的骨架结构及其热点氨基酸残基（hotspots）为高效理性设计小分子抑制剂提供了模板。对近几年来依据多肽类似物和小分子化合物模拟α-螺旋结构设计抑制剂的研究进展进行了概述，同时对依据模拟α-螺旋设计抑制剂骨架的结构原理进行了讨论。
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  疫苗递送技术的研究进展

  王志明

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 98-103. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170413

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  迄今为止疫苗在人类和动物传染性疾病的控制和预防中依然发挥着其他药物种类难以企及的重要作用。疫苗设计成功的基础在于有效地递送抗原物质以诱发强有力的保护性免疫反应，而疫苗递送载体的合理应用可以加强、改善、甚至改变抗原物质所诱发的免疫应答过程，从而带来优化疫苗接种效果，简化免疫接种程序等有益效果。目前研发中常用的疫苗递送载体可以分为生物载体（如病毒与细菌）与化学载体（如微针与脂质体）两类，在不同递送系统使用方面的重要考虑是有效地利用载体的装载能力和相应特性来达到理想的免疫效果。目前疫苗递送技术的快速进展为现代疫苗的发展提供了有力的技术支撑。
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  间充质干细胞分泌组:创伤愈合的替代疗法

  林继志, 王强, 刁勇

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 104-109. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170414

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  大量的证据表明，间充质干细胞（MSC）可以通过旁分泌或自分泌发挥治疗作用，其疗效与血管生成、免疫调节及细胞凋亡有关。MSC分泌组即MSC所分泌的生物活性分子的总和，包括细胞因子、趋化因子和生长因子等多种活性成分，对损伤组织的修复、再生及功能恢复等许多生理过程具有调控作用。在创伤治疗领域，基于MSC分泌组研制的制剂极有可能成为替代MSC治疗的新疗法。
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  成纤维细胞生长因子6(FGF6(的研究进展

  郑婕, 姜潮, 李校堃, 田海山

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 110-114. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170415

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  成纤维细胞生长因子6（fibroblast growth factor 6，FGF6）是成纤维细胞生长因子家族（FGFs）的成员之一，主要通过与酪氨酸激酶受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）1和4结合发挥其生物学活性。研究发现，人FGF6几乎都积聚在肌源性细胞系中，参与肌源性细胞系的增殖及分化，在肌肉修复和再生过程中起重要作用，同时它还是一个重要的调节骨生成和骨重建的因子；FGF6在心脏中也有表达，进一步试验结果表明其具有促进心肌细胞增殖及保护心肌细胞凋亡的作用；在成体睾丸和乳腺癌中也检测到有FGF6的转录物，表明其在肿瘤发生发展中的作用。目前，FGF6在多种疾病中的功能和相关机制仍有待进一步研究和确认，但其所具备的生物学活性尤其是在肌肉再生方面具有重要的意义和巨大的应用潜力。
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  微生物发酵提高SOD产率的研究进展

  时桂芹, 周文珊, 任菲

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 115-124. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170416

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  超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）是细胞内重要的天然自由基清除剂，具有抗氧化、抗衰老的作用。近年来，SOD 在多个领域都展现出巨大的应用价值和开发前景。而微生物发酵是获得SOD产品的一种非常有效的方法，因此很多研究者对发酵法生产SOD进行研究。主要从SOD高产菌种的选育、培养条件及培养基成份的优化来提高SOD产量以及分离纯化工艺的改良方面进行综述，以期为我国SOD产品的深入开发和利用提供参考。
行业分析
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  抗肿瘤药物市场概述

  李敏, 吴日伟

  中国生物工程杂志. 2017, 37(4): 125-133. https://doi.org/10.13523/j.cb.20170417

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  无论在发达国家还是在发展中国家，癌症都是死亡率最高的疾病，并且其死亡率和发病率仍不断增高，因此抗肿瘤药物市场的潜力巨大。1997年至2015年，FDA共批准128个抗肿瘤药物，全球抗肿瘤药物市场规模超过1000亿美元，靶向药物占比达到62%，已经成为抗肿瘤新药的主流。全球抗肿瘤药物市场集中度极高，罗氏是其中的领导者，各大药企都对抗肿瘤药物怀有极大的开发热情。国内抗肿瘤药物以传统药物为主，靶向药物市场份额正在迅速提升，同时自主研发型新药也在逐渐增多。2015年国内抗肿瘤药物市场规模达到957.83亿元，未来还将进一扩大。