利用微流控芯片技术构建易调控、接近在体微环境的体外血脑屏障模型。
微流控芯片体外模型采用上下双培养池结构,由多聚碳酸酯膜分隔,两套流路系统控制流体。细胞采用原代分离纯化的大鼠脑血管内皮细胞和星形胶质细胞,免疫荧光技术进行鉴定,分别按次序注入微流控芯片上下培养池,按1μl/min的流速进行灌注培养,构建体外血脑屏障模型,并对此模型进行鉴定和评价。
原代分离纯化得到两种细胞,免疫荧光法鉴定细胞纯度达95%以上。共培养3天紧密连接开始形成,5天达到峰值,超微结构观察显示内皮细胞之间形成紧密连接,且荧光素钠渗透实验和TEER值测量表明屏障形成良好。
成功构建微流控芯片体外血脑屏障模型,可成为一个新的平台应用于药物筛选、神经系统基础等多项研究中。
研究STAT3在肝癌细胞SK-Hep1对sorafenib抗性中的作用,并探讨STAT3基因沉默在增强sorafenib肝癌疗效中的作用。
应用基于shRNA的基因沉默技术在肝癌细胞SK-Hep1中敲减STAT3;用CCK8法检测细胞的生长情况与对sorafenib的敏感性;蛋白印迹法(Western blot)检测STAT3、p-STAT3(Y705)、p-STAT3(S727)以及其下游蛋白的表达变化。
成功构建了STAT3敲减的细胞株SK-Hep1-shSTAT3。该细胞中STAT3蛋白表达降低,细胞增殖明显受到抑制。Sorafenib的处理下调了STAT3的磷酸化水平及其下游蛋白Mcl-1和CyclinD1的表达。STAT3基因敲减的SK-Hep1细胞,对sorafenib的敏感性增强。
基于shRNA的STAT3基因沉默能明显抑制SK-Hep1细胞增殖,提高细胞对sorafenib的敏感性,有望成为提高sorafenib抗肝癌疗效的一种新手段。
E蛋白(Protein E, PE)是不可分型流感嗜血杆菌(Nontypeable Haemophilus influenza, NTHi)表面的一种纤溶酶原(plasminogen, Plg)受体,其C末端含有两个赖氨酸残基。NTHi可通过其表面的PE与Plg结合,从而利用机体的纤溶系统深层入侵宿主。基于脂蛋白(a)[Lipoprotein(a), Lp(a)]中载脂蛋白(a)[Apolipoprotein(a), Apo(a)]与Plg高度的同源性,拟证明Lp(a)是否会与重组表达的PE(rPE)结合。
原核表达并纯化rPE及敲除C末端两个赖氨酸残基的rPEΔKK,密度梯度离心结合阴离子交换层析分离人血浆Lp(a),通过ELISA、Pull down、Western blot等方法研究rPE与Lp(a)的相互作用。
rPE与Lp(a)结合,但不与LDL结合,且rPEΔKK与Lp(a)的结合能力明显低于rPE;赖氨酸类似物6-氨基乙酸(EACA)能有效抑制rPE与Lp(a)的结合;Lp(a)对rPE与Plg的结合具有微弱的抑制作用。
rPE能够与Lp(a)结合,其中rPE的C末端赖氨酸残基和Apo(a)的赖氨酸结合位点(lysine binding sites, LBS)是rPE与Lp(a)结合的主要位点。
利用高产早籼嘉育253和高产抗稻瘟病早籼品种中组3号为亲本,采用分离世代自然病圃鉴定结合稻瘟病混合菌株人工接种抗性筛选方法,通过系谱法和产量比较试验,最终选育获得高产抗稻瘟病早籼稻新品种中早39。对超级早籼稻品种中早39及其系谱亲本嘉育253和中组3号进行产量相关性状、光合特性、叶面积指数和光合色素含量等测定和比较分析,发现中早39的每穗总粒数和结实率优于其系谱亲本,库容优势明显;中早39在齐穗后20天保持最高的净光合速率,其叶面积指数和各光合色素含量也优于系谱亲本;因此,中早39具有超高产光合生理特性。育种初期选用了高产亲本,且在生育后期中早39比其系谱亲本具有更优的光合生理特性,是水稻高产育种中优良性状的整合和后期功能型超级稻特性的体现;中早39超高产优势来自于品种选育过程中源库的优化、株叶形态的改善;中早39的选育研究为水稻高产育种提供了参考信息。
白藜芦醇是一种具有多种医疗保健作用的植物芪类次生代谢产物,在农业、医药、食品和化妆品等领域受到广泛的关注。白藜芦醇合酶是白藜芦醇生物合成中唯一必需的关键酶,决定植物体内白藜芦醇的合成。将中间锦鸡儿中克隆到的CiRS基因(GenBank登录号MF678590)转入野生型拟南芥,实验结果显示:野生型的总黄酮含量明显高于转基因株系。HPLC测得转基因拟南芥中有白藜芦醇的生成,并且含量最高达335μg/g FW。紫外照射处理后转基因植物中丙二醛的积累量明显少于野生型。转基因植物提取物DPPH自由基清除能力均高于野生型。这些结果表明,中间锦鸡儿CiRS基因异源表达后利用与黄酮类物质的共同底物合成了白藜芦醇,使得转基因植物的抗氧化性增强。
低温CPC乙酰化酶在7-ACA的生物合成中具有重要作用和显著的优势,开发低温CPC乙酰化酶具有重大的经济价值。为了获得在低温下具有更高催化活性的CPC乙酰化酶,在前期的研究基础上,以先前获得的CA IIIM为亲本,借助分子对接的手段确定了它的底物结合区域,并利用pyMOL软件找出了底物结合区域Loop上关键的脯氨酸残基,分析后将选定的脯氨酸用甘氨酸进行替换。借助pET32a质粒在E. coli BL21(DE3)中进行了可溶性表达研究,除P272G外,其它突变体均实现了可溶性表达。P238G、P582G和P679G在13℃对CPC的催化活性分别为1.25、1.04和1.38 U/mg,较亲本的0.85 U/mg有了显著的提高。此外,分别考察了亲本及突变体的温度稳定性,它们之间无明显的差异。然后,在13℃下进行了7-ACA低温生物合成的研究,结果表明反应24 h后CPC的转化率也能达到80%以上。由此可见在CPC乙酰化酶冷适应性改造方面取得了较为理想的结果,为进一步的改造及应用奠定了坚实的基础,也为其它低温酶的创制提供了可资借鉴的经验。
采用HOG1抑制剂对球头三型孢菌产多元醇进行调控。
向培养基中加入SB239063、SB202190和SB203580三种抑制剂进行发酵实验,比较三种抑制剂对发酵的影响。
实验结果表明SB239063可以降低球头三型孢菌细胞内胞浆3-磷酸甘油脱氢酶(ctGPD)的酶活,提高赤藓糖还原酶(ER)的酶活。此外对HOG1和Phospho-HOG1的Western blot结果分析显示,SB239063还会抑制球头三型孢菌细胞内HOG1的脱磷酸化。最终添加10μmol/L SB239063使发酵120 h后的多元醇产物中甘油产量下降20.57%,赤藓糖醇产量提高31.16%,底物转化率提高24.73%。
SB239063可以降低球头三型孢菌产甘油的能力,提高赤藓糖醇的产量。
根据模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans)的溶葡球菌酶基因序列以及乳酸克鲁维酵母密码子偏好性设计引物扩增溶葡球菌酶基因表达片段,构建溶葡球菌酶(lysostaphin,Lys)基因表达载体(pKLAC1-Lys),转化乳酸克鲁维酵母(K. lactis GG799),实现了Lys基因的分泌表达。对重组菌株(K. lactis GG799/pKLAC1- Lys)进行NTG随机化学诱变,优化表达条件,筛选获得高表达菌株,并通过Ni-NTA亲和层析纯化蛋白并研究其酶学性质。结果表明:通过诱变重组溶葡球菌酶乳酸克鲁维菌株,Lys酶比活性提高了约5.2倍(约8 000U/L)。最适接种量为40g/L,诱导过程中每24h添加一次终浓度为20g/L的半乳糖和NH4NO3可提高酶比活性,最适表达pH为7.0~7.5,最适反应pH为7.0~8.0,最适反应温度为37℃。实验表明,低于40℃,pH 3~6之间时,重组溶葡球菌酶较稳定。Sr2+对其酶活性有明显的促进作用,Ba2+、Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mn2+、Mg2+对其有明显的抑制作用。
为了延长重组睫状神经营养因子在体内的保留半衰期,基于CNTF中天然的游离半胱氨酸残基,在前期工作中采用聚乙二醇修饰和转铁蛋白偶联的两种方式对CNTF进行了改造。此后又采用常规分析手段对PEG20k-CNTF和Tf-PEG5k-CNTF进行对比表征。高效凝胶过滤和动态光散射分析结果显示两者拥有相近的表观分子体积。细胞试验结果显示两种耦合物的活性分别下降至未修饰CNTF的50.6%和65.8%。抗体CNTF抗体亲和力结果显示PEG20k修饰后亲合力下降至原蛋白的3.8%,转铁蛋白偶联后保留89.9%原蛋白亲合力。药代动力学结果显示PEG20k-CNTF和Tf-PEG5k-CNTF在SD大鼠血液中的保留半衰期分别为5.34 ± 0.26和8.65 ± 0.60小时,与未修饰rhCNTF相比延长了约21.4倍和34.6倍。药效学结果显示在每周两次每次1.0 mg/kg (rhCNTF等量)的给药频率和剂量下,PEG20k-CNTF比Tf-PEG5k-CNTF更显著地降低实验小鼠体重。
为了快速鉴别饲料中的狐狸、水貂、貉子和狗源性成分,根据线粒体16S rDNA种间保守序列,设计合成针对狐狸、水貂、貉子和狗的特异性引物和探针,通过对荧光PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立了多重实时荧光PCR方法,在同一PCR反应体系中可以同时完成4种动物源性成分检测。通过对15种其他物种的源性成分的检测,结果表明所设计的引物和探针具有很好的物种特异性,且灵敏度高,狐狸、水貂、貉子和狗的DNA检出限为0.01ng。对40份样品检测,其中5份检测出貉子、狐狸和水貂源性成分。结果表明,该方法可以有效地鉴别出饲料中狐狸、水貂、貉子和狗源性成分,同时适用于相关动物产品中。
以海藻酸钠、羧甲基纤维素钠(CMC)为载体,分别以乙二醇缩水甘油醚(EGDE)和戊二醛为交联剂,采用包埋交联法对脂肪酶进行固定化,结果显示EGDE的交联效果要优于戊二醛,添加EGDE的固定化酶酶活最好。得到制备固定化酶的最优方案为海藻酸钠2.5%,CMC浓度1.5%,给酶量800U/ml复配载体,氯化钙5%,以0.02%的EGDE交联固定30min,由此制备得到酶活约为380 U/g的固定化酶,酶活收率约为50.09%。固定化酶的最适反应pH为8.5,比游离酶增大0.5个单位;最适反应温度是45℃,比游离酶提高5℃;耐热性能变好,且重复使用7次后仍能保持60%左右的相对酶酶活。
石墨烯(graphene)作为一种新兴产物在生物医学领域的应用越来越广泛,氧化石墨烯(graphene oxide, GO)作为石墨烯的重要衍生物之一,得益于其异源的电学结构,因而在一定波长范围内可以产生荧光。正是这一性能使得GO在生物医学领域有着巨大的潜力,主要介绍了近年来GO的荧光性能在分子检测、疾病诊断、细胞成像等方面的应用,并展望了其发展前景。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3 (Glypican-3)蛋白高特异性表达于肝细胞肝癌患者中,研究表明其与肝癌的发展和转移关系密切。目前以Glypican-3蛋白为靶点治疗肝癌的免疫研究主要包括治疗性抗体开发、CAR-T免疫疗法、免疫毒素及多肽疫苗等。现对Glypican-3的结构功能与肝癌的关系进行介绍,并简要描述靶向Glypican-3治疗肝癌的研究现状。
聚唾液酸是一种由N-乙酰神经氨酸连接、电负性的线性同聚物,存在于人体、动物细胞和少数致病菌中,主要以糖蛋白(神经细胞粘附分子)和糖脂形式存在,是一种非糖胺聚糖(GAGs)、非免疫原性、生物可降解的优良生物材料。聚唾液酸可用作组织工程和药物缓释材料,也可以与其它大分子复合形成功能材料。对聚唾液酸生物学功能、发酵生产及应用进行概述,以期为聚唾液酸的进一步应用研究提供参考。
嗜酸菌是一类可以在极端酸性环境下生存的微生物,在生物整治以及耐热耐酸酶的提取等领域发挥着重要作用。一些嗜中性工程菌株在发酵过程中经常遇到自身环境酸化的问题,嗜酸菌独特的耐酸能力及其耐酸模块为构建耐酸能力强的嗜中性工程菌株提供了思路。因此,从细胞膜的稳定性及低渗透性,耐酸相关的能量代谢,生物大分子的修复以及胞内缓冲作用等方面对嗜酸菌的耐酸机制进行深入探讨,并展望了嗜酸菌在耐酸工程菌株合成生物学领域的作用。
褐藻作为第三代生物乙醇生产原料,以其高碳水化合物含量、生产周期短、不与粮争地的优势逐渐被人们所关注。但是在生物乙醇的实际生产中,低成本基础上乙醇产率的提高一直是亟需解决的问题。主要针对褐藻制备生物乙醇的技术困难,综述了适用于大规模生产生物乙醇的预处理技术和糖化发酵技术的研究进展,并由此展望褐藻制备生物乙醇的研究发展新方向。
