发表多篇以转基因农产品饲喂动物而导致健康损害论文的维罗纳大学(University of Verona)学者Manuela Malatesta,是国际上采用实验方法研究转基因生物安全领域有影响力的学者之一。通过对美国Web of Science数据平台全部论文的检索,重点分析了其所发表的10篇转基因毒理学论文的研究内容、研究方法与结论,并追踪其研究的相关证据及学术界对其研究的评价,在此基础上,分析该研究方法与结论的可靠性。研究发现,Malatesta所发表转基因存在安全隐患的10篇研究论文,由于其研究材料及方法上所存在的问题除了个别存在明显错误的论文无法重现而被学术界所否定外,其余论文均被后续采用规范研究方法的同类研究所推翻。
复合性状转基因植物能够同时表达两个或多个外源基因,可以满足种植者多元化需求和带来多重效益,成为目前转基因植物研发及应用的一个重要趋势。世界各国由于监管理念不同,对育种复合后代的遗传稳定性和基因互作的看法不同,对复合性状转基因植物的安全评价采取了不同的模式。综述了目前复合性状转基因植物的应用现状、不同国家的评价模式,并提出了我国对复合性状转基因植物安全评价的建议。
首先分析了全球转基因玉米产业化情况,进而从国内转基因玉米产品消费现状、玉米生产中的技术需求以及我国转基因玉米研发现状等方面论述了我国推进转基因玉米产业化的必要性,并从科学上和管理上分析了推动转基因玉米产业化亟待解决的问题,对转基因研发人和安全管理工作提出了建议,以促进转基因玉米产业化的进程。
转基因技术是现代生物技术的核心,在缓解资源约束、保障食物安全、保护生态环境、拓展农业功能等方面呈现出重要作用和巨大潜力。我国和世界上许多国家都把转基因技术作为抢占科技制高点、增强农业国际竞争力的战略选择。通过介绍农业转基因技术目前发展概况、舆论环境成因、应用趋势和本质特征,以及农业转基因生物安全管理的要求和情况,并对我国农业转基因技术产业发展进行思考和探索,帮助人们更好地了解转基因技术、更为科学地对待其应用和发展。
对SARS冠状病毒主蛋白酶(SARS-CoV Mpro)进行异源重组表达与提纯,并以其为靶点,利用基于荧光共振能量转移(FRET)技术的体外药物筛选模型,对蛋白酶抑制剂聚焦库96种化合物进行了体外抑制活性的评价,并从动力学的角度探讨筛选出的阳性化合物对SARS-CoV Mpro的抑制能力与机制。结果表明:通过筛选获得抑制率>80%、淬灭率<20%的化合物5种,为P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-28、P-2-54,其半数有效抑制浓度(IC50)分别为:0.69±0.05μmol/L、1.19±0.41μmol/L、0.14±0.01μmol/L、1.36±0.07μmol/L、0.36±0.03μmol/L。其中化合物P-1-08、P-1-19、P-2-24、P-2-54对SARS冠状病毒主蛋白酶的抑制作用为不可逆抑制,化合物P-2-28的抑制作用为可逆抑制。根据Lineweaver-Burk图和Dixon图的研究,发现化合物P-2-28对SARS冠状病毒主蛋白酶呈竞争性抑制,抑制常数Ki为0.81μmol/L。通过对底物浓度,IC50值及Ki值关系的研究,进一步验证了P-2-28的抑制作用为竞争性抑制。该抑制剂的发现为SARS冠状病毒主蛋白酶抑制剂的研究打下基础,为抗SARS病毒药物开发提供了先导化合物。
为了实现在体内更持久的药效作用,根据睫状神经营养因子CNTF第17位为游离半胱氨酸残基,而转铁蛋白Tf无游离半胱氨酸的特点,采用N-羟基琥珀酰亚胺-聚乙二醇5K-马来酰亚胺(NHS-PEG5k-MAL)作为偶联剂,实现了两者定点偶联,然后结合蛋白自身特性制定纯化方法,制备获得纯度高于90%的转铁蛋白-聚乙二醇5k-睫状神经营养因子(Tf-PEG5k-CNTF)耦合物。高效凝胶色谱和动态光散射分析显示耦合物的表观分子体积大于两蛋白之和。细胞试验结果显示耦合物的活性下降至原蛋白的65.8%。大鼠药代动力学试验显示Tf-PEG5k-CNTF耦合物在体内的代谢半衰期延长至8.2小时,与CNTF原蛋白相比提高了约17倍。小鼠动物试验显示在每周2次的给药频率,每次1.0 mg/kg的剂量下,Tf-PEG5k-CNTF能更为显著地影响小鼠对食物摄入量和减轻体重。因此,转铁蛋白偶联技术可用于脑部靶向蛋白药物的长效递送。
猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白基因是该病毒基因工程疫苗的重要目的基因,但其在大肠杆菌表达系统中的表达产物通常以包涵体形式存在,影响其作为亚单位疫苗使用的免疫保护作用。将ORF2基因密码子改造为大肠杆菌偏爱的密码子,或构建MPG与ORF2基因融合,分别克隆至表达载体pET28a,再转化至大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达。SDS-PAGE和Western blot结果证实改造后的PCV2 Cap蛋白基因实现了可溶性表达。将上述两种重组蛋白纯化后,分别与GEL01、ISA206或ISA15A三种佐剂混合配制疫苗,小鼠免疫保护试验结果证明,以GEL01为佐剂的两免疫组PCV2 ELISA抗体和中和抗体水平最高。攻毒试验结果显示,除ISA15A组外,其他各免疫组脾脏中 PCV2 含量都显著低于非免疫对照组,表明两种重组蛋白与佐剂GEL01和ISA206制成的疫苗可诱导产生一定水平的免疫保护作用,为PCV2亚单位疫苗的研制奠定了基础。
目的:利用腺病毒介导RNA干扰抑制成骨分化关键转录调控因子Runx2(Runt-related transcription factor 2)的表达,研究其对骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein 2,BMP2)诱导间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成软骨分化的影响,并初步探讨相关机制。方法:利用腺病毒Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-SiRunx2感染C3H10T1/2细胞;共分4组:GFP组、BMP2组、BMP2+SiRunx2组和SiRunx2组。Alcian blue染色检测各组软骨细胞基质糖胺聚糖分泌;RT-PCR检测Runx2、早期成软骨标志物(Col2a1)、蛋白聚糖(Aggrecan)及晚期成软骨标志物(Col10a1)mRNA表达水平; Western blot 检测目的蛋白BMP2、Ⅱ型胶原 (Col2a1)及X型胶原(Col10a1)的蛋白表达。结果:在BMP2诱导C3H10T1/2细胞成软骨分化过程中, 下调Runx2的表达可以增强Col2a1、Aggrecan及软骨细胞外基质糖胺聚糖的合成,抑制Col10a1的合成。结论:下调Runx2表达可以增强BMP2诱导间充质干细胞成软骨分化能力,并抑制软骨细胞的成熟和肥大。
合成KAT基因的双链RNA,在蜜蜂体内进行RNA干扰,利用半定量RT-PCR技术和高效液相色谱法,分别检测RNA干扰后KAT基因的表达量和蜜蜂10-HDA的合成量,初步探讨沉默KAT基因与蜜蜂合成10-HDA的关系。结果显示,在蜜蜂体内注射2μl的dsKAT其成活率最高,且注射5天后,与空白组相比,KAT基因的表达量最低,蜜蜂头部10-HDA的合成量降低效果显著(P<0.05),蜜蜂上颚腺表面腺体相对干瘪、疏松。成功实现了蜜蜂体内KAT基因的沉默,且初步推测出KAT基因参与10-HDA的合成途径,阐明了KAT基因与蜜蜂合成10-HDA的关系。这为利用RNA干扰技术分析其他蜜蜂基因功能提供了借鉴,为进一步完善10-HDA的生物合成途径奠定了基础,为通过提高基因表达量来提高10-HDA的产量提供了依据。
麻疯树是一种能适应多种恶劣环境条件的能源植物,目前关于其抵抗重金属胁迫的分子调控机理尚不清楚。从组学水平整体分析其基因表达模式对于筛选关键基因、解析镉胁迫响应调控网络和促进分子育种具有重要意义。利用Illumina测序技术对水培条件下培养的处理组(Cd 100)和对照组(CK)麻疯树幼苗叶的转录组进行高通量测序,两个数据库的测序数据经de novo组装得到50448条高质量的Unigene。两个样品中发现了2551条差异表达基因,其中539条上调基因,2012条下调基因。根据不同数据库的注释信息,发现麻疯树镉胁迫引起叶片中多种代谢途径的变化,包括碳代谢,光合作用,植物激素信号转导以及植物病原响应途径。DAVID分析显示镉胁迫引起了麻疯树叶中与离子转运相关基因的变化,导致叶片中Na离子和铁离子稳态的变化。转录因子分析发现WRKY和ZIP在镉胁迫中发挥重要作用。用qRT-PCR技术对随机挑选的5个基因进行荧光定量验证,结果与测序数据一致,证实了差异表达基因数据的有效性。深入探讨了麻疯树镉胁迫的分子机理,为进一步应用于基因工程和植物修复提供基础。
目的:克隆和鉴定细粒棘球蚴的EgG1Y162基因,分析其蛋白表达和适应性进化并鉴定抗原性。方法: 根据emY162基因序列设计引物,分别从细粒棘球绦虫原头蚴、囊壁生发层、成虫和虫卵四个发育阶段,提取基因组DNA和总RNA,mRNA反转录为cDNA,利用PCR的方法以基因组DNA和cDNA为模板扩增EgG1Y162基因;构建PUCm-T/EgG1Y162重组质粒,经PCR、酶切及测序鉴定后,测序确定其正确性。利用DNAman软件与MEGA4软件对EgG1Y162基因特点进行分析并构建EgG1Y162核酸序列的进化树进一步探讨其同源性。荧光定量PCR检测EgG1Y162 基因在细粒棘球绦虫原头蚴、囊壁生发层、成虫和虫卵四个不同发育阶段的表达情况。利用定向克隆技术将EgG1Y162抗原基因片段克隆至原核表达质粒PET-41a上,通过酶切分析和PCR 鉴定筛选出阳性克隆,测序确定序列。IPTG初步诱导和表达EgG1Y162-GST 重组蛋白,通过SDS-PAGE电泳和Western blot试验分析鉴定。 结果: 从细粒棘球绦虫的两个不同发育阶段均克隆出EgG1Y162基因,从总DNA克隆得到片段长度1 680bp,从cDNA克隆得到片段长度459bp。相似性比较表明,EgG1Y162基因序列与emY162相似性为91%,而EgG1Y162基因cDNA与emY162相似性为95%。进一步分析显示,EgG1Y162基因序列由3个外显子和2个内含子组成,外显子区域分别为1~70,1 064~1 380和1 577~1 648。位于疏水端1~16位氨基酸构成EgG1Y162信号肽序列,35~115位氨基酸形成一个大的纤黏连蛋白剪接体FN3,133~152位氨基酸构成羧基端跨膜区域。测序结果显示EgG1Y162抗原基因长度为360bp,编码120个氨基酸。通过荧光定量PCR检测,发现EgG1Y162在成虫、生发层阶段、原头蚴和虫卵阶段均有不同程度的表达。但是EgG1Y162在成虫中的表达量最多,相对值为19.526,差异有统计学意义(P<0.01),其次生发层阶段,为5.122,再次在原头蚴阶段,相对值为5.083,而在虫卵阶段最少,为1.6588。构建的PET-41a/EgG1Y162原核表达质粒,经IPTG诱导后,SDS-PAGE 检测表明EgG1Y162-GST重组蛋白得到成功表达,在相对分子量为44kDa 处有表达条带。Western blot 分析显示阳性印迹条带,分子量为44kDa,EgG1Y162重组蛋白能与细粒棘球蚴感染40天后犬的血清发生反应;与包虫病患者血清也有阳性反应。结论: 成功克隆EgG1Y162抗原基因,序列对比分析显示EgG1Y162的cDNA与emY162的cDNA具有很高的相似性,基因的差异性主要存在于内含子区域,EgG1Y162抗原基因是一种新的基因。EgG1Y162在成虫中的表达量最多。成功诱导表达出EgG1Y162重组蛋白,并且EgG1Y162重组蛋白具有很好的抗原性。
脱水素(DHNs, dehydrins)是LEA II亚家族蛋白,在种子发育后期大量积累,并受不同逆境胁迫处理诱导表达。在中间锦鸡儿干旱胁迫抑制性削减杂交文库中筛选到了一段 DHN1 序列,利用RACE技术克隆获得基因全长序列。序列比对分析表明, CiDHN1 具有开放阅读框891bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAG,编码297个氨基酸,含有5个Y片段和一个K片段,与CiDHN1相似性最高的为山茱萸科主教红端木(Cornus sericea),相似性为39%。系统进化分析显示CiDHN1单独聚为一支,推测该蛋白为新的功能未知蛋白。亚细胞定位结果表明CiDHN1定位在细胞质、质膜和细胞核。荧光定量PCR结果显示 CiDHN1 的表达受冷、脱水和NaCl等非生物胁迫的诱导。 CiDHN1 过量表达拟南芥后,其中表达量最强的株系对200 mmol/L的NaCl处理较为敏感。CiDHN1在中间锦鸡儿抵抗逆境胁迫中的功能有待于进一步研究。
目的:构建 SND1 过表达的转基因小鼠模型。方法:利用对小鼠 SND1 基因转录本构建 SND1 过表达载体pInsulator-CAG-3×FLAG-SND1,利用受精卵原核注射技术,将外源线性pInsulator-CAG-3×FLAG-SND1转基因载体注射到受精卵细胞核内,将存活受精卵进行胚胎移植制备 SND1 转基因小鼠,用PCR、RT-PCR技术鉴定转基因小鼠是否构建成功。结果:成功构建过表达 SND1 基因的转基因小鼠模型,为进一步研究 SND1 基因在动物体内的生物学功能奠定基础。
为建立费氏丙酸杆菌的半连续耦合发酵工艺,克服DMB对维生素B12连续发酵的不利影响,考察了费氏丙酸杆菌菌体细胞离位转化合成维生素B12的可行性,优化了其离位转化工艺,确定了最佳的转化时机、转化体系及DMB添加方式,具体如下:当发酵进行至84 h时,将发酵液离心,收集菌体,然后用离心上清液重悬菌体,配成5倍浓度的菌液,加入终浓度为4.5 mg/L的DMB,于30 ℃条件下转化48 h,维生素B12的产量达到108.06 mg/L,转化效率为2.26 mg/(Lh)。
环境胁迫对植物的生长不利。转录因子DREB2对干旱、高温、低温等非生物胁迫应答基因的表达具有重要的调控作用。磷酸肌醇磷脂酶C对 DREB2 基因有双向调节机制。深入了解 DREB2 和磷酸肌醇磷脂酶C的研究进展及其在生物工程上的应用,以及磷酸肌醇磷脂酶C对 DREB2 基因的表达调控机理,可以为磷酸肌醇磷脂酶C和 DREB2 基因在提高植物胁迫耐受性中的利用提供基础。
生物基产品及生物质能源已经成为解决世界能源与环境危机的重要途径之一,其领域科技发展也成为全球科技前沿热点。欧盟各国作为生物经济的倡导国,在相关领域长期保持着世界领先的科技水平。通过对欧盟生物基产业科技相关战略政策的解读,展现近年来的欧盟战略政策和项目规划等布局,揭示欧盟优先发展的研究主题及开发方向。通过对欧盟生物基产业科技发展科技战略脉络的疏理和研发重点的挖掘,希望能为我国生物基产业的可持续发展和生物经济的振兴,提供有益的经验借鉴和参考意见。
