目的:瞬转以及筛选出能够稳定表达URI(RPB5-mediating protein)基因的SMMC-7721细胞株,以其为模型研究URI基因对人肝癌SMMC-7721细胞增殖的影响。方法:首先,抽提URI的重组质粒并转染到SMMC-7721细胞中,在G418药物的筛选下选出能够稳定表达URI基因的细胞株,RT-PCR法和酶切检测该稳定细胞中URI基因的表达效率以确认URI是否稳定表达,MTT法和克隆形成实验检测URI基因对SMMC-7721细胞增殖的影响。结果:成功建立URI基因过表达的稳定细胞株。与SMMC-7721细胞对照组比较,其URI mRNA表达水平显著上调,能稳定表达URI细胞株的增殖,克隆形成率明显升高。结论:pFLAG-CMV-4-URI重组质粒能使URI在肝癌SMMC-7721细胞内稳定表达,过表达URI基因有可能帮助细胞通过G2/M期检验点来提高肝癌细胞SMMC-7721的增殖能力。
目的:获取人组氨酸磷酸酶蛋白PHP14基因,并构建其N端和C端GFP融合的真核表达载体,建立过表达PHP14的NIH-3T3细胞系,并观察其对NIH-3T3细胞体外增殖和非锚定依赖性生长的影响。方法:以HeLa cDNA为模板,PCR扩增PHP14的全长编码基因,分别克隆到pEGFP-N2和pEGFP-C3载体中,构建pEGFP-N2-PHP14和pEGFP-C3-PHP14真核表达载体,利用脂质体将构建的载体转染到NIH-3T3细胞中,MTT法检测细胞增殖,软琼脂成集落法检测体外非锚定依赖性生长能力。结果:成功构建了过表达PHP14的真核表达载体pEGFP-N2-PHP14和pEGFP-C3-PHP14,并在NIH-3T3细胞中检测到了目的基因的过表达,PHP14在NIH-3T3细胞中过表达并不影响NIH-3T3细胞的体外增殖,但赋予了NIH-3T3细胞非锚定依赖性生长的能力。结论:成功构建了过表达PHP14的NIH-3T3细胞模型,在NIH-3T3细胞中过表达PHP14并不影响NIH-3T3细胞的体外增殖,但赋予了NIH-3T3细胞非锚定依赖性生长能力。
目的: 探讨聚乙二醇(PEG)修饰重组溶葡球菌酶(lysostaphin)的反应条件以及修饰后产物的纯化方法。方法: 采用超声波细胞粉碎机进行菌体破碎,阳离子交换层析、疏水层析进行蛋白纯化;在不同条件下,将活化的单甲氧基聚乙二醇琥珀酰亚胺丙酸酯(mPEG-SPA)与纯化后的lysostaphin反应,以单个PEG-Lysostaphin的比例为指标,用SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS方法确定其在修饰产物中的所占比例;采用Sephacryl S-200分子筛凝胶层析法对修饰产物进行分离纯化。结果: mPEG-SPA修饰lysostaphin的反应条件为pH 8.0,温度4℃,lysostaphin与mPEG-SPA的质量比为1:5,反应时间2.0h;反应产物经一步Sephacryl S-200分子筛凝胶层析纯化后,初步实现分离。结论: 初步确定了聚乙二醇修饰lysostaphin的反应条件及修饰产物的纯化方法。
目的:观察人脂肪干细胞(hADSCs)诱导分化的成骨样细胞在海绵状的猪小肠粘膜下层(SIS)表面的生长情况,探讨三维立体海绵状的SIS能否促进成骨样细胞的增殖和分化。方法:采用物理和化学结合的方法将猪近段空肠制备成脱细胞的SIS,再将薄膜状的SIS经液氮低温研磨制成微粒,交联后采用冷冻干燥技术重塑形为海绵状的SIS;原代培养hADSCs,流式术检测表面抗原,诱导其成骨、成软骨、成脂分化并染色鉴定;将诱导的成骨样细胞与海绵状SIS复合培养,扫描电镜观察细胞形态;应用SIS材料浸提液培养成骨样细胞,MTT法检测细胞增殖情况,ALP活度检测成骨分化情况。结果:脱细胞的SIS未见有核物质,海绵状的SIS呈三维立体状,具有大量均匀一致的孔隙;原代培养的hADSCs表达干细胞相关抗原,并可分化为成骨样细胞,茜素红将钙结节染成紫红色。成骨样细胞与海绵状SIS复合培养后,细胞生长旺盛增殖能力强,ALP表达量明显增加。结论:海绵状的SIS具有均匀的三维孔隙,细胞相容性好,能明显促进hADSCs来源的成骨样细胞的增殖及成骨分化,可成为骨组织工程新型的三维立体天然生物衍生材料。
ftsZ基因是控制细胞分裂的关键基因,其蛋白能够在分裂位点形成一个环状结构而影响细胞分裂。为了研究木薯质体分裂与木薯淀粉品质形成的关系,根据木薯基因组数据库上的预测序列,设计引物,从木薯基因组中分离了与质体分裂相关的ftsZ家族3个新基因(ftsZ1, ftsZ2, ftsZ3 )。分别将它们与荧光蛋白基因(GFP)融合,构建了3个原核表达载体pET-ftsZ1-GFP 、pET-ftsZ2-GFP、pET-ftsZ3-GFP,并转化大肠杆菌BL21(DE3)。通过荧光显微镜观察菌体的表型和分裂,初步鉴定了木薯质体分裂相关基因ftsZ家族对细胞分裂的作用。结果显示:尽管木薯与大肠杆菌的亲缘关系较远,ftsZ基因的同源性较低,但是两者表现出相似的功能,木薯ftsZ基因的表达能严重影响大肠杆菌细胞分裂。这一结果为进一步研究木薯ftsZ家族基因的功能奠定了基础。
以灰黄青霉菌(Penicillium griseofulvum HL)为出发菌株,试验得到灰黄青霉原生质体制备的优化条件为:菌体培养48h,用0.7mol/L的NaCl溶液作为渗透压稳定剂,用0.5%的蜗牛酶+0.5%的纤维素酶,在pH为6,30℃条件下酶解3h,所得原生质体数最多,达到3.14×107/ml。原生质体再生的最佳条件为采用双层平板培养法,在用0.7mol/L的蔗糖溶液配制的改进察氏培养基上其再生率最高,达到24.93%。灰黄青霉原生质体经过紫外线诱变,DES诱变,紫外线-DES诱变复合诱变,紫外线-氯化锂复合诱变选育异抗坏血酸高产菌株,通过对再生平板上长出的诱变菌株进行初筛和摇瓶复筛,最终获得一株异抗坏血酸产量较高的菌株ZD4,其产量为5.28mg/ml,提高到出发菌株产量(1.08 mg/ml)的488.9%,且连续传代6代遗传稳定。
为提高微生物产L-谷氨酸氧化酶水平,将Streptomyces sp.X-119-6的L-谷氨酸氧化酶基因(LGOX)与表达载体pET28a连接,导入E.coli BL21(DE3),实现LGOX的高效表达。采用HisTrapTMFF亲和层析柱对重组L-谷氨酸氧化酶进行纯化, 并对纯酶的酶学性质进行了研究。结果表明:在IPTG终浓度为0.4 mmol/L下,30℃诱导6 h,可以获得比酶活为1.1 U/mg的粗酶液;重组酶的最适反应温度和pH分别为37℃和5.0;Km值为2.12 mmol/L,Vmax为1.06μmol/min·mg, 对L-谷氨酸具有专一性;具有良好的应用前景。
目的:实现棘孢木霉(Trichoderma asperellum)几丁质酶基因tachi2 的原核高效表达,研究几丁质酶Tachi2的酶学性质。方法:利用PCR技术扩增得到几丁质酶基因tachi2,将其克隆到原核表达载体pEHISTEV中,测序后,转化大肠杆菌BL21感受态细胞,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)诱导后进行Tachi2蛋白的纯化和复性。用纯化的目的蛋白Tachi2进行几丁质酶酶学性质的研究。结果:tachi2 基因在重组大肠杆菌中正确表达,其主要以包涵体形式存在;重组蛋白Tachi2分子量约为44kDa,经过纯化和复性后得到的Tachi2有较高的几丁质酶活性。该酶的最适温度为40℃,最适pH值为7.0,几丁质酶在40℃以下比较稳定、pH 6~9时酶有较高活性,受Cu2+和Zn2+的强烈抑制。结论:成功实现了棘孢木霉几丁质酶基因 tachi2 的原核高效表达,表达纯化了重组蛋白,明确了几丁质酶 Tachi2的酶学性质,为该几丁质酶的进一步开发利用和深入研究奠定了基础。
高性能的生物表面活性剂脂肽在医药、食品、化妆品及微生物采油等领域具有广泛的应用价值。利用高效液相色谱法和电喷雾质谱法分析了Bacillus subtilis CICC 23659所产脂肽的组成,结果表明其所产脂肽是由surfactin的同系物C13、C14和C15组成,其分子量分别为1008、1022和1036。以生物量、脂肽产量、脂肽组成、乳化能力和临界胶束浓度等指标考察在培养基中投加不同浓度的Fe2+对B. subtilis CICC 23659的影响,结果表明添加Fe2+不仅能够提高B. subtilis CICC 23659的生物量,还能大幅提高脂肽产量。当Fe2+添加浓度为5 mmol/L时,生物量达到最大3.69 g/L,提高了6倍,脂肽产量也达到最大234.08 mg/L,提高了9.5倍。Fe2+作用下脂肽同系物中C13、C14、C15在脂肽产物中的相对含量发生了变化,脂肽同系物C13和C15的相对含量降低,脂肽同系物C14的相对含量上升。脂肽同系物中C13的相对含量越高,CMC值越大,脂肽同系物中C14和C15的相对含量越高,CMC值则越小。
为提高慢病毒载体应用的安全性及改进HCV新型颗粒疫苗的制备,首先对传统的慢病毒三质粒系统进行改造:将包装质粒pHR’CMVΔR8.2改造成整合缺陷型的包装质粒pHR’CMVΔR8.2D64E,并在体外感染实验验证其整合缺陷性;将转移质粒中的报告基因GFP替换成HCV的NS3基因,选用表达3种亚型(1a、1b、2a)HCV包膜E1E2的包膜质粒,用改造后的三质粒系统制备了3种亚型(1a,1b,2a)的假型丙型肝炎病毒(HCV)整合缺陷型慢病毒颗粒,并用Western blot方法确定了颗粒上包膜蛋白的表达,通过电镜可观察到浓缩后的HCV慢病毒颗粒结构,HCV慢病毒颗粒感染Huh7细胞后可观察到转基因NS3的表达。为安全高效的慢病毒载体的应用及HCV假型颗粒疫苗研发提供了新的技术路线。
目的:利用基因工程方法构建人源性脂联素球状结构(gAd) 基因的高效原核表达体系,并对重组蛋白进行诱导表达、纯化、鉴定及活性检测。方法:从正常人脂肪组织里面提取总RNA,反转录合成cDNA,经PCR扩增、酶切后连入pET-22b(+)载体构建重组质粒pET-22b(+)-gAd,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。经诱导剂诱导后目的蛋白以包涵体形式产生,采用强碱促溶包涵体并用丙酮沉淀蛋白的方法进行复性和纯化,得到高纯度的人源性gAd。运用SDS-PAGE、Western blotting对重组蛋白进行鉴定,通过对蛋白激酶(AMPK)的磷酸化水平和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用来检测纯化蛋白的生物学活性。结果:成功构建了原核表达载体pET-22b(+)-gAd,实现了人源性gAd在原核细胞中的表达,并对形成的包涵体变性、复性和纯化,纯化出的蛋白经过SDS-PAGE 和Western分析证实为gAd;通过对AMPK的磷酸化水平的检测和对小鼠的心肌缺血再灌注损伤的保护作用证明纯化出的gAd具有高生物学活性。结论:成功构建、表达和纯化了无标签、高生物学活性的人源性脂联素球状结构(gAd),为其进一步的理论研究、生产开发奠定了基础。
为稳定完整表达人甲状旁腺激素(hPTH)(1-34)二联体与人血清白蛋白(HSA)融合蛋白,以酿酒酵母为宿主,利用重叠PCR 技术,将α-factor基因拼接到hPTH(1-34)ab-HSA 基因片段上,获得α-hPTH(1-34)ab-HSA,并插入穿梭表达质粒pYX212,构建了基因工程菌S.cerevisiae W303-1A/pYX-α-hPTH(1-34)ab-HSA。经Western blot分析及N端氨基酸测序表明,该工程菌表达分泌了具有HSA和hPTH抗原性的完整hPTH(1-34)ab-HSA融合蛋白,解决了毕赤酵母不能稳定完整表达融合蛋白hPTH(1-34)ab-HSA的问题。
鼠李糖脂是一种性能优良的生物表面活性剂,在生物医药、环境保护、二次采油等方面具有很高的应用潜力。采用响应面分析法,对铜绿假单胞杆菌O-2-2的培养基进行了优化。Plackett-Burman(PB)实验设计表明,磷酸盐、硝酸盐和微量元素对鼠李糖脂的产量具有显著影响。Box-Behnke(BB)优化确定最佳培养基组成为磷酸盐、硝酸盐和微量元素用量分别为3.2g/L、13.76g/L和5.17ml,理论的最大产量为8.48g/L,与实测糖脂产量8.85g/L接近。摇瓶优化后的鼠李糖脂产量较优化前的6.24g/L提高了30.8%。最优化条件下采用10%的接种量逐级放大,并通过补料发酵,最终200L罐的鼠李糖脂产量达到70g/L,发酵时间仅为110h。采用新发明的二次蒸馏工艺,鼠李糖脂纯度达86.6%。液质联用(LC-MS)分析表明所生产的鼠李糖脂成分及含量为:双糖单脂32.9%、双糖双脂17.02%、单糖单脂3.16%、单糖双脂33.54%。
氧气在环境胁迫强的高浓度乙醇发酵中具有重要作用。考察了自絮凝酿酒酵母在多种通气策略下的乙醇发酵及絮凝状况。使用氧化还原电位(ORP)检测发酵液中氧浓度并划分了厌氧、微氧和好氧状态。厌氧条件下的终点乙醇浓度最低(119±1.5 g/L);微氧条件下使用ORP精密控制氧气供给取得较高的乙醇浓度(131±1.8和125±1.7 g/L);在通气量0.2 vvm的好氧条件下,生物量、甘油量和乙醇损失皆最大,与最优收率相比较乙醇收率降低了12.2%。高通气量增强了细胞的絮凝能力,增大了絮凝体粒径。绘制雷达图进行综合评价,恒定通气0.05 vvm的过程在乙醇生产和絮凝各方面表现均突出。
近些年,具有抗肿瘤生物活性的人工合成多肽受到广泛的关注。尽管受技术条件的制约,目前多数抗肿瘤肽类药物的半衰期较短,但抗肿瘤肽类药物具有其独特的优势:它们分子量小、抗肿瘤特异性高、免疫原性低,并且易于合成和改造。目前,多种抗肿瘤肽及其衍生物已上市或进入临床研究,以肽为基础的治疗不仅高效低毒,还可以增加肿瘤对其他治疗方法的敏感度,对于肿瘤的临床治疗将具有重要价值。综述了诱发肿瘤坏死活性肽、细胞凋亡肽及功能阻断肽等几种新型天然抗肿瘤活性肽诱发肿瘤死亡的作用,并归纳其应用前景。
外源DNA导入细胞并与基因组靶基因发生同源重组可以精确修饰或替换靶基因,但在植物中产生自发同源重组的概率很低。近几年出现的人工改造核酸酶可以大幅提高同源重组的效率,实现基因组的精确、定向改造。其中,归巢核酸酶、锌指核酸酶和TALE核酸酶已在植物基因工程中得到成功应用,最近开发出来的基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术则更具有高效方便等特点。这些人工核酸酶的应用为植物基因工程的发展呈现了更加美好的前景。首先介绍了基因组编辑技术及其发展历程,随后详细阐述了提高植物基因组定点编辑效率的策略,最后对基因组编辑技术在农业和植物基因工程上的应用进行了展望。
生物乙醇作为一种可再生的清洁能源,正在引起人们的广泛关注。酿酒酵母是乙醇生产中最常用的发酵菌株,但是乙醇耐受性往往成为限制酿酒酵母菌乙醇产量的重要因素。选育耐受高浓度乙醇的酵母菌株对于提高乙醇产率具有重要意义。然而传统的菌株改良方法具有育种周期长,突变方向不定等缺点。主要综述了近年来国内外对酿酒酵母菌耐受乙醇的分子生物学机理方面的研究成果,进而总结了提高酿酒酵母乙醇耐受性的基因工程、代谢工程。
构建生产细胞系是重组抗体产业化制备的第一步。目前国际上用于重组抗体生产的工程细胞系表达水平可达20~70pcd。多种动物细胞根据其特性的不同,在抗体药物生产中有着不同的应用。近年来,工程细胞系构建技术的研究进展主要集中在以下三个方面:利用细胞工程技术提高宿主的生长、表达能力,新型载体功能元件和定点整合技术克服载体随机整合时发生的"位置效应",以及应用流式细胞分选术和高通量筛选机器提高重组细胞的筛选通量和效率。
治疗性单克隆抗体药物经历了三十多年的发展,已经成为生物医药的最重要组成部分之一。在疾病治疗上具有广阔的应用前景,成功用于治疗肿瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病和移植排斥反应等多种疾病。截至2012年已有29种治疗性单克隆抗体药物通过FDA审批并上市销售。治疗性单抗的安全性和有效性很大程度上由其作用的靶点决定,上市和在研的单抗药物有些靶向相同的靶点,有些有自己独特的作用靶点,新的作用靶点也在不断出现。以治疗性单抗的作用靶点为切入点,对目前上市销售和研发中的此类药物进行了简要总结。详述了肿瘤坏死因子α、白细胞分化抗原20、表皮生长因子受体及血管内皮生长因子等4种靶点的特点及相关单克隆抗体药物的情况,并对我国单抗药物的现状进行了分析,提出未来发展对策。
为深入研究转基因玉米所表达的植酸酶蛋白的酶学性质,评价重组蛋白的致敏性和饲用安全性,必须获得高纯度植酸酶蛋白。利用识别4个不同表位的单克隆抗体制备了植酸酶蛋白亲和层析体系。结果显示,通过80%硫酸铵沉淀植酸酶蛋白粗提液初步浓缩目的蛋白后,再经过透析去除高浓度盐离子,进而通过免疫亲和层析可获得在SDS-PAGE胶上条带单一的植酸酶蛋白,比活可达470.99 U/mg。同时,将上述免疫亲和层析法对植酸酶的纯化效果与离子交换层析方法进行了对比,结果表明免疫亲和层析法具有稳定、快速和纯化产物比活高等优势,所获得的目的蛋白满足各种检测要求,优于离子交换层析方法。
采用PPT抗性筛选、PCR扩增、PCR-Southern杂交、ELISA、Western杂交等方法,对花粉管通道法介导IL-4 基因转化大白菜的后代进行了分子生物学检测,同时结合统计分析手段研究了IL-4 基因在转基因大白菜后代中的遗传规律。结果表明:(1)PPT抗性的转基因大白菜,T4代植株PPT抗性的阳性率为33.43%,IL-4 基因PCR扩增的阳性率为1.39%。IL-4 的分离情况不符合孟德尔分离定律。(2)对T4代5个株系的14个PCR阳性株进行ELISA检测,其中有7份样品为阳性,IL-4表达量约为326.87~1233.13 ng/g FW,同一株系内各株间IL-4的表达量差异显著。(3)Western杂交进一步证实IL-4在转基因大白菜后代中能正常表达。PCR-southern杂交表明IL-4 基因已整合到大白菜基因组中,且在转基因后代植株中仍然存在。
近年来,转基因技术与产品在中国的传播遭遇了一定障碍。科学界和相关政府部门往往从科学知识的普及角度克服这些障碍。但实际上,转基因传播障碍的背后有着更为隐蔽的反智的社会态度及对传统农业的迷恋心理,三个因素都与中国传统直观外推思维方式有关。转基因传播所面临的实际是构造自然观与有机自然观之间的冲突。对有机自然观的误读与当前弥漫的反智主义关系密切,转基因带有"高科技"的突出特征,恰恰容易成为反智主义攻击的对象。在有机自然观和"反智"传统的影响下,社会上对传统农业的迷恋有着相当的市场。在此情况下,转基因技术要克服传播障碍,必须重构环境,除了以经济动力继续推动传播工作外,也要让技术发展与人们普遍接受的自然观相结合。
