中国生物工程杂志

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赵玉娇, 潘玥, 阎玲梅, 岳耀斐, 杨丽娟, 孙强明

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 1-7.

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目的:选育能在人胚肺二倍体细胞KMB17上稳定增殖的Ⅱ型登革病毒适应株,为研发以人源性细胞为基质的登革疫苗候选株奠定基础。方法:将Ⅱ型登革病毒中国株D01090提取病毒基因组,通过RT-PCR法进行登革病毒型别鉴定后,在C6/36和Vero细胞上进行毒种扩增和滴度测定;将D01090毒株以4.0MOI接种KMB17细胞并反复传代至病毒完全适应在细胞内扩增,并连续传代10代,选育出良好的KMB17细胞适应株;病毒培养液经蔗糖梯度离心和超速离心后获得高浓度病毒液,接种KMB17细胞后通过透射电镜超薄切片检测细胞的病理变化;然后经过三轮蚀斑纯化筛选出纯化病毒株,免疫荧光法检测病毒纯化株的抗原性。结果:以Ⅱ型登革病毒中国株D01090基因组为模板,能扩增出511bp的登革病毒特异基因和119bp的Ⅱ型登革病毒型特异性基因。病毒经C6/36细胞扩增后滴度达4.5CCID₅₀/ml,感染KMB17细胞至第三代可产生明显的细胞病变(cytopathic effect,CPE),连续传10代细胞病变速度逐渐增快,至第10代达到增殖高峰,病毒滴度达5.0CCID₅₀/ml;将病毒感染6天后病变达+++的KMB17细胞进行超薄切片后经透射电镜观察细胞的病理变化,镜下可观察到内质网中新组装成的病毒颗粒,细胞周围产生很多分裂的小碎片,伴有游离出胞的病毒;三轮蚀斑纯化后筛选出纯化克隆,免疫荧光法检测病毒的抗原性呈阳性。结论选育出了能稳定传代且病毒扩增量高的Ⅱ型登革病毒KMB17细胞适应株,经蚀斑纯化后仍保持较好的抗原性。

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热休克蛋白HSP65抑制肿瘤新生血管形成的药效学实验研究

谢燕飞, 陈颖瑛, 左爱仁, 曹荣月

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 8-13.

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观察卡介苗来源的热休克蛋白HSP65对肿瘤新生血管形成的影响并初步探讨可能的作用机制。通过基因工程手段获得纯化的重组HSP65蛋白,与弗氏佐剂联合给药。构建皮内接种黑色素瘤B16-F10细胞的小鼠模型。通过在肿瘤接种前长期的多次给药,发现Hsp65能够在小鼠体内诱导高滴度的特异性抗体,并显著抑制肿瘤周围新生血管的形成,抑制率达到41.01%。经免疫组化技术对肿瘤表面VEGF的表达水平进行分析,结果表明HSP65免疫组VEGF表达量明显下降,提示了该疫苗作用的可能机制。

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Notch信号参与BMP9诱导的间充质干细胞成骨分化及其机制的初步探讨

谢佳瑛, 胥文春, 徐道晶, 张晓艳, 唐敏

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 14-22.

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目的:探讨Notch信号对骨形成发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导间充质干细胞成骨分化的影响以及作用机制。方法:用腺病毒AdGFP和AdBMP9处理C2C12细胞,细胞化学染色检测早晚期成骨指标碱性磷酸酶(ALP)和钙盐沉积,了解BMP9对间充质干细胞晚期成骨的影响;采用细胞密度实验以及DAPT(Notch信号通路抑制剂)处理C2C12细胞检测Notch信号靶基因Hey1、早晚期成骨指标ALP和OCN的表达;在DAPT处理下,用RT-PCR检测 Notch信号对C3H10T1/2中BMPs信号受体、成骨指标Runx2、Col1a-α表达的影响,用WB检测Smad1/5/8以及p-Smad1/5/8的表达。结果:BMP9对于C2C12早晚期成骨均有影响。抑制C3H10T1/2中Notch信号后,ALK2、p-Smad1/5/8以及Runx2和Col1a-α表达均有所下调。结论:Notch信号参与了BMP9介导的间充质干细胞早晚期成骨的分化,其可能机制是其BMP9增强了Notch信号配受体的表达,同时Notch信号也反馈上调了BMP9受体表达,并对p-Smad1/5/8以及转录因子Runx2及Col1a-α的表达产生影响,增强了成骨分化。

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抗IgE单链抗体在大肠杆菌中可溶性高效表达条件的研究

刘启刚, 代云见, 张勇侠, 王保成, 王明蓉

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 23-28.

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目的:以抗IgE单链抗体(anti-IgE scFv)为研究对象,以大肠杆菌周质高效表达可溶性单链抗体为目标,研究不同宿主细胞、培养基及培养条件对可溶性单链抗体表达产量的影响。方法:构建Rosetta(DE3)、BL21(DE3)和SoluBL21(DE3)三种大肠杆菌工程菌,研究不同碳源、氮源、培养基配方和培养条件对可溶性抗IgE单链抗体产量的影响。结果:携带抗IgE单链抗体基因的pET-IgE26质粒在新型宿主SoluBL21(DE3)中的表达产量明显优于传统的Rosetta(DE3)和BL21(DE3)宿主菌。经碳氮源筛选、培养基和培养条件的优化,确定SoluBL21(DE3)工程菌高效表达可溶性重组抗体的最佳培养基为:以M9培养基为基础,添加0.5%葡萄糖、0.6%酪蛋白胨和0.02%微量元素。最佳的培养条件为:以LB为种子培养基,37℃过夜培养至OD₆₀₀为3.0左右,以5%接种量接种于最佳发酵培养基中;接种后细胞生长条件:37℃,260r/min,培养3.5h;细胞诱导培养条件:当OD₆₀₀为1.5～1.8时,降温至25℃,添加0.1mmol/L IPTG,220r/min继续培养16h。经抗原ELISA检测,抗IgE单链抗体的可溶性表达量比原始对照组提高了5倍。结论:通过对宿主细胞类型的筛选、培养基及培养条件的优化,可以显著提高重组单链抗体在大肠杆菌周质空间内的表达产量。该研究结果不仅为规模化制备抗IgE单链抗体提供了技术支持,同时为大肠杆菌生产重组小分子抗体提供了有价值的参考。

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三个逆境相关的水稻启动子的克隆与瞬时表达分析

申秋硕, 陈凤, 叶青, 李涛, 陈信波, 张先文

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 29-34.

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为了克隆和研究逆境诱导型水稻启动子的功能,根据前期工作所获得的高温条件下水稻幼穗的表达谱数据,结合对GEO数据库中有关水稻逆境芯片数据的检索与分析,选取了3个对高盐和高温显著响应的基因(Os11g0453900, Os09g0526600, Os05g0381400)。基于这3个基因ATG上游1.5kb的启动子序列的生物信息学分析,克隆了这3个启动子中包含有多个ABA、高温、高盐等逆境响应元件的DNA片段,分别命名为Rab16Dp、OsHsfB2cp和PM19p,并通过农杆菌介导转化烟草叶盘进行了瞬时表达分析。结果表明:高温、高盐对Rab16Dp和OsHsfB2cp启动子有较明显的诱导效应,而对PM19p的诱导效果不明显。实验为这3个启动子功能的进一步研究奠定了基础,也将为逆境诱导型水稻启动子的挖掘和鉴定提供重要线索。

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转基因抗虫棉棉籽组分的代谢组学研究

孙彩霞, 汪莹, 吴晓菲, 陈利军, 武志杰

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 35-41.

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采用核磁共振氢谱(¹H NMR)获取不同转基因抗虫棉棉籽及其非转基因对照棉籽的代谢物谱,并结合多维统计分析探查植物基因工程操作是否引发棉籽中代谢产物种类和数量的非预期改变。结果表明,不同棉籽的¹H NMR谱图轮廓基本特征相似,均可分为氨基酸区、碳水化合物区及芳香区;当谱图按分区扩展后,多处峰信号在转基因与非转基因对照间有明显的不同。采用偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)可实现转基因抗虫棉棉籽与非转基因对照的代谢轮廓判别且分类的效果优于主成分分析(PCA)方法。转基因抗虫棉籽与其非转基因对照间的主要差异代谢物与初级氮代谢、三羧酸循环及脂肪酸代谢有关。

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组成型激活基因DREB2A载体的构建及其对烟草的遗传转化

赵清, 王罡, 季静, 金超

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 42-48.

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为探索DREB2ACA基因(constitutive activate DREB2A, 组成型激活DREB2A基因)在植物抗盐反应中的功能及其在植物抗逆基因工程中的运用,用SOE-PCR(overlapping extension-PCR,折叠延伸PCR)方法克隆了DREB2ACA,并将其置于盐诱导的rd29A启动子控制下,构建了植物表达载体,并通过农杆菌介导的方法将目的基因转入烟草。Southern blot证明了目的基因成功整合到烟草基因组中。RT-PCR表明,目的基因受盐胁迫诱导表达。在盐处理条件下,转基因烟草比对照具有更好的生长状态,含有较高的光和色素,具有较高的光合速率及较低的MDA含量。说明DREB2ACA的表达提高了植物抗逆能力,该基因在抗盐领域具有广阔的应用前景。

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三叶半夏(Pinelliaternata (Thunb.) Breit)的间歇浸没培养

贾明良, 张本厚, 高伟平, 陈集双, 欧阳平凯

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 49-54.

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目的:利用间歇浸没培养反应器对药用植物三叶半夏(Pinellia ternata (Thunb.) Breit)进行组培快繁研究。方法:以增殖倍数、鲜重、平均鲜重、折干率和组培苗状态为指标,一方面对三叶半夏叶片、叶柄及丛生芽体进行培养,考察适合间歇浸没培养的外植体类型;另一方面以叶柄为外植体对三叶半夏进行间歇浸没培养、固体培养和液体摇瓶培养,考察三种培养方式对其生长的影响。结果:不同的外植体在反应器内培养时,从增殖情况来看,丛生芽作为外植体得到的增殖倍数高达39.15,叶柄为27.65,叶片为18.05。鲜重方面与增殖倍数具有相同的规律。从平均鲜重和折干率来看,无显著差异。由组培苗形态来看,以叶柄诱导的组培苗最为健壮,而以丛生芽诱导的组培苗则较为细弱。不同培养方式下的增殖倍数分别为:间歇浸没培养方式最高为24.73,其次固体培养为14.75,液体摇瓶培养为12.26,差异显著。平均鲜重和折干率均为间歇浸没培养最优。由组培苗形态来看固体培养优于间歇浸没培养,反应器得到的组培苗较为细弱。在保卫细胞长宽和叶绿体个数上两者没有显著性差异。而液体摇瓶培养玻璃化导致叶绿体个数减少,不适合培养三叶半夏的。结论:较适合间歇浸没培养的外植体类型为叶柄和丛生芽,以叶柄为优。间歇浸没培养方式相对于传统的固体和液体培养在各项生理指标上表现较好,具有大规模培养三叶半夏的潜力。

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蛋白质谷氨酰胺酶基因的合成表达及性质研究

汪正华, 朱蓓霖, 赵云, 周杰, 吴自荣, 黄静

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 55-60.

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蛋白质谷氨酰胺酶(Protein-glutaminase,PG)是引起蛋白质脱酰胺作用的一种新型水解酶,在食品工业中具有十分广泛的应用前景。通过重叠延伸PCR法合成了PG全长基因,将其成熟肽序列克隆至原核表达载体pET32a(+)上,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,重组蛋白主要以包涵体形式表达。通过降低诱导温度和共表达分子伴侣两种策略,以期实现重组蛋白的可溶性表达,结果发现低温对可溶性的提高有一定的作用,而分子伴侣影响甚微。收集包涵体经变性、复性后获得活性PG。将PG与底物Cbz-Gln-Gly进行孵育反应,结果表明,PG可有效水解Cbz-Gln-Gly谷氨酰胺残基上的氨酰基,释放出氨;酶学性质的研究表明,此酶的最适反应温度为40℃,最适作用pH为6.0。实验为PG酶的研究和开发提供了理论依据和重要参考。

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热带假丝酵母木糖乙醇发酵相关基因的筛选与分析

徐勇, 沈翀, 邱兴天, 蔡鹏, 黄敏仁, 余世袁

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 61-69.

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以木糖代谢模式菌株热带假丝酵母为材料,采用抑制性消减杂交技术构建高质量的木糖、葡萄糖发酵产乙醇的正向、反向SSH-cDNA文库。采用ABI3730系统测定2个文库中的1 013和525条EST序列,共拼接注释得到正向、反向文库中525个和288个差异性表达的已知基因,另有67个和12个可能的新基因,并对已知基因进行了GO分类。通过文库间BLAST比对去除相似序列,再结合经典代谢理论的指导筛选出候选基因,以实时定量PCR对它们进行了验证和转录本的定量比较分析,最终筛选出与部分木糖代谢和乙醇发酵相关的主效基因,包括STP、HAGT、XR2、XDH1、XDH2和ADH。实验为热带假丝酵母及其他木糖发酵菌株的糖代谢和乙醇发酵的转录谱、基因重组、代谢工程及发酵调控等相关研究提供理论指导。

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赤霉素发酵与大孔树脂吸附过程耦合工艺优化

王卫, 李忠海, 黎继烈, 曾泊全

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 70-74.

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赤霉素生物合成过程中存在产物抑制,采用发酵与提取耦合技术将减弱产物抑制,提高赤霉素生产效率。对多种国产大孔树脂进行赤霉素GA₃静态吸附、解析实验,筛选出性能较优的大孔树脂D-100;并采用单因素和响应面分析方法优化D-100树脂添加至赤霉素发酵的工艺条件。实验数据表明:大孔树脂D-100的最适添加时间与最适树脂量分别为71h和2.2%,发酵所得赤霉素总量为221.75mg,赤霉菌平均比生产速率为0.96mg/(g·h)。与常规发酵比较,耦合发酵所得赤霉素总量提高了1.496倍。

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利用自杀载体构建布鲁氏菌hfq表位标记菌株

崔明全, 徐杰, 张婷婷, 王同坤, 尚伟, 陈泽良, 袁静, 杜昕颖, 汪舟佳, 柯跃华, 钟志军, 苑锡铜, 黄留玉, 彭广能, 王玉飞

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 75-80.

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目的:建立一种利用自杀载体构建布鲁氏菌hfq表位标记菌株的方法。方法:在hfq的反向引物带上FLAG或HIS标签序列,以布鲁氏菌Brucella melitensis 16M为模板扩增出3'端带有标签的hfq标记盒。将其直接与布鲁氏菌的自杀载体pMD18-T vector连接,获得带有标签的标记载体,将载体转入布鲁氏菌感受态细胞并筛选抗性克隆,进而获得表位标签与目的基因C末端融合的重组子。利用RT-PCR和Western blot分析C末端融合了表位标签的目的蛋白的转录和表达的情况。结果:获得了布鲁氏菌的表位标记菌株16M-T-Hfq^FLAG和16M-T-Hfq^HIS。RT-PCR实验结果表明带有标签的hfq基因可以转录,Western blot实验结果证实利用针对FLAG或HIS标签的抗体能够检测到Hfq蛋白的表达。结论:利用自杀载体可以快速构建布鲁氏菌的表位标记菌株,这不仅为Hfq的功能研究奠定了基础,也为布鲁氏菌的基因功能研究提供了一个有价值的研究手段。

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利用牵出技术分析与虾主要过敏原相互作用的蛋白质

沈梓粤, 吕哲, 秦宗华, 李任强

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 81-85.

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目的:应用牵出技术研究与虾主要过敏原相互作用的蛋白质。方法:将纯化的虾主要过敏原原肌球蛋白偶联在用环氧氯丙烷活化的载体Sepharose-4B上作为配基并制成层析柱,以过敏原为饵蛋白从虾过敏患者血清中钓出与之相互作用的蛋白质。结果:SDS-PAGE和间接ELISA检测显示,由过敏原牵出的蛋白质至少有两种,分别是抗原特异性IgE和IgG,这说明虾过敏反应除了是由IgE所介导外,IgG也在其中起到一定的作用。结论:实验所采用的牵出技术是一个快速且有效的研究蛋白质相互作用的方法,其基于免疫亲和层析原理。

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布鲁氏菌B.ovisvirB缺失株的构建及胞内环境适应性分析

高光俊, 柯跃华, 徐杰, 王丽萍, 张正芳, 李卓琳, 王璐璐, 郭英飞, 王玉飞, 徐兴然, 陈泽良

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 86-91.

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目的:利用基于T载体快速克隆构建布鲁氏菌突变株的方法,构建缺失VirB启动子区域的绵羊附睾布鲁氏菌株,为绵羊附睾种布鲁氏菌IV型分泌系统功能研究奠定基础。方法:运用同源重组的原理,用Kana抗性基因替换编码分泌系统VirB的启动子区域,从而获得virB的突变株。通过RT-PCR对突变株virB基因的转录进行了分析;分析突变株和野生株在体外模拟的胞内环境下的生存能力,观察virB对B.ovis胞内生存环境适应的影响。结果:成功构建了B.ovis的缺失virB启动子区的突变株,突变株中virB基因的表达抑制。与野生株相比,突变株对胞内环境的适应力发生了改变。结论:利用T载体克隆和抗性替换的方法成功构建了B.ovis的virB的突变株,为B.ovis的IV型分泌系统的功能研究奠定了基础。

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一种嗜镍菌对含镍废水中Ni²⁺的特效吸附

赵玉清, 李晋, 周广麒, 任铮宇, 杨洪泽, 孙天竹, 邢艳杰

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 92-97.

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为解决微生物对重金属吸附的应用问题,筛选了一种嗜镍菌,研究了最优条件下嗜镍菌对镍离子的特效吸附。表明:Langmuir方程能很好地描述嗜镍菌对Ni²⁺吸附的热力学过程,在最佳条件下嗜镍菌对镍离子吸附2h,饱和吸附量可达92.59mg/g;嗜镍菌对Ni²⁺的吸附动力学过程符合二级反应模型,由吸附率随时间的变化曲线可见:镍离子为25mg/L,吸附时间2h,吸附即趋于平衡,吸附率最高可达97.7%,对超标50倍的含镍废水,一次处理已接近镍的排放标准;该菌对含镍废水中Ni²⁺的吸附有特效性。热力学模型与红外光谱和原子力显微镜测定同时说明嗜镍菌对Ni²⁺的作用以表面为主,其主要吸附位点是菌体胞外聚合物的蛋白质、多糖的羟基和氨基;这对该菌作为工程菌的回用有宜。

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中心体周期相关蛋白磷酸化/去磷酸化及其功能的研究进展

谭锬, 梁前进

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 98-106.

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中心体(centrosome)是动物细胞和低等植物细胞中存在的一种重要的无膜细胞器。正常情况下,它参与细胞的有丝分裂,形成基于微管结构的纺锤体,牵引着复制后的染色体移向细胞的两极。这一过程保证了遗传物质DNA能够精确、有序和完整地遗传到子代的细胞中。与细胞有丝分裂及增殖过程中发挥作用的其他重要细胞器一样,它的行为和调控同样是由一系列与功能相关的蛋白质来完成的。在这些蛋白质中,一部分与中心体的复制、分裂相关,保证中心体增殖周期的实现;另一部分则在细胞周期中与中心体有着一定的联系,但同时在细胞生命活动中发挥着其他重要功能。无论是在正常细胞中,还是在异常细胞(如肿瘤细胞)中,蛋白质修饰的调节方式都占据了优势,其中尤以磷酸化修饰方式引人注目。中心体是细胞内重要的细胞器之一,大量与中心体周期相关的蛋白质同样也通过磷酸化修饰方式进行调节。主要对中心体周期相关蛋白的磷酸化修饰及功能进行综述,为中心体周期及其调节的深入研究提供参考。

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异源表达聚酮类化合物前体的研究进展

段月娇, 薛超友, 卢文玉

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 107-114.

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聚酮类抗生素因其重要的生物活性在临床上广泛应用。该类化合物主要由微生物代谢生成。然而由于合成聚酮化合物的天然菌株存在各种限制,影响着聚酮化合物的高效生产与应用。通过聚酮化合物的异源表达可以有效解除这些限制,目前成为研究热点。聚酮化合物异源表达的一个关键限制性因素是胞内前体物质供应不足。概述了在典型异源表达宿主菌中提高聚酮化合物前体供应的策略:通过对前体合成途径的重新改进或者引入到异源表达宿主菌中重构代谢网络、过表达外源前体合成途径、抑制旁支代谢流、敲除内源性次级代谢产物代谢途径,提高前体供应。为异源表达聚酮化合物的研究及工业化生产提供借鉴。

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基于PCR方法的基因序列全长获取策略

李昆鹏, 朱化彬, 郝海生, 赵学明, 冯荣, 秦彤, 张林波, 王栋

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 115-123.

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基因全长序列是研究新基因功能的前提基础,基于PCR(polymerase chain reaction)建立了反向PCR、外源接头介导PCR和随机引物PCR三类基因序列全长扩增方法。虽然早期建立的反向PCR连接效率较低,易产生较高的非特异性扩增,但简单快捷的特点使其在鉴定T-DNA插入位点、基因融合位点等方面应用较多;外源接头介导PCR则因特异性的提高而备受欢迎,并衍生出单特异引物PCR、捕获PCR和步降PCR等多种技术,取得了较理想的扩增效果;而在大量样品分析中,自动化程度较高的随机引物PCR则更具优势。随着功能强大的聚合酶、连接酶、反转录酶的发现,推动了各种基于PCR的基因序列全长获取策略的发展,很多策略也因此而得以改进和整合,并获取更理想的实验结果,为研究基因结构、功能及其表达产物特性的研究提供了更完整的信息。

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基因工程技术改造木糖醇生产菌株的研究进展

焦静雨, 吴绵斌, 赵炯烽, 林建平, 杨立荣

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 124-131.

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木糖醇是一种低热量的五碳糖醇,广泛应用于医药、食品和化工等领域。生物合成法相对于化学合成法具有工艺条件温和、能耗低、环境污染小等特点,已成为研究的热点。但由于野生微生物体内具有不同的木糖代谢途径,且木糖还原酶的专一性不强以及转化过程需要辅酶参与等原因,影响了该技术的产业化应用。对生物转化法生产木糖醇的现状及存在的问题进行了分析,展望了采用基因工程技术改造微生物的代谢途径,提高生物催化转化木糖醇的产率的新技术和方法。

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谷氨酸棒杆菌戊糖代谢利用研究进展

叶菁, 许敬亮, 肖波, 袁振宏, 徐惠娟, 杨柳, 李谢昆

中国生物工程杂志. 2012, 32(11): 132-136.

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戊糖资源高效利用是提高木质纤维原料生物炼制经济效益的关键途径之一,谷氨酸棒杆菌被广泛用于氨基酸以及核苷酸的工业生产,在细胞生长停滞的状态下仍能大量合成氨基酸,对呋喃、糠醛等抑制物也具有良好的耐受性,通过遗传和代谢工程改造,谷氨酸棒杆菌有望成为理想的木质纤维原料催化转化生产菌株。综述了谷氨酸棒杆菌木糖和阿拉伯糖利用工程菌构建的研究进展和策略,最后提出了今后优化谷氨酸棒杆菌戊糖代谢能力的研究方向。

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2012年, 第32卷, 第11期　
刊出日期：2012-11-25

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