制备了微柱名义直径为4 μm或10 μm,名义间距为4 μm或7 μm,名义高度为4 μm的聚二甲基硅氧烷微柱阵列型拓扑结构基底,研究了HepG2细胞与拓扑结构基底复合后细胞瞬时受体电位通道TRPV1、TRPV4在基因和蛋白水平的表达及其功能响应性。细胞TRPV1 和 TRPV4 在基因水平表达的评价采用定量PCR技术进行;TRPV1和TRPV4在蛋白水平的表达以免疫印迹和免疫荧光染色确认;TRPV1 和 TRPV4功能响应性的研究系以TRPV1 和 TRPV4激动剂辣椒素和4α-佛波醇-12, 13-二葵酸酯刺激细胞,采用钙离子染料钙绿-1结合激光共聚焦显微技术记录钙内流动态过程,以钙内流荧光响应幅度及阳性响应比率进行评价。实验结果表明,在四种拓扑结构基底上细胞TRPV1和TRPV4的mRNA表达量均显著高于平面基底上相应值。免疫印迹实验证实了TRPV1和TRPV4在蛋白水平的表达,且拓扑结构基底上TRPV1和TRPV4免疫荧光染色强度较之平面基底相应值明显增高或趋于增高。在激动剂作用下,TRPV1介导的钙内流表现为快速去敏感化(25秒内)的瞬态内流,且拓扑结构基底上阳性响应细胞比例或相对荧光响应幅度较之平面基底相应值增高;而拓扑结构基底上细胞TRPV4阳性响应细胞比例和相对荧光响应幅度较之平面基底均全面明显升高。上述结果表明,TRPV介导的离子信号可能是基底拓扑结构优化HepG2细胞功能表型的重要信号机制。
宫颈癌的发病率在女性恶性肿瘤中占第二位。miR-124的表达在宫颈癌组织中显著下调。目前,发现在宫颈癌细胞中高表达miR-124可显著抑制宫颈癌细胞的生长、迁移与侵袭能力。此外,miR-124在宫颈癌细胞中的高表达还可显著抑制Cdcp1 基因的表达。Luciferase实验结果表明Cdcp1 是miR-124的直接下游靶标基因。在转染miR-124的宫颈癌细胞中高表达CDCP1蛋白可抵消由于miR-124引起的肿瘤抑制作用。这对揭示microRNA在宫颈癌发生、发展中的作用机制及基于microRNA的宫颈癌临床治疗具有一定的潜在意义。
目的:研究特异AT序列结合蛋白2(Special AT-rich sequence-binding protein 2,SATB2)在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9) 诱导的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)C2C12成骨分化中的作用。方法:首先用Ad-BMP9感染C2C12细胞,RT-PCR检测 SATB2 在基因水平上的表达变化,Western blot检测SATB2在蛋白水平上的变化;构建过表达SATB2重组腺病毒Ad-SATB2,感染C2C12细胞后,Western blot验证Ad-SATB2表达情况;用Ad-SATB2处理BMP9诱导的C2C12细胞,碱性磷酸酶(ALP)活性和染色检测成骨早期ALP的变化,茜素红S染色检测成骨晚期指标钙盐沉积的变化。结果:Ad-BMP9 处理C2C12细胞后,比对照组SATB2在基因水平和蛋白水平上表达量上调;Ad-SATB2可以在细胞中成功表达SATB2蛋白;用Ad-SATB2处理BMP9诱导的C2C12细胞后,ALP以及钙盐的沉积与对照比较均上调。结论:SATB2可以促进BMP9诱导的间充质干细胞C2C12的成骨分化。
目的:构建特异在皮肤表达乳头瘤病毒(HPV16) E6 基因的真核表达载体,并鉴定其在转基因小鼠体内的表达。方法:通过PCR方法扩增皮肤特异启动子pINV及 HPV16-E6 ,将以上片段通过酶切连接,插入去掉CMV启动子的pcDNA3.1(－)载体,获得dpcDNA3.1(－)-pINV-E6载体;并显微注射制备其转基因小鼠,利用RT-PCR、Western blot及免疫组化技术检测获得的阳性小鼠体内E6的表达水平。结果:dpcDNA3.1(－)-pINV-E6载体测序正确;经鉴定31只实验小鼠中,有2只小鼠携带外源基因,将其与野生型小鼠交配获得的F1代中又有2只阳性小鼠;且在获得阳性小鼠的皮肤组织中RT-PCR检测有E6的转录本,Western blot 检测有E6蛋白表达,且免疫组化检测结果显示有E6在皮肤表达且引起皮肤微增生。结论:成功构建了pINV-E6转基因模型小鼠, HPV16-E6 基因在小鼠皮肤中特异表达,为进一步研究HPV16-E6在癌症中的作用奠定了基础。
目的:进一步比较化脓链球菌中野生型和Y137A、W204A突变型FtsB蛋白的铁色素结合特性,确定铁色素结合位点。方法:制备野生型和Y137A、W204A突变型FtsB蛋白,采用ICP-MS和ITC比较其铁色素结合能力;Na2SO4还原实验比较铁色素的还原速率;CD热变性和盐酸胍化学变性实验比较其铁色素结合稳定性。结果:Y137A、W204A突变型FtsB蛋白的铁色素结合能力和结合稳定性均低于野生型蛋白,铁色素的还原速率均高于野生型蛋白,可见Tyr137和Trp204是FtsB蛋白重要的铁色素结合位点。结论:进一步确定了Tyr137 和 Trp204 氨基酸残基在FtsB与铁色素结合中的重要作用,为深入研究细菌中的铁色素转运机理及开发疫苗候选物奠定了一定的理论基础。
目的:研究不同碳源对于毕赤酵母菌株在发酵罐中高密度生长,以及对组成型翻译延伸因子-1(TEF-1)启动子指导下HPV16_L1蛋白表达的影响。 方法:利用1.5L发酵罐使用不同碳源进行毕赤酵母的高密度发酵,检测在不同碳源利用情况下菌体的增殖动力学,并以Western blot 动态分析HPV16_L1蛋白的表达水平。 结果:以甘油作为碳源,菌体细胞湿重可达到510g/L(OD600为189.4),HPV16_L1的表达在72h之前保持高水平;在甲醇和葡萄糖中菌体细胞湿重都可达到220g/L左右(OD600分别为75.3和77.3),甲醇利用下HPV L1蛋白在144h后仍保持较高水平表达,葡萄糖中60h HPV L1表达开始显著下降;在山梨醇作为碳源情况下菌体未能在发酵罐中获得高密度生长;总体上,甘油作为碳源在72h左右可获得最高的目的蛋白收获总量。 结论:为实现毕赤酵母高密度生长与异源基因在TEF-1启动子指导下高效表达,以及HPV L1蛋白的简易、有效制备提供了基础。
目的:为了进一步了解蜡样芽孢杆菌R75E胶原酶colR75E的特性,在大肠杆菌原核表达系统中表达colR75E胶原酶,并对表达的重组胶原酶进行纯化以及酶学性质研究。方法:以蜡样芽孢杆菌R75E基因组DNA为模板采用PCR法获得胶原酶colR75E基因,构建pET28a/colR75E重组质粒,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行诱导表达,利用Ni-NTA纯化的方式获得高纯度ColR75E胶原酶,利用胶原酶谱、胶原酶活力测定、Ⅰ型胶原蛋白降解产物电泳检测等方式对ColR75E胶原酶的酶学特性进行分析。结果:通过Ni-NTA纯化获得的蛋白经胶原酶谱、Ⅰ型胶原蛋白降解产物的检测时均表现出胶原蛋白的降解能力。在标准条件下测得其比活力为3.62 U/mg,Km为25.55μmol/L (2.93 mg/ml),Vmax为5.71μmol/(mg·min)。ColR75E胶原酶的最适反应温度为45℃,最佳反应pH为8.0。此外,ColR75E胶原酶对于不高于50℃的温度以及pH6.0~8.0的酸碱度范围具有良好的稳定性。ColR75E胶原酶可被Ca2+激活、但被Zn2+、Pb2+、Fe2+、Mn2+等金属离子抑制,抑制能力依次为Pb2+> Zn2+> Fe2+> Mn2+。ColR75E胶原酶对EDTA和EGTA的高敏感性进一步证实了该胶原酶为一种金属蛋白酶。结论:利用大肠杆菌原核表达系统获得高纯度高活性的蜡样芽孢杆菌胶原酶是可行的,为该胶原酶广泛应用于医疗、食品等工业领域中奠定了理论基础。
基于PCR的实验策略在生物工程研究中具有广泛应用,如定点突变(site-directed mutagenesis, SDM),DNA拼接和载体构建。引物设计是这类实验技术中的关键一环,因其直接影响扩增效率和PCR产物的拼合。在嵌合式引物设计方法(一对突变引物在5'端具有互补序列)的基础上,开发了一个在线工具Primer Spanner (PS),可简单高效获得设计定点突变引物。PS可应用于单碱基或连续多碱基替换、插入、敲除等突变形式。通过大量突变实验与测序验证,结果表明该工具设计的引物进行的定点突变效果良好1)。
SLiCE(seamless ligation cloning extract)是一种利用细胞裂解物体外无痕组装DNA的方法。针对细胞裂解物来源、λ重组系统的表达及组装片段摩尔比例等方面对现有SLiCE方法进行优化。首先,排除了酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的细胞裂解物在现阶段用于体外组装的可能性。同时,在大肠杆菌DH10B中导入L-阿拉伯糖诱导表达的λ重组系统,验证所构建的大肠杆菌的细胞裂解物可在体外拼接DNA片段,并将该种来源细胞裂解物用于后续组装。其次,设计并构建根据转化子颜色筛选阳性克隆的方法,并以该方法计算不同摩尔比例片段组装时的正确率。最后,使用优化过的SLiCE方法,成功组装可在酿酒酵母体内表达的黑色素合成模块。
流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis,JE)简称乙脑,是由乙脑病毒感染,流行在亚洲和太平洋地区重要的病毒脑炎,近年乙脑流行地区在不断扩大。目前尚无特效的治疗流行性乙型脑炎的方法,控制蚊虫传播和免疫接种是当前的主要防御手段。随着对乙脑病毒研究的深入,利用基因工程技术研制新型候选疫苗已成为预防乙脑新的发展方向。简要综述了乙型脑炎病毒的基因组结构及其蛋白功能,以及国内外乙型脑炎疫苗的最新研究进展。
谷胱甘肽(GSH)是细胞内主要的抗氧剂和氧化还原、细胞信号调节器,它能还原过氧化氢、清除活性氧(ROS)和含氮自由基使细胞免受氧化应激损伤。不管细胞内是否存在ROS氧化细胞蛋白,谷胱甘肽均能诱导氧化还原反应发生转变,进一步使信号传导功能及转录因子分子功能发生改变。大量实验表明,ROS和GSH在多条细胞信号调节通路中发挥着重要作用。主要阐述了Fas 、TNF-α和NF-κB信号通路及线粒体凋亡途径及GSH在这些通路中的作用。尤其是线粒体GSH耗竭能诱导线粒体内ROS显著增加,从而损害细胞生物能量和诱导线粒体通透性转换孔开启。根据线粒体损害程度,NF-κB信号通路可被抑制,肝细胞也可能经历不同的死亡模式(凋亡或坏死)并对刺激细胞死亡信号(如TNF-α)也更敏感。这些过程涉及许多肝脏疾病的发病机理。
果蝇(Drosophila)的求偶行为受多个基因调控,例如fruitless(fru)、dissatisfaction(dsf)和retained(retn)等。它们通过不同的剪切方式产生特异性产物,利用这些产物来控制雌雄果蝇的求偶行为,它们的剪切方式是雌雄果蝇求偶行为和性别决定所必需的。主要阐述了这些基因在果蝇求偶行为方面的分子调控机制,为进一步研究果蝇的求偶行为和性别决定提供理论依据。
毕赤酵母(Pichia pastor)表达系统是近年发展起来的一种高效表达外源蛋白的系统,利用该系统表达外源基因具有良好的应用前景。尽管毕赤酵母表达系统具有比较完备的基因表达调控机制和对真核基因表达产物的加工修饰能力,但由于基因本身及表达系统等诸多因素,仍然存在外源蛋白表达产量很低甚至不表达的情况。针对毕赤酵母表达系统这一因素,对表达载体的优化,毕赤酵母菌株优化及发酵条件优化进行了综述,以期为外源基因在毕赤酵母中的高效表达提供理论基础。
乙偶姻(3-羟基-2-丁酮)作为一种应用广泛的食用香料和重要的平台化合物,具有广阔的工业应用前景。与传统的化学合成方法不同,高效、环保的乙偶姻生物制备方法,可以减轻资源和环境压力,促进我国低碳经济的发展。近来,生物法制备平台化学品乙偶姻取得了丰硕的研究成果。总结了最近几年国内外在该领域最新的研究热点及方向,简述了发酵法生产乙偶姻的优势菌株概况,重点综述了以糖类物质为底物生产乙偶姻的最新策略及研究成果、将微生物改造为生产手性乙偶姻的高效细胞炼制工厂以及将2,3-丁二醇或双乙酰作为发酵底物的研究趋势,并介绍了乙偶姻的分离纯化工艺。使用非致病性的安全菌株,高效率地利用廉价底物,并采用经济、简单、环保的分离纯化方式,从而生产具有高附加值的食品级或高手性纯度乙偶姻,是生物法制备乙偶姻产业化发展的可靠保障。
腈类物质的生物转化符合绿色化工的要求,具有重要应用潜力。系统阐述了产腈转化酶微生物多样性和生物转化特点。从菌株的分离、产酶及诱导物的种类;酶作用的底物、获得的产物;基因表达、酶的耐受性以及其应用价值等方面进行了比较全面的综述。
环境和医疗实践中广泛存在的细菌抗生素抗性已经成为食品安全和人类健康领域的主要威胁。近年来的研究表明,病原菌主要通过水平基因转移而不是基因突变获得抗性,大量的研究支持病原微生物抗生素抗性基因的环境来源。系统论述了环境微生物抗生素抗性起源、进化及病原菌抗性基因与环境抗生素抗性组相互之间的交叉传播和水平转移机制,介绍了近年来环境微生物抗生素抗性组生态和进化生物学研究的最新进展和方法学应用。
目前海洋药物学的研究如火如荼,研究有特异活性的海洋天然产物,获取这类成分为人类提供新药,成为目前的研究重点。间苯三酚是一种重要的医药中间体,在海洋藻类中广泛存在,尤其在褐藻门中。作为一种亲肌性非阿托品非罂粟碱类平滑肌解痉药,主要用于治疗多种急性痉挛性疼痛。是胃肠道、泌尿生殖道痉挛及孕期宫缩治疗的首选药物,作用迅速,副作用少。目前主要通过化学法合成,但是由于化学法存在各种弊端,生物合成法成为制备间苯三酚的潜在手段和研究热点。就间苯三酚的化学合成法以及生物合成机制和制备方法进行了综述,并对间苯三酚的主要应用进行了归纳总结。
