PLZF(promyelocytic leukaemia zinc finger protein)是一种重要的转录抑制因子,它由位于N端的BTB结构域和C端的锌指结构域构成。鉴于目前对于锌指结构域的立体结构还不是十分清楚,对其进行了高效表达和提纯。为了表达PLZF蛋白的锌指结构域,在其编码序列的5'端加上起始密码ATG后插入到表达载体PET-11a的多克隆位点。构建好的表达质粒转化到BL21 (DE3)大肠杆菌内并用IPTG诱导表达,发现重组蛋白主要以不溶性的包涵体形式在胞内表达。用含有SDS变性剂的缓冲液溶解包涵体后,采用凝胶过滤方法将重组蛋白纯化到纯度达96%以上。对纯化后的蛋白质用反透析的方法进行复性,然后用DNA结合实验进行活性分析,发现复性后的蛋白质具有特异的DNA结合活性,这为进一步研究PLZF蛋白锌指结构域的立体结构打下了重要基础。
目的: 研究人轮状病毒ZTR-5株灭活疫苗的制备及在实验小鼠中的免疫原性评价。方法: 轮状病毒ZTR-5株在MA104细胞上经蚀斑筛选纯化后,获得单一克隆接种至Vero细胞上适应性培养,免疫荧光定量检测病毒的感染性滴度,对收获的病毒液进行离心、超滤、分子筛纯化,甲醛灭活,抗原定量检测Al(OH)3吸附制备的实验性疫苗。使用不同剂量(8EU、32EU、128EU、256EU)经肌内注射免疫小鼠,共免疫三次,免疫间隔2周。采用间接ELISA法检测血清特异性抗体效价。 结果: 通过蚀斑纯化,筛选得到一株纯化的病毒株ZTR-5纯-1,在Vero细胞上适应性后感染性滴度达7.35logCCID50/ml;大量培养收获的病毒原液滴度为7.57logCCID50/ml,制备获得轮状病毒样品抗原含量为2 560EU/ml;经肌内注射,初次免疫后,所有剂量组动物均获得抗体阳转,阳转率为100%;第一次加强免疫后,各组血清特异性抗体水平均明显增高,免疫剂量为128EU和256EU的两组小鼠血清抗体效价均达1∶10 240;第二次加强免疫后,各剂量组(8EU、32EU、128EU、256EU)血清抗体效价依次达1∶5 120,1∶7 456,1∶14 481.54,1∶14 481.54。 结论:人轮状病毒ZTR-5株可在Vero细胞上稳定增殖,所制备的疫苗具良好免疫原性,用128EU/2次免疫即可获得良好的免疫效果。
目的:旨在重组表达人源β2-GPI及其第V结构域基因,探讨后者在抗自身免疫性动脉粥样硬化实验中的干预作用。方法:以实验室保存的CTA727-1重组质粒为模板克隆β2-GPI及其第V结构域基因,构建pET32-β2-GPI和pET32-DV重组表达载体,分别转化至大肠杆菌Rosetta-gami。经IPTG诱导表达,镍离子亲和层析柱纯化重组蛋白,并采用Western blot、HPTLC和ELISA方法验证了重组蛋白的活性与功能。结果:β2-GPI及其第V结构域目的基因被分别克隆至原核表达载体pET-32a-c(+),诱导出具备CL和oxLig-1结合活性的β2-GPI 及第V结构域融合蛋白,ELISA实验显示第V结构域融合蛋白可抑制oxLig-1/(r)β2-GPI/Antibody免疫复合物的形成。结论:成功构建了pET32-β2-GPI及pET32-DV表达载体,获得高水平表达且具备活性的β2-GPI 和第V结构域重组蛋白,为研究治疗动脉粥样硬化等疾病的多肽药物奠定了基础。
探讨S100A6蛋白对细胞中β-catenin水平的影响及可能机制。用表达S100A6及其siRNA的重组腺病毒AdS100A6和AdsiS100A6处理人骨肉瘤细胞系143B,Western blot分析处理前后细胞中β-catenin水平的变化;再以人胚肾细胞HEK293为研究对象,通过免疫共沉淀(co-immunoprecipitation,Co-IP)联合Western blot检测S100A6与Wnt经典信号通路主要成员β-catenin、糖原合酶激酶-3β(GSK-3β)、散乱蛋白(Dishevelled,DVL)和轴蛋白(Axin)之间的相互作用。结果:1)AdS100A6作用48h后,143B细胞中β-catenin水平较实验对照组(AdGFP组)增加了64%(P<0.01),而AdsiS100A6处理的细胞中β-catenin较AdGFP组减少了20.2%(P<0.05),AdGFP组与空白组之间的差异无统计学意义;2)在S100A6抗体的沉淀物中,检测到β-catenin、GSK-3β和DVL,而无Axin检出;3)β-catenin、GSK-3β和DVL的抗体沉淀物中,均有S100A6检出,而Axin抗体的沉淀物中无S100A6检出。结论:S100A6能够上调人骨肉瘤细胞系143B中的β-catenin水平;并与β-catenin、GSK-3β和DVL之间存在直接相互作用;S100A6与这三个分子之间的直接相互作用可能抑制了β-catenin的降解,使之在胞浆内聚集,水平升高。这可能是S100A6上调β-catenin的部分机制。
目的:构建抑瘤素M(OSM)重组腺病毒载体,研究其对人黑色素瘤细胞A375的抑制作用。方法:以PEGZ-OSM重组质粒为模板,通过PCR技术扩增出OSM片段,采用腺病毒载体的基因重组和体外包装技术获得表达与人OSM氨基酸序列相同的重组腺病毒子Ad-OSM,感染A375细胞,用荧光显微镜、RT-PCR、Western blot法检测OSM在A375细胞中的转录和表达;荧光显微镜观察A375细胞的形态学改变;MTT法和流式细胞术(FCM)检测Ad-OSM对A375细胞的生长抑制和细胞周期的抑制效应;半定量RT-PCR法检测OSM基因表达对A375细胞中的Bax、Bcl-2基因表达的影响。结果:基因测序和PCR分析结果显示,成功构建了Ad-OSM腺病毒表达载体;RT-PCR和Western blot法检测到OSM基因在A375细胞中的转录和表达;OSM基因的表达对A375细胞增殖有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡,OSM基因可通过上调细胞中Bax和下调Bcl-2基因表达诱导细胞凋亡。结论:成功构建了Ad-OSM腺病毒表达载体,感染OSM基因可明显抑制A375人黑色素瘤细胞的生长,诱导其凋亡,该现象可能是通过改变Bax、Bcl-2基因表达水平来发挥抗肿瘤作用。
目的:已经证明,CD117基因转录启始位点的上游-480bp包括4个E-box和一个GC-box。试验要确定INI1是否通过与E-box结合蛋白的相互作用来调控CD117。方法与结果:实验证明INI1过表达下调 CD117的mRNA水平和荧光素酶的活性,这个酶通过CD117启动子来启动。通过染色质共免疫沉淀反应实验,发现在HeLa细胞未损伤的染色质里面,INI1可以特定的结合CD117的启动子。绘制INI1在CD117启动子区域的结合位点图表明, E-boxes而不是GC-box对于下调CD117启动子的活性是必须的,这一点在Co-IP(共免疫沉淀)实验中被进一步的证实,在这个试验中INI1与E-box结合蛋白E2A在体内相互作用。结论:总的来说,INI1参与调节CD117的表达和细胞增殖。
目的:分选胃癌细胞株中的侧群(side population,SP)细胞并初步研究其相关生物学特性。方法:选择人胃癌细胞株SGC-7901,以荧光染料Hoechst 33342染色,维拉帕米拮抗对照,应用流式细胞仪检测并分选出SP细胞和nonSP细胞。CCK-8法观察两组细胞体外增殖活性;体外耐药实验检测两组细胞对化疗药物5-FU的耐药存活率;无血清培养基培养观察肿瘤球形成能力;荧光定量PCR检测干细胞相关基因Musashi-1和CD44在两组细胞中的表达差异;裸鼠体内成瘤实验观察两组细胞体内成瘤能力。 结果:胃癌细胞株SGC-7901中SP细胞的比例为2.8%,与nonSP细胞相比,SP细胞具有较强的体外增殖活性(P<0.05),对5-FU的耐药存活率明显高于nonSP细胞(P<0.05),在无血清培养基中能形成明显的肿瘤球,SP细胞中Musashi-1和CD44mRNA的相对表达量明显高于nonSP细胞(P<0.05),裸鼠体内成瘤实验表明,皮下注射2×103 个SP细胞就能形成肿瘤,而2×104 个nonSP细胞也不能形成肿瘤。 结论:胃癌细胞株SGC-7901中存在数量极少的SP细胞,SP细胞具有肿瘤干细胞的相关生物学特性。
目的: 探讨小鼠胚胎干细胞(mouse embryonic stem cells, mESCs)向生殖细胞(Embryonic germ cells,EG)分化过程中5-杂氮-2'-脱氧胞苷(5-Aza-2'-deoxycytidine,5-Aza-dC) 对DNA甲基化转移酶Dnmt1和Dnmt3a及生殖细胞特征基因Mvh表达变化的DNA甲基化调控机制。方法:将mES细胞分化形成拟胚体(embryoid bodies, EBs) 作为向生殖细胞分化的启动步骤,采用不同浓度(0.05μmol/L,0.1μmol/L,0.5μmol/L,1μmol/L,3μmol/L)处理EBs,RT-PCR实时荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测检测在5-Aza-dC处理前后Dnmt1和Dnmt3a在ES细胞和EBs中的表达,甲基化特异性PCR(MSP)检测原始生殖细胞分化特征基因Mvh启动子甲基化状态。结果: 5-Aza-dC的浓度在0.05 μmol/L~1 μmol/L之间时,EBs保持较高的存活率而EBs的形态明显发生了变化;5-Aza-dC 处理后, Dnmt1和Dnmt3a在EBs中mRNA表达量明显降低,其变化特点与WB结果相一致。MSP和测序结果显示, Mvh启动子区表现为部分甲基化,5-Aza-dC 处理后的4d EBs中Mvh CpG岛有4个CG位点发生突变,而mES细胞中未见突变。结论: EBs经5-Aza-dC处理后,Dnmt1和Dnmt3a的表达明显下调;同时,Mvh启动子发生部分甲基化,有可能启动了向生殖细胞的分化进程。
目的:构建人血管生成素1(Ang1)和血管内皮生长因子VEGF165 (VEGF165)的共表达腺病毒载体Ad-Ang1-IRES-VEGF165(简称Ad-AV),为研究Ad-AV转基因细胞表达产物血管诱生活性提供实验依据。方法:采用IRES介导的Ang1和VEGF165双基因腺病毒共表达模式,通过常规的基因克隆和重组技术,构建Ad-AV双基因共表达腺病毒载体,经感染人胚肾QBI-293A细胞(293A)进行扩增和效价测定后,再感染WI-38人胚肺成纤维细胞,均用ELISA法检测VEGF、Ang1目的基因的表达,并采用鸡胚尿囊膜血管形成实验(CAM)法分析其对血管形成的影响。结果: 扩增的Ad-AV腺病毒效价可达4×1010pfu/ml;Ad-AV不仅能在293A细胞中成功表达目的基因Ang1、VEGF,而且在WI-38成纤维细胞也能成功表达,其表达产物具有显著的促进CAM上血管生成的活性。结论:成功构建并获得了Ad-Ang1-IRES-VEGF165重组病毒子, 目的基因均能在人胚肾和人胚肺成纤维细胞中表达,其表达产物具有诱导血管形成的功能。
将GALNT14全长编码区克隆到分泌型酵母表达载体pPIC9K中,构建重组载体pPIC9K-T14,经电转至毕赤酵母GS115中表达,使用G418筛选高表达重组菌,并对诱导条件进行优化,表达产物使用SDS-PAGE分析、Western blot鉴定、Sephadex G-100纯化、最后经HPLC检测活性。结果显示,在提供更好的供氧量条件下,用0.75％甲醇诱导可提高目的蛋白的表达量而降低杂蛋白的表达。培养上清液经SDS-PAGE检测显示目的蛋白分子量约64 kDa;Western blot结果显示在相应分子量处有一条特异性条带;利用Sephadex G-100成功分离纯化了目的蛋白;活性测定结果显示所获得的目的蛋白具有催化活性,为深入研究GALNT14的结构与功能奠定了基础。
为改善扩展青霉FS1884碱性脂肪酶的活性及酶学性质,利用连续两轮易错PCR对扩展青霉FS1884脂肪酶基因PEL进行随机突变,在大肠杆菌JM109中构建突变文库。含突变脂肪酶基因的重组质粒电击转化巴斯德毕赤酵母GS115,经过YPOM板初筛和橄榄油检验板复筛,获得一株酶活性提高的脂肪酶突变体:PEL-ep25-GS。与野生型脂肪酶PEL-GS相比,在最适温度40℃、pH9.4时突变体的酶活力是野生型酶的1.3倍。测序结果表明:该突变体第253位氨基酸发生了突变,由赖氨酸变成蛋氨酸。
目的:建立一种适用于大量制备的,安全、高效的血红蛋白纯化方法。方法: 将压积红细胞装入透析袋,以含有还原剂的Tris缓冲液透析破碎,破碎的上清经两级硫酸铵沉淀后透析至上样缓冲体系,离心后取上清即得血红蛋白提取液;红细胞提取液通过阴离子交换柱层析进一步分离,计算回收率。纯化产物浓缩后以SDS-PAGE及HPLC鉴定纯度,进行紫外-可见光谱扫描并以ABL800血气分析仪分析血气指标,以鲎试剂测定内毒素含量,以磷测定法测定脂质含量。结果: 血红蛋白提取液中脂质去除率98%,容易通过0.45μm滤膜;经阴离子交换层析纯化的血红蛋白经SDS-PAGE(银染法)及WB分析没有杂蛋白条带,HPLC分析纯度>99%、总回收率>85%;内毒素含量<2 EU,高铁血红蛋白含量<5%。结论: 该血红蛋白纯化方法安全高效、成本低廉、易于放大生产,具有较好的应用前景。
目的:现有的禽流感疫苗生产的方法已经不能适应工业化大生产的需求,有必要开发全悬浮培养的细胞系来满足大生产的需求。方法:我们通过转染稳定表达 Siat7e 基因的真核表达载体对MDCK细胞进行改造,并经过后期的驯化,筛选适应于全悬浮培养的MDCK细胞。结果:成功筛选到能稳定表达 Siat7e 基因并能适应全悬浮生长的细胞系。结论:该细胞系具有潜在的应用价值,为MDCK细胞的培养以及工业化大生产疫苗提供参考。
利用人H1 RNA启动子、EGFP基因及Neomycin抗性基因,构建用于禽类细胞基因持续沉默和快速筛选的实用型RNAi载体。在将pCDNA3.1(+)载体上的SV40启动子替换为鸡源的β-actin启动子后,装入EGFP基因表达框以及用于驱动外源shRNA转录的人H1 RNA启动子,构建成同时具有EGFP和Neomycin抗性双标记的RNAi载体,并为载体引入独特设计的含媒介序列的多克隆位点以方便外源shRNA编码小片断插入后的快速筛选,载体设计非常实用。插入靶向EGFP和sIgM λ基因的shRNA编码序列后分别瞬时转染DF-1和DT40细胞,结果显示靶基因表达得到了明显抑制。联用EGFP和Neomycin双标记快速筛选sIgM λ轻链基因稳定沉默的DT40细胞克隆的结果也证实,H1启动子转录shRNA的干扰效果是高效的,双标记筛选策略不仅有效而且方便、快捷。
基因表达的调控是分子生物学研究的一个重要问题,也是基因治疗和基因功能研究的重要手段。诱导性基因表达系统可以从时间上调控基因的表达,是基因治疗和基因功能研究的重要工具之一。其中,四环素诱导基因表达系统(tetracycline inducible expression system,Tet system)是应用最广泛的一种,它可以在时间和空间上对基因进行严谨和高效地诱导表达。基于该系统获得了不同用途的转基因动物,这些模型动物的建立为研究特定基因的功能及其在疾病发生中的作用打下了实验基础。现就四环素诱导表达系统的原理和在小鼠模型上的研究应用做一综述。
丙型肝炎由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染所致,约80%感染者可发展成慢性肝炎,甚至肝硬化和肝癌。目前,临床主要应用干扰素结合利巴韦林联合疗法治疗丙型肝炎,但治疗后病毒有效应答率不高,并伴有明显的副作用产生,迫切需要研发靶向药物。随着HCV体外细胞培养技术获得的突破性进展以及在此基础上各种药物筛选方法的建立,利用现有的筛选模型筛选靶向药物成为抗病毒药物研发的重要途径。近年来,将GFP、hRLuc等报告基因插入HCV基因组中改造成具有明显标记的高通量药物筛选体系,已初步筛选出一些有效的HCV靶向药物,就现有抗丙型肝炎病毒靶向药物及抗病毒药物筛选方法进行综述。
MicroRNA是一类长21~25nt的内源非编码RNA,可以与目标mRNA结合使之断裂或降解,从而在转录或转录后水平发挥作用。miR399长22nt,在拟南芥中有6个成员,分别是miR399a~f,已在19个物种中发现了118个miR399。现已证明,拟南芥miR399在耐低磷胁迫中有重要作用,现对拟南芥miR399在耐低磷胁迫中的研究进展进行综述,以探索miR399提高大豆及其他植物耐低磷胁迫能力的可能性。
详述了植物类胡萝卜素生物合成途径,并从突破类胡萝卜素合成途径中上游瓶颈限制、类胡萝卜素代谢各分支途径的改造、提高植物细胞对类胡萝卜素物质积累能力三个方面探讨了类胡萝卜素生物合成酶基因在植物基因工程中的研究现状,最后对植物类胡萝卜素代谢的研究前景进行了展望。
微生物脂肽具有抗菌谱广、热稳定性高、低毒、低抗药性等优点,近年来受到国内外广泛关注。综述了芽孢杆菌脂肽抗生素的发酵和分离纯化工艺的最新研究进展。在发酵工艺中,培养基营养组成、发酵温度、搅拌转速和通气量等参数对脂肽的产量至关重要,碳源、氮源和金属离子的组成与配比都会影响芽孢杆菌的生长与产物的合成,适当控制搅拌转速和通气量可提高脂肽产量。此外,近年来一些新型发酵工艺,如泡沫回流、固定化细胞、无泡发酵、固态发酵等被用于脂肽生产,通过改进发酵方式,在降低成本的同时提高了脂肽抗生素产量。抗菌脂肽分离纯化的主要方法包括超滤、吸附、泡沫分离及色谱法等,这些方法相对于传统的酸沉和萃取,具有可连续生产、脂肽提取量高及成本低等优点。同时,多种纯化方法的组合应用大幅度提高了抗菌脂肽的提取效果,有效降低了成本,是脂肽抗生素分离提取的发展方向。
随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白。昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统。利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白。以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍。
