中国生物工程杂志

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陈晓静, 陈小梅, 王洋, 施慧莉, 霍克克

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 1-8.

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前期研究结果发现,SCYL1-BP1 具有细胞周期调控功能,同时具有肿瘤抑制因子的特性。目的:采用基因工程技术,构建SCYL1-BP1 的大肠杆菌重组表达菌株,以获得足够量的高纯度目的蛋白,为后面进行一系列药理学检测及新药安全性测试奠定基础。方法:利用从人胎脑cDNA文库中克隆得到SCYL1-BP1 基因克隆为模板,经PCR扩增,通过酶切位点克隆到新型原核表达载体pET-28b-SUMO上,转化大肠杆菌表达菌BL21(DE3)。经IPTG诱导表达,摸索优化表达条件,表达产物经Ni柱进行亲和层析纯化,后再进行SDS-PAGE和Western blot等分析鉴定。结果:成功构建了SCYL1-BP1 的原核表达工程菌BL21(DE3)/pET-28b-SUMO-SCYL1BP1。SDS-PAGE和Western blot检验结果表明,诱导表达的融合蛋白His6-SUMO-SCYL1BP1的分子量约为65 kDa,主要以可溶的形式存在,且能被His标签抗体和SCYL1-BP1单克隆抗体特异性识别。结论:原核表达并纯化了人SCYL1-BP1融合蛋白,为其后续功能研究及性质实验奠定基础。

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丝氨酸蛋白酶HtrA2/Omi可参与调节线粒体中的适配蛋白p66Shc

刘姝, 姜长安

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 9-14.

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目的: p66Shc在线粒体内积累和HtrA2/Omi的功能缺陷都能导致线粒体损伤,诱导细胞凋亡。探讨在线粒体中HtrA2对p66Shc的调控作用。方法: 构建p66Shc和成熟型HtrA2的真核表达质粒,共转染HEK293T细胞,免疫印迹法(Western blot)检测p66Shc蛋白;构建原核表达质粒,大肠杆菌纯化蛋白,体外切割实验,SDS-PAGE分离后考马斯亮蓝染色检测;提取HtrA2功能缺陷小鼠(mnd2)大脑组织的线粒体,检测线粒体内p66Shc的蛋白水平。结果: 细胞实验和体外实验证明HtrA2可以切割p66Shc,且在mnd2小鼠大脑中,线粒体内p66Shc的蛋白水平明显升高(P<0.05)。结论: p66Shc是HtrA2的直接底物,且HtrA2参与调节线粒体中p66Shc的蛋白水平,揭示了HtrA2发挥神经保护功能新的可能机制。

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BRPF1及其新型转录本BRPF2与RHOX5蛋白间的相互作用

郭芬, 林丕容, 李月琴, 苏宪礼, 王丁丁, 周天鸿

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 15-21.

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RHOX5基因是最早发现的小鼠RHOX基因簇(reproductive homeobox on the X chromosome)成员,可特异性地在生殖系统中表达。RHOX5蛋白在胚胎发育、生殖组织的发育、精子的生成和成熟等多个环节发挥作用,但其功能的发挥途径尚不明确。在前期筛选与RHOX5蛋白相互作用的分子中初步获得一个BRPF1的新型转录本BRPF2。进一步构建pGBKT7-BRPF2质粒,酵母双杂交实验确定其与RHOX5蛋白的相互作用,GST-pull down实验确定其在体外的直接结合; PCR扩增BRPF1基因,构建pGBKT7-BRPF1和pGADT7-BRPF1质粒,酵母双杂交实验和GST-pull down实验证明RHOX5蛋白亦可以直接结合BRPF1蛋白。BRPF1及其新型转录本BRPF2与RHOX5蛋白间的相互作用证实暗示了BRPF2极有可能与BRPF1竞争性结合RHOX5蛋白,为三种蛋白功能的研究提供了新的思路。

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从大容量噬菌体抗体库中筛选抗Acr蛋白人源单链抗体

王晓娜, 米志强, 安小平, 李建彬, 范华昊, 张文慧, 张博, 黄勇, 周丽君, 童贻刚

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 22-27.

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目的:从天然的大容量噬菌体抗体库中筛选特异的抗结核分枝杆菌晶体蛋白(alpha-crystallin Acr)的人源抗体。方法: 以结核分枝杆菌 Acr蛋白包被免疫管,通过对噬菌体抗体库进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的过程从大容量抗体库中筛选特异性抗结核分枝杆菌 Acr蛋白的抗体,并对可变区序列进行了测序分析。将特异性的噬菌体抗体感染HB2151菌,经IPTG诱导表达,制备了抗结核分枝杆菌 Acr蛋白的可溶性单链抗体;对其序列和抗原结合活性进行分析鉴定。结果:经过4轮筛选,获得了43个与结核分枝杆菌 Acr蛋白结合的阳性克隆,其中29个特异结合的克隆;测序分析有26不同的可变区片段;通过可溶性单链抗体(scFv)表达筛选到14株特异性结合Acr蛋白的可溶性单链抗体克隆;经过基因测序,分析了可变区基因的亚群。成功制备了可溶性单链抗体。Westren blotting分析证实筛选的人源单链抗体能与天然蛋白结合。结论:利用单链大容量抗体库获得抗结核分枝杆菌 Acr蛋白的噬菌体抗体并且成功制备抗结核分枝杆菌 Acr天然蛋白的可溶性单链抗体,为今后的研究和应用奠定基础。

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人己糖胺酶D的原核表达、纯化及酶学特性研究

刘琳, 徐, 蔡春梅, 李静, 蔡玉梅

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 28-33.

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糖基化修饰是一种重要的蛋白质翻译后修饰,参与生物体中的信号传导、细胞识别等多种细胞活动,糖基缀合物的正常水解是生物体代谢的必需途径。人己糖胺酶D(Hexosaminidase D)是新发现的一种存在于人细胞质中的切除GalNAc糖基化修饰的外切酶,但该酶的酶学特性尚不清楚。利用PCR的方法,将Hex D的cDNA序列构建到质粒pET3C中,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)plysS后,通过优化异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)浓度(0.1 mmol/L)和诱导时间(10 h)获得了高可溶性表达的重组蛋白酶。采用Ni-NTA亲和层析对重组蛋白进行了纯化,SDS-PAGE检测分子量的大小(58 kDa)和纯度(95%以上)。以4-甲基伞形酮-2-乙酰氨基-2-脱氧半乳糖(4-MU-O-GalNAc)为荧光底物,测定该酶的最适反应pH值为5.5,最适反应温度为37℃,且该酶的热稳定性较好,在50℃下放置半小时仍有较高活性,1mmol/L的金属离子(CuSO₄、FeSO₄·7H₂O、MgCl₂·6H₂O、CaCl₂、NiSO₄·6H₂O、AlCl₃·6H₂O、ZnSO₄·7H₂O、MnCl₂)及EDTA对该酶活性影响不大,10mmol/L AlCl₃、CuSO、FeSO₄·7H₂O对该酶有不同程度的抑制。在最适条件下(pH 5.5,37℃)下,该酶的K_m为0.16mmol/L,最大反应速率为3.06 μmol/(min·mg)。

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重组芋螺毒素GeXIVAWT的表达、纯化和鉴定

高炳淼, 李宝珠, 吴勇, 林波, 朱晓鹏, 长孙东亭, 罗素兰

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 34-40.

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芋螺毒素GeXIVAWT是来自食虫将军芋螺(Conus generalis Lonnaeus)毒管中,具有两对二硫键的28肽。通过化学合成这种芋螺毒素产量低、成本高、难以纯化。利用简单快速的重组表达来生产富含二硫键的芋螺毒素有可能成为有效的新途径。通过对芋螺毒素GeXIVAWT的基因进行密码子优化,人工合成引物来构建表达载体pET22b(+)/pelB-GeXIVAWT。融合了信号肽的重组芋螺毒素以包涵体的形式在大肠杆菌中获得了高效表达。利用低浓度尿素洗涤和超滤管进行纯化无组氨酸标签的重组芋螺毒素pelB-GeXIVAWT,再利用稀释复性的方法将无活性的包涵体转变成具有活性的重组芋螺毒素。复性后的重组蛋白采用反相高效液相色谱进一步纯化后进行了质谱鉴定。活性实验表明重组芋螺毒素pelB-GeXIVAWT具有抑制昆虫细胞Sf-9的生长,为研究芋螺毒素作为生物杀虫剂奠定基础。

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高产(+)γ-内酰胺酶菌株的筛选与发酵产酶研究

陈红干, 倪晔, 孙志浩

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 41-47.

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从土壤中筛选获得高产(+)γ-内酰胺酶的微生物菌株,并鉴定和保藏为Delftia sp. CGMCC No. 5755。对该Delftia sp菌株的发酵产酶条件进行了研究,结果表明,最适发酵培养基为:蔗糖30 g/L,蛋白胨30 g/L,牛肉膏25 g/L,乙酰胺5 g/L,MgSO₄ 1 g/L;最适发酵温度及初始pH分别为32℃和pH 7.0。该菌株在上述条件下发酵培养20 h,菌体生物量为16.0 g/L,(+)γ-内酰胺酶的酶活为692 U/L。采用Delftia sp.静息细胞对100 g/L的外消旋底物2-氮杂二环--庚烷-5-烯-3-酮(简称(±)γ-内酰胺)的水解拆分反应中,产物(-)γ-内酰胺光学纯度大于99.9%e.e.,转化率为53.7%。研究为生物催化法高效制备光学纯(+)γ-内酰胺提供了可行的途径。

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shRNA随机文库结合TK自杀基因筛选靶向HIV-1LTR相关宿主因子

李建彬, 米志强, 安小平, 谭莉, 陈斌, 王晓娜, 范华昊, 张文慧, 张博, 方祥, 童贻刚

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 48-54.

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构建shRNA随机文库与HIV-1 LTR启动胸苷激酶基因(TK基因)稳定表达的稳定细胞系HEK293/TK,将两者结合起来,筛选靶向HIV-1 LTR相关宿主因子。方法:通过化学合成含有19个随机脱氧核苷酸的发夹结构,将其退火补平后与合成的接头Linker连接进行PCR反应,将PCR产物酶切后置于慢病毒载体pLenti-U6启动子下游由此构建shRNA随机文库;利用重叠PCR将HIV-1 LTR片段和TK基因连接起来,连接产物经酶切后与pcDNA3.1载体连接;将连接正确的质粒转染HEK293细胞同时用G418加压筛选获得稳定细胞系HEK293/TK;将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK细胞系,通过加入药物GCV进行加压筛选获得存活细胞。结果:成功筛选到加药后存活下来的细胞,抽提细胞基因组,采用巢式PCR扩增目的干扰序列并用Western blot对干扰序列进行验证,鉴定获得一个克隆所表达的shRNA能对TK基因的表达起到抑制作用,通过测序分析获得其干扰序列,该序列很有可能针对HIV-1 LTR某宿主相关因子。结论:成功构建了一种筛选HIV-1 LTR相关宿主因子的方法,筛选所得序列可以定位到具体相关宿主因子,为靶向筛选抗HIV-1药物提供了重要手段。

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MDCK细胞微载体悬浮培养放大工艺研究

龚迪, 易小萍, 张元兴

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 55-60.

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MDCK细胞对各种流感病毒具有高度敏感性,广泛应用于流感病毒的分离和疫苗制备。通过探索培养基中促进细胞贴壁的关键组分,并筛选水解物,开发了适合MDCK细胞生长的低血清培养基。发现钙、镁离子是细胞贴壁不可缺少的物质,麦麸水解物可以部分代替培养基中的血清。利用该低血清培养基,经过消化转移将MDCK细胞从5 L反应器放大至25 L反应器,微载体上细胞贴附均匀、生长旺盛,25 L反应器中培养48 h细胞密度可达30.5×10⁵ cells/ml。研究结果为工业规模反应器微载体悬浮培养MDCK细胞生产流感病毒奠定了基础。

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WAVE^TM反应器和搅拌瓶中微载体球转球放大培养的比较

陆丽芳, 隋礼丽

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 61-69.

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目的:哺乳动物细胞目前已广泛用于生物工程药物如单抗和疫苗的生产。而用于贴壁细胞规模化培养的微载体,也应时应需得以开发并应用于生物制药。贴壁细胞微载体培养在搅拌罐和WAVE^TM反应器中都能进行。而如要进行进一步的放大培养,球转球工艺不可或缺。为了发展球转球这一新的放大技术,以及考量WAVE^TM反应器这种新型大规模培养设备的应用性,大量的细胞培养和球转球实验在WAVE^TM反应器和搅拌瓶中进行。收集到的数据得以分析比较。方法:将Vero细胞分别接入WAVE^TM反应器和搅拌瓶中用微载体Cytodex 1进行培养。适当补充营养并控制温度、pH等培养条件使细胞增殖。长满微载体的细胞用清洗、消化等球转球工艺的一系列步骤而分离,并放大接种到新的培养体系。球转球工艺的有效性通过记录并统计分析细胞消化分离的回收率,以及细胞重新接种生长的存活力来评估。结果:统计学分析比较WAVE^TM反应器和搅拌瓶中得到的细胞分离回收率分别是67.56%和39.39%,数理统计P值小于0.000 3;细胞重新接种存活率分别是95.17%和78.45%,P值等于0.010 7。结论:在WAVE^TM反应器中进行的球转球放大工艺,其总体表现和有效性远高于在搅拌瓶中得到的结果。在WAVE^TM反应器中培养的Vero细胞有很好的细胞状态,作为种子链和生产用罐相比搅拌型反应罐均有很大的优越性。

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响应面法优化普通小球藻混合营养培养基组成生产生物质

杨琪, 王科荣, 孔维宝, 杨红, 曹海, 张馨允

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 70-75.

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利用响应面法优化了混合营养培养普通小球藻生产生物质的培养基组成。首先采用Plackett-Burman设计对11个相关营养因素的效应进行了评价, 并筛选出影响小球藻细胞生长的3个主要因素为KNO₃、葡萄糖和NaCl;然后结合Box-Behnken设计建立了以小球藻浓度为响应值的二次回归方程模型, 获得优化的培养基组成为KNO₃ 1.64g/L、葡萄糖45g/L、NaCl 1.57g/L;模型预测的最大浓度为5.28g/L, 验证值为5.68g/L;验证结果表明, 所建立模型预测精度较好, 可用于优化小球藻的混养培养基组成。优化条件下混养小球藻细胞的蛋白质和色素含量较优化前降低, 而可溶性糖和油脂含量提高, 脂肪酸以棕榈酸和油酸为主;细胞组分分析结果显示, 混养培养所得小球藻生物质具有作为生产微藻生物能源原料的潜力。

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面向重要实质器官的生物制造技术

贺健康, 刘亚雄, 连芩, 王玲, 靳忠民, 李涤尘

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 76-81.

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在体外制造可修复人体受损组织与器官功能的活性替代物一直是人类的梦想。制造、材料与生命科学的交叉与融合发展,为生物组织与器官的体外制造提供了必要的技术、材料与生物学基础,从而实现了皮肤、骨、膀胱等简单活性组织的临床应用,但人体重要实质器官如肝脏、肺等的再造研究至今未取得突破性进展。重要实质器官内部复杂的微观结构系统及多细胞体系的构建是实现其体外制造的关键,也是当前生物组织与器官制造技术所面临的巨大挑战。从生物制造的角度,综述国内外在重要实质器官复杂微结构制造领域的主要技术方法及最新研究进展,通过分析与评价,对未来重要实质器官的生物制造技术发展进行展望。

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诱导性多能干细胞向神经细胞分化的研究进展

单威, 余勤, 刘丽珍, 王标

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 82-86.

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诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPS cell)是通过转染外源特定的基因组合来诱导成体细胞重编程为类似于胚胎干细胞的一种多潜能干细胞,iPS细胞与胚胎干细胞不仅在形态上相似,而且在功能方面几乎相同。另外,iPS细胞的诞生克服了胚胎干细胞在临床应用时涉及的移植免疫排斥与伦理道德问题,因此具有重要的临床应用价值。目前iPS在治疗中枢神经系统性疾病方面的研究已取得很大进展,包括iPS细胞向神经细胞诱导分化方法的改进、分化机理的探索以及iPS细胞分化来源神经细胞在神经系统疾病模型中治疗作用的研究等。从iPS细胞的创建及特点、iPS细胞向神经细胞分化的诱导方法及研究新进展方面予以综述。

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转录因子结合位点共现研究进展

李嘉平, 张先文, 陈信波

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 87-94.

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在启动子区域中,通常存在多个转录因子结合位点(transcription factor binding site,TFBS)与不同或相同的转录因子结合。这些TFBS,不但将转录因子与目标基因联系起来,还间接提供了转录因子间协同作用的线索。而转录因子间的协同作用,是转录调控网络的重要组成部分。因此,识别在一个启动子区域同时出现的多个TFBS是构建转录调控网络的重要途径。在启动子区域成对出现的TFBS,通常用配对模体(motif pair)来表示。由多个TFBS构成的调控区域则通常被称为顺式调控模块(CRM,cis-regulatory modules)。配对模体与CRM的识别算法利用了它们的保守性、位置与距离偏好性以及调控基因共表达等特性提高识别的准确性。根据TFBS的共现构建转录调控网络仍然具有较大的局限性,多种不同数据来源的整合是未来的研究方向。

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成纤维细胞生长因子18(FGF18)的研究进展

宋林涛, 姜潮, 李校堃

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 95-100.

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成纤维细胞生长因子18(fibroblast growth factor 18,FGF18)是成纤维细胞生长因子家族(FGFs)的成员之一。研究发现,FGF18不仅在骨骼发育和生长期对软骨形成和成骨生成起着重要的作用,其功能也已延伸至其他许多生物过程,尽管对FGF18作为一个有用治疗靶点发挥作用的功能和机制仍有待进一步的发现及研究。现针对FGF18的特点,及其在骨骼发育中的功能,特别其在未来具有潜在应用领域上的研究进展进行综述。

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分枝杆菌噬菌体重组系统及其应用

樊祥宇, 谢建平

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 101-106.

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噬菌体是微生物遗传学研究的有力工具及源泉。分枝杆菌噬菌体也是构建分枝杆菌,尤其是结核分枝杆菌遗传研究工具的基础。目前,基于分枝杆菌噬菌体重组酶的重组系统是国际热点。总结了近年来基于分枝杆菌噬菌体Che9c重组酶gp60、gp61所构建的分枝杆菌重组工程体系及其在分枝杆菌基因组研究方面的应用,并结合实验室工作展望了其研究前景。该体系不依赖细菌自身的RecA系统,不需要限制性内切核酸酶和DNA连接酶,不需要复杂的体外操作,只需表达分枝杆菌噬菌体重组酶,从而使结核分枝杆菌基因敲除、基因敲入及点突变和构建分枝杆菌噬菌体突变株更方便。这为分枝杆菌及其噬菌体基因诱变及基因功能研究提供了迅捷的新途径。

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鱼腥蓝细菌PCC7120铁吸收机制

董妍玲, 潘学武

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 107-112.

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铁离子是鱼腥蓝细菌 PCC7120进行呼吸作用、光合作用和固氮作用中相关酶的重要辅基之一,缺铁将严重影响蓝细菌的生存。富氧的生态环境中铁通常以不溶的Fe³⁺形式存在,不易被细胞吸收利用。低铁条件下,鱼腥蓝细菌PCC7120分泌能螯合铁离子的嗜铁素,通过外膜上相应的转运体将嗜铁素-铁复合物转运到细胞内。综述了近年来在嗜铁素的种类及其生物合成途径、铁吸收系统的组成和功能等方面的最新进展,分析了铁吸收系统的调控机制,为进一步开展鱼腥蓝细菌铁吸收机制的研究提供依据。

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藻类DNA条形码研究进展

崔翠菊, 张立楠, 王娜, 李晓捷, 刘延岭, 江鑫

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 113-117.

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DNA barcode, 又称为DNA条形码,是指利用短的标准DNA序列的核苷酸多样性进行物种的鉴定和快速识别。目前该方法在动物分类研究中应用广泛,其中线粒体的细胞色素c氧化酶亚基1(cytochrome c oxidase subunit 1, COI 或cox 1)基因中的约700bp长度的一段被用来作为标准DNA片段。在陆地植物条形码研究中,生命-植物条形码联盟会(Consortium for the Barcode of Life-Plant Working Group,CBOL-Plant Working Group)近期推荐将植物叶绿体中的两个基因片段rbcL+matK作为初步的陆生植物条形码,此组合能在70%的程度上进行植物物种的鉴别。在海藻的分类研究中,DNA条形码的应用较少,已有的研究主要集中在硅藻、红藻和褐藻,尚没有学者明确提出适合藻类的DNA条形码。总结了能够作为藻类DNA条形码的序列特点、应用流程及分析方法,综述了DNA条形码在藻类中的研究现状和存在的问题,展望了藻类DNA条形码的应用前景。

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丙酮丁醇梭菌丁醇耐受性

毛绍名, 章怀云

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 118-124.

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丁醇在发酵培养基中的积累所产生的毒性问题是限制丁醇产量的重要因素,然而对于Clostridium acetobutylicum是如何适应丁醇胁迫,进而调节菌体生长和代谢的,目前尚缺乏系统研究,不能全面揭示C. acetobutylicum的丁醇耐受性机制。对丙酮丁醇梭菌丁醇耐受性有关的研究成果进行了综述,旨在深入理解菌株丁醇耐受性发生改变的相关分子基础。希望为进行微生物丁醇耐受性分子机制的改造、提高菌株的丁醇耐受性提供新的研究思路。

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生物法合成尿苷二磷酸葡萄糖的研究进展

陈圣, 李艳, 刘欢, 严明, 许琳

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 125-130.

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尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)是一种重要的糖类物质合成前体。生物法合成具有低成本、无污染和高立体选择性等传统化学法不具备的优势。利用纯酶催化的生物法以基于Leloir途径改进的一锅法、蔗糖合酶催化的两步法以及糖合成反应可逆催化等产UDPG,实现了UDPG的高产。全细胞催化法利用稳定的胞内酶系产UDPG,胞内生成的UDPG作为底物直接参与产物的催化合成,可行性高且成本更低。综述了酶法和全细胞催化法合成UDPG这两种最主要生物法的研究进展。

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英国生物技术成果转化经验及若干启示

张大璐

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 131-134.

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英国是生物技术产业发展强国,综合实力仅次于美国。英国生物技术行业今天的繁荣,是与英国几十年对生物技术成果转化的政策扶持和一系列配套措施分不开的。本文回顾了自20世纪50年代起,英国政府在生物技术成果转化方面的政策和经验、政府的引领和投入以及一系列的孵化政策,促成了英国生物技术产业当今的成就。关注英国在生物技术产业成果方面的经验,旨在为我国发展生物技术产业健康、迅速发展提供参考。

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“十一五”863计划“纳米生物器件”重点项目课题布局及实施情况分析

王德平

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 135-137.

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简要分析了"十一五"期间国家高技术研究发展计划("863"计划)"纳米生物器件"重点项目的课题设置及实施情况。分别从本重点项目研究方向及课题设置、课题承担单位及研究人员结构、课题完成情况及所取得的代表性研究成果等方面进行了具体分析和归纳总结,供广大科技工作者参考。

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黄金大米及其安全性

中国生物工程杂志. 2012, 32(09): 138-139.

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黄金大米(Golden Rice,简称金米)的发明者是瑞士联邦理工学院苏黎世分校(Swiss Federal Institute of Technology Zurich)植物科学研究所的名誉教授印戈·珀特里库斯(Ingo Potrykus)和德国弗莱堡大学应用生物科学中心的教授彼得·拜尔(Peter Beyer)。

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2012年, 第32卷, 第09期　
刊出日期：2012-09-25

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