目的: 构建前手性酮类化合物的重组全细胞催化体系,并研究CbFDH C-端无序的11个氨基酸与酶活性的关系。方法:利用基因工程方法构建野生型LbADH ,CbFDH及C-端11个氨基酸缺失的CbFDH截短突变体的表达菌株;SDS-PAGE分析其表达方式及表达量,利用分光光度计法测定全菌破碎上清中的酶活性;将含野生型LbADH及CbFDHΔ354-364的菌株与底物混合孵育,考察双菌全细胞体系的催化效果;并将含野生型CbFDH及CbFDHΔ的菌液分别与含野生型LbADH的菌株混合催化苯乙酮的转化,比较两种菌的协助转化效率。结果: 构建了重组表达载体pETDuet-1-adh,pETDuet-1-fdh及pETDuet-1-fdhΔ354-364,并实现了在大肠杆菌中的异源表达,含野生型LbADH 及CbFDH的两种菌株能够实现苯乙酮的协同转化,转化率为24.4%,产物对映体纯度为96.79% ;CbFDH及CbFDHΔ354-364分别占上清总蛋白的28.54%及37.72%,C-端的缺失未影响CbFDH的可溶性表达,但CbFDHΔ354-364全菌上清催化NAD+转化为还原型NADH的效率降低,为CbFDH粗酶液的29.82%;且重组菌株Rossetta(DE3)-pETDuet-1-fdhΔ354-364与Rossetta(DE3)-pETDuet-1-adh协同转化苯乙酮的转化率降低至8%。结论: 重组菌株Rossetta(DE3)-pETDuet-1-adh与Rossetta(DE3)-pETDuet-1-fdh能够协同催化苯乙酮转化,转化效率为24.4%,产物对映体纯度为96.79%;重组菌株Rossetta(DE3)-pETDuet-1-fdhΔ354-364与Rossetta(DE3)-pETDuet-1-adh协同转化苯乙酮的效率为Rossetta(DE3)-pETDuet-1-fdh与Rossetta(DE3)-pETDuet-1-adh协同转化效率的32.79%,且Rossetta(DE3)-pETDuet-1-fdhΔ354-364全菌上清催化还原型辅酶再生的效率降低,提示C-端无序的11个氨基酸残基对CbFDH酶活性的发挥起着重要的作用。
从高温大曲中筛选到一株产酯化酶的地衣芽胞杆菌G2。采用低温等离子体对G2进行诱变,以筛选酶活提高最多的3株菌株作为亲本。将亲本原生质体灭活后对其进行基因组改组。将融合后的菌体进行筛选纯化之后,对融合子进行发酵测定其酶活并挑选酶活较高菌株进行传代测定其酶活稳定性。结果表明6#融合子酶活最高且稳定为10.7U/ml,相对于初始菌株的5.3U/ml提高了102 %。对其发酵液进行气相色谱分析表明,6#融合子代谢产一定量的酸类、酯类及醇类等物质,其中乙偶姻含量达 2565mg/L。
考察了柠檬酸钠对S-腺苷蛋氨酸(SAM)和谷胱甘肽(GSH)联产发酵的影响,发现柠檬酸钠有利于SAM和GSH的联合高产。采用响应面分析法对柠檬酸钠浓度及其添加时间进行优化,模型预测和验证实验结果均表明在联产发酵6 h时一次性添加10 g/L柠檬酸钠的效果最佳。通过对SAM和GSH联产发酵过程进行分析,发现柠檬酸钠能够显著提高胞内NADH和ATP的水平,为SAM和GSH的过量合成提供了足够的能量物质,也为类似耗能化合物的生物合成及其发酵高产提供了可行的优化策略。
通过补加植物油(菜籽油、玉米油、豆油)、油酸甲酯、玉米浆,考察其对多杀菌素发酵产量的影响。结果显示,在96h补加3%的混合油脂(油酸甲酯:菜籽油=2:1),同时在96h和144h分别补加1%的玉米浆可使多杀菌素的产量提高2.11倍,发酵单位达到804.59 mg/L,为实现工业化生产奠定基础。
将来源于嗜热单孢菌(Thermobifida fusca)的海藻糖合成酶基因进行克隆表达,构建重组菌E.coli BL 21(DE3) {pET-24a(+)/Tres}。并对基因工程菌的发酵产酶条件进行优化,得到最优培养基成分为:甘油12 g/L,酵母粉24 g/L,蛋白胨12g/L,磷酸盐浓度60mmol/L,Zn2+ 2mmol/L。最佳培养条件为:装液量20 ml(250 ml摇瓶),发酵2 h后25 ℃诱导并添加终浓度为0.4 mmol/L的IPTG。优化后的最终发酵酶活达到28.6 U/ml,为未优化前的3.4倍,是目前国内报道大肠杆菌摇瓶发酵产海藻糖合成酶的最高表达水平,为该酶的工业化生产奠定了基础。
