目的:构建抑癌基因PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)的转基因小鼠模型并对其表型进行初步分析。方法:细菌人工染色体(BAC)载体系统构建打靶载体创建PTEN转基因小鼠模型;利用对鼠尾DNA进行PCR检测的方法对出生的F0代小鼠进行基因型鉴定,将阳性F0代小鼠与野生型小鼠交配繁殖筛选稳定遗传的转基因系。分离并培养小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryo fibroblast,MEF),利用Western blotting检测比较转基因阳性小鼠与同窝野生型小鼠MEF细胞中PTEN的蛋白表达水平,并通过克隆形成实验对比PTEN转基因小鼠与野生型小鼠MEF细胞的增殖能力;取成年小鼠主要组织器官提取蛋白,Western blotting检测PTEN转基因小鼠主要组织的PTEN蛋白表达情况;从小鼠出生后第三周开始统计、分析并制作小鼠的体重生长曲线;此外,还对比了PTEN转基因小鼠与野生型小鼠肺、肝、脾脏的细胞大小与腹腔内的脂肪含量。结论:PTEN转基因小鼠能够存活并稳定遗传;Western blotting结果表明,不论在胚胎期还是成年期,PTEN转基因小鼠体内的PTEN蛋白水平均高于同窝的野生型小鼠,转基因小鼠的PTEN表达水平接近野生型水平的3倍;对PTEN转基因小鼠的整体表型进行初步分析,发现Pten基因在体内过表达后,小鼠的体型显著变小,而细胞大小不变;腹腔内的脂肪含量显著减少。结论:成功构建了PTEN转基因小鼠模型,并获得了生理条件下PTEN过表达的原代细胞系,为研究抑癌基因PTEN的体内生理功能提供了重要的动物模型。
目的: 评价轮状病毒(RV)VP4两个抗原表位插入VP6载体蛋白同一位点所表达的重组嵌合蛋白免疫学性质及在研制嵌合蛋白疫苗中的意义。方法: 采用分子克隆和基因重组技术将RV VP4的两个抗原表位插入到VP6载体蛋白同一位点上,构建重组抗原表达质粒,表达携带不同抗原表位的重组嵌合蛋白,用Western blot 和中和试验分析重组嵌合蛋白的抗原反应性和免疫原性。结果: 成功构建了两个嵌合蛋白表达质粒,并在大肠杆菌中高效表达;表达的嵌合蛋白可与相应抗体特异性反应;可诱导豚鼠产生特异性血清抗体;抗嵌合蛋白血清抗体可特异性识别载体蛋白VP6F,Wa株病毒的VP6和VP4蛋白,可中和Wa株病毒在MA104细胞上的感染性;结果表明,所构建和表达的两个以VP6为载体的VP4抗原表位嵌合蛋白具有较高抗原反应性和免疫原性;嵌合蛋白携带的VP4抗原表位具有增强载体蛋白免疫原性作用;为研制新型RV重组蛋白疫苗的奠定了较好的基础。
目的: 探讨人参皂苷Rg1对衰老模型大鼠骨髓造血功能的影响及其机理。方法: SD大鼠随机分为4组,每组10只。衰老模型组,皮下注射D-半乳糖120mg/kg qd×42;Rg1衰老模型组,注射D-半乳糖剂量与时间同衰老模型组,第15d起腹腔注射Rg1 20mg/kg qd×28;正常对照组,皮下注射生理盐水qd×42;Rg1正常对照组,注射生理盐水qd×14,第15d起腹腔注射Rg1(同Rg1衰老模型组)。模型复制或药物注射完成后第2d,采外周血检测血白细胞总数与分类计数和晚期糖基化终产物(AGEs),骨髓单个核细胞(BMNCs)计数,衰老相关β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)染色检测BMNCs衰老百分率,多向造血祖细胞集落(CFU-Mix)培养检测BMMCs形成集落能力;Western blotting 检测BMMCs衰老相关蛋白P21和P53的变化;提取腹腔巨噬细胞进行培养,比色法检测巨噬细胞吞噬功能。结果:与衰老模型组比较, Rg1衰老模型组外周血白细胞数量增多,淋巴细胞比例升高,粒细胞比例降低,CD8+T细胞所占比例降低,CD4+T细胞所占比例升高,外周血AGEs水平降低,每根股骨的BMMCs细胞数增多, SA-β-Gal染色阳性的BMMCs明显降低,BMMCs形成CFU-Mix能力提高,P21和P53的表达下调,腹腔巨噬细胞吞噬中性红指数上升。结论: D-半乳糖复制的衰老模型大鼠骨髓造血功能损伤明显,人参皂苷Rg1对其致衰损伤有明确的保护作用,可能机理与调控p53/p21信号通路有关。
口蹄疫是由口蹄疫病毒(FMDV)引起的一种高度接触性传染病,主要侵害偶蹄动物。乳鼠常作为一种重要的实验动物模型用于FMDV的研究;整联蛋白αvβ6是FMDV的重要受体之一。为深入研究整联蛋白αvβ6在FMDV感染乳鼠中所发挥的作用,克隆了乳鼠整联蛋白αvβ6的两个亚基,并将其导入中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary, CHO-677)基因组中,构建了稳定表达乳鼠整联蛋白αv 和 β6亚基的细胞系CHO-677-mαvβ6,并分别选用两种不同血清型的野生型FMDV毒株Asia1/HN/CHA/06和O/BY/CHA/2010感染细胞系来分析细胞系对FMDV的易感性。首先通过PCR和间接免疫荧光试验证明了细胞系中整联蛋白αvβ6在基因水平成功导入,在蛋白水平成功表达。然后,通过实时荧光定量RT-PCR检测病毒RNA拷贝数,并结合TCID50试验测定了代表毒株在两个细胞上的生长曲线。结果表明,与亲本细胞CHO-677相比,细胞系CHO-677-mαvβ6对FMDV更易感,从αvβ6的功能性上进一步验证了细胞系被成功构建。
利用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达人源类溶菌酶蛋白6(human lysozyme-like protein 6,hLyzl6),对其酶学性质进行分析。根据毕赤酵母密码子偏爱性设计并人工合成hLyzl6基因,将其连接至含有乙醇氧化酶启动子(AOX1)的pPIC9K质粒构建重组表达载体pPIC9K-hlyzl6;重组表达载体经线性化后电转化入毕赤酵母GS115感受态细胞,经G418筛选获得高拷贝重组菌株后进行甲醇诱导表达。经甲醇诱导72 h后发酵液上清中酶活性达到最高值,发酵液上清经SDS-PAGE检测在14.8 kDa处有重组hLyzl6蛋白条带,分子量符合预期,通过甲壳素亲和层析可对其进行纯化;采用比浊法测定hLyzl6酶学活性,结果表明hLyzl6对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)有较好的杀灭作用,最适反应温度为40℃,最适pH为5.5,其酶活力为54 700U/mg,Cu2+对其活性有明显抑制,EC50为30.2799 mg/L。采用基因工程方法首次在毕赤酵母GS115成功表达了重组hLyzl6,证实其在体外具有杀菌活性,初步揭示hLyzl6在男性生殖系统先天性免疫中发挥了一定作用,为进一步研究hLyzl6的功能和应用开发奠定了基础。
构建XX2012株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV) GP5a蛋白基因的真核表达载体,并制备出GP5a蛋白的多克隆抗血清。以XX2012株PRRSV GP5a蛋白的基因序列为扩增模板,设计并合成一对特异性扩增引物,通过RT-PCR扩增得到该病毒株的GP5a蛋白全长基因片段,将其定向克隆到真核表达载体pCAGG中,构建含有GP5a蛋白基因的重组表达载体pCAGGS-GP5a,并将获得的pCAGGS-GP5a载体采用基因免疫的方式免疫BALB/c小鼠制备GP5a蛋白的多克隆抗体。结果显示,成功克隆出了XX2012株PRRSV GP5a蛋白全长基因,片段大小为156 bp;构建的pCAGGS-GP5a载体经PCR、双酶切、测序鉴定均无误;通过三次基因免疫小鼠成功制备出了GP5a蛋白的多克隆抗体,间接免疫荧光试验证实制备出的多克隆抗体能特异性识别病毒感染后的细胞。由此获得了PRRSV GP5a 蛋白基因的真核表达载体,制备出了GP5a蛋白的特异性多克隆抗血清,为今后开展GP5a蛋白的亚细胞定位及相关功能的研究奠定了基础。
根据苦荞(Fagopyrum tataricum)花期转录组数据,采用RT-PCR技术和PCR技术克隆得到一个C2C2型锌指蛋白基因FtLOL1(FtLSD-one-like 1,GenBank登录号:KP260662),获得 cDNA和DNA全长序列,采用实时荧光定量PCR技术研究FtLOL1在3种非生物处理条件下的表达模式。结果显示,苦荞FtLOL1基因DNA全长1 720bp,由5个外显子和4个内含子组成,符合GT-AG剪切原则;cDNA包含一个444 bp的开放阅读框,编码147个氨基酸,具有LSD1家族的典型特征;2mmol/L水杨酸、UV-B照射和4℃冷处理均能导致FtLOL1基因表达量下降,其中水杨酸和UV-B处理均在12h达到最小值,分别为对照组(0h)的11.9%和33.8%,而4℃冷处理条件下,FtLOL1表达量12h开始下降,至24h达到最小值,为对照组(0h)的50.7%,36h后表达量有所回升,稳定在对照组(0h)的60%左右。推测该基因可能参与苦荞抗高浓度水杨酸、UV-B照射和冷胁迫等非生物胁迫的应答反应,为探究苦荞抗逆性提供了新的视角。
为了选育精氨酸高产菌株,基于谷氨酸棒杆菌的基因组尺度代谢网络模型的指导,以钝齿棒杆菌(Corynebacterium crenatum)MT-M4为出发菌株,通过基因敲除技术构建了proC和putP敲除菌株。摇瓶发酵结果表明,proC敲除菌株精氨酸产量达到9.94g/L,较出发菌株提高了15.90%,葡萄糖转化率提高了26.02%。由于其生长受到明显抑制,因此在发酵液中外源添加24mmol/L的脯氨酸,结果发现其精氨酸产量达到12.22g/L,且菌株恢复生长。putP敲除菌株精氨酸产量达到12.23g/L,较出发菌株提高了42.70%,葡萄糖转化率提高了49.31%。以上结果显示,putP的敲除比proC的敲除更有利于精氨酸的合成,putP的敲除对菌株的生理代谢基本无影响且无需外添加脯氨酸。
目的:旨在敲除禾谷镰刀菌Fusarium graminearum FgPDE1基因,确定其缺失突变体表型,从而分析该基因的生物学功能。方法:应用Split-marker技术构建含有潮霉素基因敲除盒,通过PEG介导原生质体转化,PCR筛查抗潮霉素转化子以获得缺失突变体ΔFgPDE1,根据突变体表型变化及致病性的检测对FgPDE1基因的功能进行分析。结果:采用Split-marker技术,成功构建了FgPDE1基因敲除盒;PEG介导转化禾谷镰刀菌原生质体后成功获得转化子。经PCR筛查,得到3个PCR确认的敲除突变体;表型观察发现,ΔFgPDE1菌落的外型及菌落生长速度与野生型没有明显差异。孢子侵染西红柿果实实验证明:以西红柿为侵染宿主,相对于野生型,突变体致病性没有明显减弱;但突变体分生孢子产量显著下降。结论:FgPDE1基因可能与禾谷镰刀菌分生孢子的形成有关。
在蛋白晶体结构难以获得的情况下,通过设计突变体来获取6-羟基-3-琥珀酰吡啶单加氧酶HspB的结构信息。首先获取HspB蛋白的同源序列并进行比对,之后对HspB蛋白进行同源建模和从头建模,并与底物2,5-二羟基吡啶(HSP)进行对接模拟;通过分子模拟、序列比对和参考同源蛋白晶体三种方式,设计并构建HspB酶的25个突变体;通过突变体的表达纯化和酶动力学常数测定来研究HspB的结构性质。根据实验结果,推测FAD的正确结合在稳定HspB蛋白结构中具有重要的作用,同时推测底物HSP和辅酶NADH处于同一活性中心并与不同位点相互作用。吡啶衍生物是极具工业价值的化合物,生物催化法是合成吡啶衍生物的有效途径,而吡啶衍生物的生物催化研究较少,通过考察突变体的性质,推测了HspB的部分结构信息,为此类吡啶单加氧酶的工业改造和应用奠定了基础。
目的:从海底沉积物中筛选得到一株几丁质酶活性较高的菌株,分离纯化菌株分泌的几丁质酶,并对其活性进行酶学分析。方法:以中国南海北部湾的沉积物为样本,结合透明圈法及DNS法筛选菌株。采用几丁质结合能力分析及多种层析方法分离纯化菌株分泌的几丁质酶,对其中一种几丁质酶进行酶学性质分析。结果:共筛选获得21株几丁质酶产生菌,其中分泌的几丁质酶活性最高的为蜡样芽孢杆菌B04 (Bacillus cereus strain B04)。发现该菌共分泌6种含有几丁质结合域的蛋白。从蜡样芽孢杆菌B04发酵液中,分离纯化得到分子量为36 kDa的几丁质酶。研究发现,该酶是蜡样芽孢杆菌B04的一种主要的几丁质酶,其最适pH为4.0,最适反应温度为60℃,在pH 3.0~10.0范围内活性稳定,Co2+对其活力有明显促进作用,Ag+有显著的抑制作用。结论:为几丁质酶的工业化应用提供了基础。
目的:采用亚硝基胍(NTG)诱变结合96孔板高通量筛选方法筛选产耐高温谷氨酰胺转胺酶(MTG)的茂原链霉菌(Streptomyces mobaraensis)。方法:通过优化96孔板高通量测定MTG活性的方法、确定筛选温度和时间,建立了产耐高温MTG菌株的快速筛选方法;通过优化NTG诱变条件建立了筛选突变库;通过96孔板高通量初筛、摇瓶复筛获得了产耐高温MTG的突变株12-82,并通过摇瓶发酵对12-82所产MTG进行热稳定性分析。结果:采用2mg/ml NTG、pH8.0、60min的诱变条件获得突变株,将突变株的发酵上清液于70℃水浴7.5min,再在37℃空气浴、反应10min的条件下测定MTG活性,从5 200株突变株中筛选出5株产耐高温MTG的突变株,其中突变株12-82在50℃水浴60min以及70℃水浴1.5min的酶活残留率均比出发株高出近20%,且80℃保温2min仍有11.9%的酶活残留率。结论:利用NTG诱变结合96孔板高通量筛选的方法筛选到5株所产MTG热稳定性相对较高的突变株,其中突变株12-82在50℃、70℃和80℃的酶活残留率均有10%~20%的提高。这为高温食品加工领域所需耐高温MTG生产菌株的高效筛选提供了可行性方案。
对烟草节杆菌发酵产酶培养基进行了优化。在烟草节杆菌的初始发酵培养基条件下,肌酐酶初始酶活仅为9.2U/g湿菌。首先,通过肌酸诱导、金属离子筛选实验发现肌酸和金属离子对烟草节杆菌产肌酐酶酶活有重要影响;然后再通过碳源和氮源优化,以玉米浆和酵母膏作为复合氮源,可溶性淀粉为碳源,肌酐酶产量可达到108.5 U/g湿菌;在以上基础上,最后通过两次正交试验优化初始发酵培养基,最优培养基组成为:肌酸 0.3%,玉米浆0.3%,可溶性淀粉0.4%,酵母膏0.7%,Fe2+ 0.003%,Mn2+ 0.006%,Mg2+ 0.005%,K2HPO4 0.1%,KCl 0.5%。在优化后的发酵培养基条件下,烟草节杆菌肌酐酶酶活达到182.82 U/g湿菌,为初始发酵培养基酶活的19.87倍。
潜伏感染的静息记忆CD4+ T细胞是清除HIV-1病毒的一个重要障碍。处于潜伏状态的病毒多以原病毒cDNA的形式整合至宿主基因组中,但是病毒基因表达处于沉默状态,因此潜伏感染的细胞难以受到病毒的致细胞病变效应或机体特异性细胞毒性T细胞的杀伤,也不易受到抗反转录病毒治疗药物的作用。如何减少潜伏感染的细胞储存库是艾滋病治疗中亟需解决的一个问题。体内及体外HIV-1潜伏感染模型有助于深入了解HIV-1潜伏感染的建立、维持或打破机制,评价潜伏感染再激活剂的活性。在此侧重于介绍采用永生化细胞系、原代静息CD4+ T细胞或活化的CD4+ T细胞建立的HIV-1潜伏感染体外实验模型。
成纤维细胞生长因子20(FGF20)是成纤维细胞生长因子家族(FGFs)的成员之一。研究发现,FGF20具有广泛生物学活性,不仅在退行性神经系统疾病,如帕金森病中起着重要作用,还在组织修复,肿瘤发生、器官发育等方面具有重要的生物学功能。尽管作为重组蛋白药物的开发其功能和机制仍有待进一步研究,但FGF20所具备的生物学特性将会有非常广阔的研究领域和应用价值。
生物反应器技术应用于植物细胞培养既可以打破环境条件的限制,又有助于生产过程的人为调控,为植物细胞大规模培养或工厂化直接生产植物细胞有用代谢产物创造了条件,是当前植物细胞培养工作的研究热点。在介绍植物细胞培养特点的基础上,对适用于植物细胞培养的各类生物反应器(搅拌式生物反应器、非搅拌式生物反应器、用于植物细胞固定化培养的生物反应器、光生物反应器以及一次性培养生物反应器)的原理、优缺点等进行比较分析,最后提出了植物细胞培养生物反应器研究的发展方向,以期为植物细胞培养生物反应器的选择及改良提供参考。
溶菌酶是一种优异的天然抗菌蛋白,可以成为抗生素和化学防腐剂的有效替代物,解决日益严峻的细菌耐药性问题和抗生素残留、化学防腐剂超标等食品安全问题。因此,深入研究并构建具有新型广谱杀菌能力的溶菌酶,对食品、医药、畜牧等行业的发展有着重要意义。对溶菌酶的分类、胞壁质酶活性和非酶活性杀菌性质以及蛋白质改造方法,特别是利用现代生物技术对溶菌酶进行抗菌活性增强、抗菌谱拓展的研究进行了综述和展望。
木质纤维素高效水解为可发酵糖是其在生物燃料及高附加值化学品转化过程中至关重要的环节。从环保的角度出发,水解方法中的酶解是木质纤维素被彻底降解而无环境污染的有效途径,并且酶水解反应糖损耗低、副产物少、条件温和,因此受到广泛关注。但木质纤维素的组成与结构极为复杂,加之纤维素酶存在稳定性差、寿命短、活性低等缺陷,致使酶解效率较低,酶解糖化成本过高,为此国内外学者对如何提高木质纤维素酶解效率开展诸多方面的研究,综述了近年来提高木质纤维素酶解效率研究取得的最新理论研究及工艺进展,并就木质纤维素的预处理、产酶菌株/技术、酶复配/重组、酶解助剂、酶固定、外场作用、酶回收重利用及酶解反应器多方面的研究情况进行了总结,进一步展望了木质纤维酶解糖化的发展方向。
